全 文 ：裂褶菌菌丝体与胞外多糖发酵条件研究
郝利民 ` , 5 , 孙金旭 2 , 邢新会 ’ , 李
l (清华大学化学工程系 , j匕京 , 10 0 0 84 )
政3 , 贾仕儒` ,穆 军 5 , 周国泰 5
2 (衡水学院生物系 , 河北衡水 , 0 5 5 0 0 0 )
3 (北京化工大学生命科学与技术学院 ,北京 , 10 0 0 29 ) 4( 天津科技大学生物工程学院 , 天津 3。。2 22 )
5( 总后勤部军需装备研究所 , 北京 , 10 01 0)
摘 要 在 了 I 发酵罐上进行 了裂褶菌发酵生产菌丝体和胞外多糖的研 究 , 采用 L g (川 )正 交试验对发酵条件进
行了优化 。 在 7 L 发酵罐上裂褶菌的适 宜培养条件为 : 搅拌转速 20 r/ m in 、接种量 l() % ( v / V ) 、通气量 20 o L /
h
, 在此条件下发酵 12 o h , 获得的菌丝体和胞外多糖产量最高 , 分别为 16 . 23 9 / L 和 1 . 68 9 I/ 。 相关性分 析表
明 , 裂褶菌菌丝体产量与胞外多糖 产量之 间存在线性关系 。
关键词 裂褶菌 , 胞外多糖 , 菌丝体 , 相关性
裂褶菌 ( S ,.h iz 。 Ph刃 lu m 。 o m阴 u n。 )是一种药食
两用菌 , 属于担子纲 ,伞菌目 , 裂褶菌科 , 裂褶菌属川 。
裂褶菌子实体 (或菌丝体 )含有丰富的免疫性多糖 、蛋
白质 、 生物活性 L 一型氨基酸 、 多种必需氨基酸和微量
元素等 〔2」 ,这些物质分别对心血管和肝 、 肾等多种器
官疾病具有防治作用 ,并具有抗癌 、 抗衰老 、 抗炎症等
功效川 。 裂褶菌胞外多糖 ( 又称裂褶菌素 )是从裂褶
菌发酵液中提取的一种水溶性 汗D 一葡聚糖 , 它具有
免疫调节 、抗肿瘤 、 抗辐射等功效川 。 临床用作免疫
治疗剂 ,用于肺癌和胃癌的治疗 , 是一种很好的生物
应答效应物 LS三 。 笔者的前期研究表明 , 以胞外多糖为
主要成分的裂褶菌发酵液具有显著的抗缺氧仁6口和抗
疲劳功能叫 。
在人工栽培过程中 ,裂褶菌易受多种环境因素和
病虫害的影响而减产或绝产 。 进行 裂褶菌深层培养
技术研究 ,有利于实现其规模化生产 。 研究人员在前
期摇瓶培养研究过程 中发现 , 搅拌转速 、 接种量和通
气量是影响裂褶菌菌丝体及胞外多糖产量的主要因
素 。 在此研究基础上 ,本文在 7 I J 发酵罐上以裂褶菌
菌丝体和胞外多糖 为 目标产物对其发酵培养条件进
行了优化研究 。
1 材料与方法
1
.
1 菌 种
裂褶 菌 ( S e h i z o p h y l l u m e o m m u n e ) 5 1 , 总后 勤
部军需装备研究所与清华大学联合保藏 。
1
.
2 培养基
( 1) 斜面培养基 : P D A 培养基 。
第一作者 : 博士 , 高级工程师 。
收稿日期 : 2 0 0 7一 0 7一 1 0 ,改 回 日期 : 20 0 7一 2 1一 12
( 2) 液体种子培养基 : 葡萄糖 30 9 I/ J , 酵母膏 2
g / I
、 ,
K H
Z
P ( )
4
1 9 / L
,
M g S O
4 ·
7 H
:
0 0
.
