全 文 ：Central South Pharmacy. September 2013, Vol. 11 No. 9　中南药学 2013 年 9 月 第 11 卷 第 9 期
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作者简介：彭应枝，女，硕士研究生，主要从事中药分离分析研究，Tel：18711091248，E-mail：262741733@qq.com * 通讯作者：刘韶，
男，副教授，博士后，主要从事分离、分析科学新技术的开发与应用研究，Tel：13723873434，E-mail：liushao999@hotmail.com
表 5 样品亚铁及总铁含量测定结果
Tab 5 Content determination of iron ( Ⅱ ) and total iron
赭石
（Ruddle）
Fe2＋含量
（content of Fe2＋）
/%
总铁含量（content of total iron）/%
本法
（current
method）
药典法
（pharmacopeia
method）
20101101 4.45 54.95 54.86
20101102 4.73 52.35 52.49
20101103 4.26 55.62 55.38
赭石含有结晶水需进行低温烘干。盐酸羟胺由盐酸与
羟氨反应而成，主要表现羟氨的化学性质。羟氨可看作氨
分子内一个氢原子被羟基取代的衍生物，在分析化学中主要
做还原剂。在碱性介质中为强还原剂。由于本身被氧化为
N2、N2O、NO 等气体，所以不会给反应体系带入杂质。反
应方程式为：2Fe3＋＋ 2NHOH·HCl＝ 2Fe2＋＋ N2＋4H＋＋
2H2O＋ Cl－。
显色对溶液的 pH 应为 2～ 9，若酸度过高（pH＜ 2），
显色缓慢而色浅。故本试验选择的显色条件为 pH＝ 4.5，使
用 HAC-NaAC 缓冲液。Bi3＋、Cd 2＋、Hg2＋、Ag＋、Zn2＋离
子与显色剂生成沉淀，Co2＋、Ni2＋离子则形成有色络合物，
因此当这些离子共存时应注意它们的干扰作用。

参考文献
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（收稿日期： 2013-04-10； 修回日期： 2013-05-29）
反相高效液相法测定甜叶菊中莱鲍迪苷 A 和
甜菊糖苷的含量
彭应枝 1，2，周芳 1，2，董界 1，2，何文艳 3，刘韶 1，2* （1. 中南大学湘雅医院药剂科，长沙 410008；2. 中南大学药学院，
长沙 410013；3. 桂林医学院，桂林 541004）
摘要：目的　建立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定甜叶菊中莱鲍迪苷 A（RA）和甜菊糖苷（ST）的含量。
方法　采用 Welch Materials XB-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈 -10 mmol • L － 1 磷酸酸钠缓冲液
（pH＝ 2.67，35 ：65，v/v）为流动相，流速 0.7 mL • min － 1，检测波长 210 nm，柱温 30 ℃，进样量 5 μL。
结果　以外标法定量，RA 和 ST 均在 0.25～ 2.50 mg • mL － 1 与峰面积线性关系良好， r＞ 0.999 5。RA 回收
率为 100.3%，RSD 为 2.3%（n ＝ 6），ST 回收率为 101.0%，RSD 为 2.5%（n ＝ 6）。结论　本方法快捷、准确、
可靠，易操作，可用于甜叶菊及相关产品中 RA 和 ST 含量测定。
关键词：甜菊叶；甜菊糖苷；莱鲍迪苷 A；反相高效液相色谱法
中图分类号：R917　　　　文献标识码：A　　　　文章编号：1672-2981(2013)09-0700-03
doi:10.7539/j.issn. 1672-2981.2013.09.018
Determination of rebaudioside A and stevioside in leaves of
Stevia rebaudiana by RP-HPLC
PENG Ying-zhi1,2, ZHOU Fang1,2, DONG Jie 1,2, HE Wen-yan3, LIU Shao1,2* (1. Xiangya Hospital, Central South Univer-
sity, Changsha 410008; 2. School of Pharmaceutical Sciences, Central South University, Changsha 410013; 3. Gui-
lin Medical University, Guilin 541004)
Abstract: Objective To establish a method for the determination of rebaudioside A (RA) and stevioside (ST) in leaves of
中南药学 2013 年 9 月 第 11 卷 第 9 期　Central South Pharmacy. September 2013, Vol. 11 No. 9
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Stevia rebaudiana by RP-HPLC. Methods The chromatographic separation was used with a Welch Materials Cl8 column
(4.6 mm×250 mm, 5 μm). The mobile phase was composed of acetonitrile and 10 mmol • L － 1 phosphate sodium ac-
etate buffer (35 ：65, v/v, the pH adjusted to 2.67 with phosphoric acid), the fl ow rate was 0.7 mL • min － 1and the detection
wavelength was set at 210 nm. The sample injection volume was 5 μL and the temperature of column was 30 ℃ . Results
Both RA and ST showed a good linear relationship (r＞ 0.999 5) at 0.25－ 2.50 mg • mL － 1 and the recovery of RA and ST
was 100.3% and 100.7%, respectively. Conclusion RP-HPLC method is simple, sensitive and reliable for the determination
of RA and ST in stevia rebaudiana and related products.
Key words: Stevia rebaudiana; stevioside; rebaudioside A; RP-HPLC
甜叶菊（Stevia rebaudiana）为菊科多年生草本植物，
其叶中所含甜菊糖苷达 32 种，其中莱鲍迪苷 A （rebaudioside
A，RA）和甜菊糖苷（stevioside，ST）占总糖苷的 90% 左
右。ST 的甜度为蔗糖 300 倍，稍有苦涩余味，RA 甜度为蔗
糖的 450 倍，无后苦味，甜味近似于蔗糖，热值仅为蔗糖的
1/300[1]，可作为一种理想的天然甜味剂广泛地应用到食品、
饮料领域，尤其是供给糖尿病患者和肥胖者的食品 [2]，并已
取代一些人工合成的甜味剂 [3]。由于甜菊糖苷作为新型甜味
剂逐渐被人们所熟悉，其应用范围正逐渐扩大，因此有必要
建立准确、方便的测定方法，以满足药品、食品等监管的要
求。目前，对于 ST 和 RA 2 种主要成分的分析多采用高效
液