5 9 / L
,
1 2 l oC
灭菌 2 0 m i n ,得到的培养基 p H 为 5 . 5 。
( 3 )发酵培养基 : 1 2。麦芽汁 ( m / m ) , N H 4 C I 5 9 /
L
,
1 2 l oC 灭菌 2 0 m i n 。 得 flJ 的培养基 p H 为 6 . 0 。
1
.
3 裂褶菌培养方法
( l) 斜面培养 : 转接 1 c m Z 带菌丝斜面培养基于
P D A 试管斜面上 ,在 2 6℃下培养 6 d 。
(2 ) 种子培养 : 从试管斜面上切取 1 c m Z 带菌丝
斜 面培养基转接至装有 1 50 m 工创 液体培养的 50 0 m L
三角瓶中 , 于 2 6 oC 、 1 5 () : / m i n 培养 3 d 。
(3 )发酵罐分批培养 : 发酵罐容积 7 L , 培养基装
液量 4 . S L , 接种量 5% 一巧 % , 通气量 10 。~ 2 0 L /
h
,搅拌转速 1 0 0 一 3 0 0 : / m i n , p H 不控制 , 培养温度
2 6 oC
, 发酵周期 5一 6 d 。
1
.
4 分析方法
( 1 )菌体量测定 :取 10 0 m l , 发酵液 , 3 o OO r / m i n
离心 10 m in ,弃上清液 ;水洗菌体 ,反复 2 次 ,收集菌
体 ,于 60 ℃烘干至恒重 。
( 2) 裂褶菌胞外多糖测定 : 取发 酵液 1 0 m L , 在
3 5 0 0 : / m i n 下离心 1 5 m i n , 取上清液 ;用 2 倍体积的
9 5%乙 醇沉淀 , 过夜后获粗多糖 ;采用 75 % 乙醇洗
涤粗多糖至无还原糖 , 于 60 ℃烘干至恒重 。
( 3) 还原糖测定 : D N S 法 ( 3 , 5一二硝 基水杨酸 比
色法 ) 厂8 〕 。
1
.
5 裂褶菌胞外多糖和菌丝体生产发酵条件研究正
交试验
选取 L 。 ( 3 4 )正交表 , 以搅拌转速 、 接种量 和通气
量作为考察因素 ,实验 设计见表 1 。
1 0 } 20 0 8 V o l
.
34 N o 门 ( To t a I 2 4 , )
DOI : 10. 13995 /j . cnki . 11 -1802 /ts . 2008. 01. 008
百睡趁璐男
表 1正交试验因素与水平
水 平 搅拌转速
因 素
接种量
/ r
·
m i n一 l/%
通气量
/ L
.
h一 1
10 10 500 1
20 0
0 30
150
200
2结果与讨论
在实验室前期的摇瓶培养单因素实验中发现 ,
搅拌转速 、接种量和通气量是影响裂褶菌生长和胞外
多糖生产的主要因素 , 因此文中选择上述 3 因素为发
酵程中的主要考察控制指标 。
2
.
1 裂褶菌菌丝体产组正交试验结果分析
裂褶菌菌丝体生产的正交试验结果和分析结果
见表 2 和表 3 。
由表 2 和表 3 结果可知 ,搅拌转速对菌丝体生长
的影响显著 。 由尺: > R 3 > R : 结果可知 , 3 因素的影
响顺序为 : 搅拌转速 > 通 气量 > 接种量 。 由 m ax {
m , ;
,
m 2 1
,
m 3立 }一 m Z , , m a x { m ] 3 , m 2 3 , m 3 3 } = m 3 : , m a x {
m
l : , m Z:
,
m 3: } = m
Z : 结果可 知 , 在搅拌转速 ZOO r /
m in
、接种量 10 %和通气量 20 L / h 条件下发酵 1 2 0
h
, 菌丝体 (干重 )最高产量 可达到 16 . 23 9 / L 。 在此
发酵条件下 , 进行了 3 批重 复验证实验 , 菌丝体 (干
重 )的平均产量为 16 . 87 9 / L 。 本发酵实验的适宜搅
拌转速为 2 0 r /m in( 非最大搅拌转速 ) 的主要原 因 ,
可能是搅拌转速过大则剪切力大 , 影响菌体生产 ; 而
搅拌转速太低则会影响发酵过程中的供氧和传质 。
八曰ùa, .1, ,人
表 2 以裂褶菌菌丝体为目标产物的正交试验结果分析
试验号 搅拌转速
水 平
接种量 通气量 误 差
菌丝体干重 ( X )
/ g
·
L一 1
1 1 1
_
1 1 X I = 13
.
2 0
2
2
2
3
3
3
M 1 1 = 4 0
.
8 0
M : x = 4 5
.
4 8
M 3 1 = 3 9
.
2 7
m 11 一 1 3 . 6 0 0
m Zi = 15
.
16 0
m 3 1 = 13
.
0 9 0
R l 一 6 2 1
5 1 = 6
.
9 8 0 0 0
2
3
M
一2 = 4 0
.
9 0
M 2 2 = 4 2
.
6 5
M 3 2 = 4 2
.
0 0
m 12 之 1 3 . 6 3 3
舰 22 = 1 4 . 2 1 7
m 32 一 1 4 . 00 0
R Z一 1 . 7 5
5 2 = 0
.
7 3 2 7 2
2
M 13 = 4 1
.
2 3
M 23 = 4 0
.
4 3
M 3 3二 4 3 . 8 9
切 13 = 13 . 7 4 3
m Z J 一 1 3 , 4 7 7
m 33 = 1 4
.
6 3 0
R 3 = 2
.
6 6
5 3 = 2
.
1 8 6 9 4
M 1 4 = 4 2
.
2 2
峡 ; 一 4 2 . 08
M
3。 = 4 1
.
2 5
m 14 = 14
,
0 7 3
m Z , = 1 4
.
0 2 7
m 3
;
= 1 3
.
7 50
R 4 = 0
.
9 7
5
4
= 0
.
1 8 3 1 8
X Z = 1 3
.
4 7
X 3 = 14
.
13
X 4二 14 . 1 7
X : = 16
.
2 3
X 6 = 15
.
0 8
X 7 = 13
.
5 3
X 。 = 12
.
9 5
X , 二 12 7 9
T 二 12 5 . 5 6
X平均 = 1 3 . 9 5 1
23465759叭峡嶙构
S T = 10
.
7 3 6 72
脚川RS
表 3 影响裂褶菌菌丝体产 t 正交试验各因素显著性分析
方 差来源
搅拌转速
自由度 f 均方差 S 平均 显著性
接种量
通气量
误 差
平方和 S
6
.
9 8 0 0 0
0
.
7 32 7 2
2
.
8 4 0 8 2
0
.
18 3 1 8
3
.
4 9 0 0 0
0
.
3 6 6 3 6
1
.
4 2 0 4 1
0
.
0 9 1 5 9
F 值
3 8
.
10
4
.
0 0
1 5
.
5 1
注 : 查 F 分布表得 F o . 9 5 ( 2 , 2 ) 一 1 9 . o o F o . 9 9 ( 2 , 2 ) = 9 1 . 0 1。
2
.
2 裂褶菌胞外多糖产里正交试验结果分析
裂褶菌胞外多糖生产 的正交试验结果和分析结
果见表 4 和表 5 。
由表 4 和表 5 结果可知 , 3 因素对胞外多糖产量
均无显著影响 , 由 R , > R 3 > 尺 2 结果 可知 , 在本试验
中 3 因素的相对影响顺序为 : 搅拌转速 > 通气量 > 接
种量 。 由 m a x { m l , , m 2 1 , m 3: } = m Z; , m a x { m l 3 , m 2 3 ,
m 3 3 }一 m 3 3 , m a x { m 1 2 , m 2 2 , m 3 2 }一 m : 2结果可知 , 在搅
拌转速 20 O r / m in 、 接种量 10 %和通气量 2 0 L / h 条
件下发酵 1 20 h , 胞外多糖最高产量可 达到 1 . 68 9 /
I
J 。 在此发酵条件下进行的 3 批重复验证实验中 ,胞
外多糖的平均产量为 1 . 7 9 / L 。
2 0 0 8 年第 3 4 卷第 1 期 (总第 2 4 , 期 ) 1 1 1
表 4以裂褶菌胞外多糖为目标产物的正交试验结果分析
试验号 搅拌转速
水 平
接种量 通气量 误 差
1
l
l
2
2
2
3
3
3
M 1 14 =
.
1 1
M2 1“ 4 . 3 6
M月 1一 4 . 10
m飞 l二 1.3 7 3
mZ I二 1.54 3
m 3 1二 1.3 67
R I =0
.
5 3
5 1=0
.
0 5 992
2
3
l
2
3
l
2
3
M2 1=4
.
7 1
Mz z =4
.
3 7
MZ o 4 =
.
2 9
m2 1= 1
.
0 3 9
mZ z = 1
.
4 57
m 32一 1.4 30
R Z =0
.
2 0
52 =0
.
0 0 8 4 6
1
2
3
2
3
1
3
1
2
M 3 1一 4 . 15
M2 3 =4
.
13
M 3一 4 .5 6
m 3 1一 1. 38 3
m2 3一 1. 3 7 7
m 3 3一 1. 52 0
R 3一 0 .4 3
S: =0
.
0 3 92 6
2
3
3
l
2
2
3
l
MI」 =4
.
32
MZ、 一 4 . 1 9
M
4一 4 .2 3
m一 *二 1.0 4 4
,矛了 一 1 3 9 7
m l 二 1 . 4 4 0
R
I “ 0 . 1 3
S 。 二 0 . 0 3 7 2
胞外多糖 ( Y )
/ g
·
[
一
,
Y I = 1
.
3 1
Y
。
= 1
.
3 3
y 3一 1 . 4 8
Y 一 1 . 4 7
Y : = 1
.
68
Y 。 = 1
.
4 8
丫7一 1 . 4 0
Y , 一 1 . 3 7
Y g = 1
.
3 4
T = 1 2
.
8 4
Y平均一 1 . 4 2 7
飞土Q伪`j
月任亡」
心U一了
00OJ
S 于 = 0
.
1 4 3 2 2
lM从lnI柳m3IRfS
表 5
平方和 S
0
.
0 5 9 9 2
0
.
0 0 6 8 4
0
.
0 3 9 2 6
0
.
0 0 3 7 2
影响裂褶菌胞外多糖产 t 正交试验各因素显著性分析
方差来源
搅拌转速
自由度 f 均方差 S平均
接种量
通气量
误 差
0
.
0 2 9 9 6
0
.
0 0 3 4 2
0
.
0 1 9 6 3
0
.
0 0 1 8 6
F 值
16
.
1 1
1
.
8 4
10
.
5 5
显著性
弓`9口
勺乙9é
注 : 查 F 分布表得 F 〕 。 : ( 2 , 2 ) ~ 1 9 . o o F 〕 。 。 ( 2 , 2 ) = 9 1 . 0 1 。
2
.
3 裂褶菌菌体产 t 与胞外 多糖产 t 相关分析研究
为了简化以裂褶菌胞外多糖为主要 目标产物的
发酵过程控制 ,对上述 9 个批次 7 L 发酵罐上裂褶菌
菌丝体产量和胞外多糖产量的试验数据进行 了相关
分析研究川 。
表 6 裂褶菌菌丝体产 t 与胞外多糖产 t 的相关性分析研究
测试指标 发酵批次与测试结果
1 2 3 4 5 6 7 8 92 3 4 5 6 7 8 9
菌丝体产量 ( x ) / g · l 一 ,
胞外多糖产量 ( Y ) / g · I 一 ’
13
.
20
1
.
3 1
13
.
4 7
l
。
3 3
1 4
.
1 3
1
.
4 8
14 17
1
.
4 7
16 2 3
1
.
6 8
1 5
.
0 8
1
.
4 8
1 3 5 3
1
.
40
1 2 9 5
1
.
3 7
1 2
.
7 9
1
.
3 4
假设 2个变量菌丝体产量 ( X ) 与胞外多糖产量
( Y )间无线性关系 ,则线性 回归的显著性检验化为检
验 : H 。 : b一 O
经计算 , 工 = 13 . % ; y 一 1 . 43 ; 乙二 一 9 . 8 7 1 ; 临 -
又 , 、 - }三耳一 /擎竺犁落。 0 . 。 4 : 9
/ n 一 乙 / 气刀 一 乙 ) l ,」
t 一
占一 b0
S
左万一 2 2 . 3 8 0 7
0
.
1 1 0 ; 1
.。 = 0
.
9 5 9
`一扮一 。· 0 9 7 ; &一歹一` ; 一 。· 。 7 7
:
. 回归方程为` 一 0 . 0 7 + 0 . 0 97
且有 r - l
, 、
万万瓜 = 0
.
9 3 7 4
F一 (一 2 )舀 一 5。· 7 4 ` 。
F > F
:
. 。 9
( 1
,
7 ) = 5
.
5 9
:
. 回归效果非常显著 。
对 a = 0 . 0 5 , 自由度 n = 9 , 查 表 t ( , 一 a ) ( n 一 2 ) =
r o
. 。 5
( 7 ) ~ 1
.
8 9 5 0
’ . ’
t = 3
.
13 8 0 > 1
.
8 9 5 0 = t
( l
一 。 )
( n 一 2 )
:
. 原假设不成立 ,说明裂褶菌菌体产量与其胞外
多糖产量呈线性关系 。
通过检验法和检验法检 验 , 拒绝 H 。 , b 一 b。 , 可 以认
为 b < 1 , 即回归效果显著 , 说明菌体产量 X 与胞外多
糖产量 Y 呈线性相关关系 。
通过 F 检验法和 t 检验法 的检验 , 可 以认为 , 裂
褶菌菌丝体产量与胞外多糖产量之间存在线性关系 。
裂褶菌菌丝体产量 与胞外多糖产量呈 正相关性
1 2 } 2 0 08 V o l
.
34 N o l ( To ta { 2 4傀)
y = ( )
.
( 卜36 x + 1 2铭9
R七( ) . 73 3
. 璐慈璐翔
产量均无显著性影响 。 以菌丝体和胞外多糖为目标
产物 , 裂褶菌 7 1一 发酵罐培养的适宜工艺条件为 : 搅
拌转速 Z o o r / m i n 、 接种量 1 0 % 、 通气量 Zo o L / h , 在
此条件下发酵 1 20 h , 胞外多糖产量达最大值 1 . 68
g / I
J ,菌丝体产量达最大值 16 . 23 9 / L 。 相关性分析
结果表明 , 裂褶菌菌丝体产量 ( X )与胞外多糖产量
( Y )之间呈线性相关关系 , 回归方程 Y 一 0 . O36 X +
1
.
2 4 8 9
。
62841臼一0110.卜`·匈妙恢逛姚占今纂
12刃 9 13 . 2 13 . 5 3 14」7 1 ( ,卫:飞
菌体量龟 · L一 ,
~
胞外多糖— 线性 (胞外多糖 )
图 l 裂褶菌菌体产量与胞外多糖产量的线性关系
的结果 , 与 2 种 目标产物达最大产量时的发酵工艺条
件相同 (搅拌转速 20 r/ m in 、 接种量 10 % 、 通 气量
20 O L / h) 的实验结果有着内在的一致性 。
在本发酵条件下 , 裂褶菌菌体量确定时 , 胞外多
糖产量在一个可预计范围内 , 即裂褶菌菌丝体产量
( X )确定后 ,通过方程 Y一 0 . 03 6X + 1 . 24 8 9 ,可 以计
算出其胞外多糖产量 ( Y ) 的大致范 围 。 这有助于简
化以裂褶菌胞外多糖为目标产物的发酵过程控制 。
参 考 文 献
3 结 论
通过在 7 L 发酵罐上进行的对影响裂褶菌菌丝
体产量和胞外多糖产量的 3 个 因素的 L 。 (3 4 )正交实
验表明 ,搅拌转速 、 接种量和通气量对裂褶菌菌丝体
产量和胞外多糖产量的影响程度不同 。 其中 ,搅拌转
速对裂褶菌菌丝体产量有显著性影响 ,对胞外多糖产
量无显著性影响 ; 通气量对菌丝体产量和胞外多糖产
量均无显著性影响 ;接种量对菌丝体产量和胞外多糖
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S t e i n e r W
,
L
a f f e r t y R M
.
S t u d i e s o n a W i ld
s t r a in o f
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t i
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H a o L im i n
` , 5 , S u n J i n x u
Z , X i n g X i n h u i
` , L i Z h e n g 3 ,
J i a S h i
r u ` ,
M
u
J u n
s , Z h o u G u o t a i
s
1 ( D
e p a r t m e n t o f C h e m i e a l E n g in e e r in g
,
T s in g h u a U n iv e r s i t y
,
B
e
ii i
n g 1 0 0 0 84
,
C h in a )
2 ( D
e p a r t m
e n t o f B io lo g y
,
H e n g s h u i C o l le g e
,
H e b e i 0 5 3 0 0 0
,
C h in a )
3 ( C o ll e g e o f l
矛
if e S e ie n e e a n d T e e h n o lo g y
,
B e ij i
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n iv e r s i t y o f C h
e m ie a l a n d T e e h n o l o g y
,
B
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n g 1 0 0 0 2 9
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C h in a )
4 ( C
o lle g e o f B io t e e h n o lo g y
,
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n U n i v e r s i t y o f S e ie n e e a n d T e e h n o lo g y
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n 3 0 0 2 2 2
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C h in a )
5 ( T h e Q
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u ip m e n t I n s t i t u t e o f T h e G L D o f P I
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B
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n g 1 0 0 0 1 0
,
C h i n a )
A B S T R A C T S e h i z o P h夕 l l u m c o m m u n e 15 a k i n d o f e d ib l e a n d m e d i e i n a l f u n g i , w h ie h e o n t a in s d i f f e r e n t k i n d s
o f b i o 一 a e t i v e e o n s t i t u e n t s , s u e h a s p o l y s a e e h a r id e s . I n o r d e r t o r e a e h a h i g h e r p r o d u e t i v i t y l e v e l o f m y e e l i u m
a n d e x o p o ly s a e e h a r id e
,
L 9 3 4 o r t h o g o n a l e x p e r im e n t s o n f e r m e n t a t i o n w i t h S c h i z o P h夕l l u m c o m m u n e w e r e
e a r r i e d o u t i n 7 I
J
f e r m e n t o r
.
T h e r e s u l t s i n d i e a t e d t h a t t h e o p t im a l e o n d i t i o n s f o r m y e e l i u m a n d e x o p o l y s a e
-
e h a r i d e p r o d u e t i o n a r e
: a g i t a t io n r a t e Zo o r / m i n
,
i n o 。 u l u m s i z e 10 % ; a n d a e r a t i o n r a t e o f Zo o L / h
.
U n d e r
t h e o p t im iz e d e o n d i t i o n s
,
t h e m y e e l i u m a n d e x o p o ly s a e e h a r id e e o n e e n t r a t i o n s r e a e h e d 1 6
.
2 3 9 / L a n d 1
.
68 9 /
L
, r e s p e e t i v e ly
, a f t e r 1 2 0 h f e r m e n t a t io n
.
B a s e d o n t h e a n a l y s i s o f t h e f e r m e n t a t i o n r e s u l t s f o r 9 r u n s
,
i t
e o u l d b e e o n e l u d e d t h a t t h e e x o p o l y s a e e h a r id e p r o d u e t i o n 15 e o r r e la t e d w i t h t h e m y e e l i u m p r o d u e t io n
.
K e y w o r d s S
e h i z o Ph少 l l u m e o m m u n e , e x o p o l y s a e e h a r id e , m y e e li u m , e o r r e l a t i o n一 } , ,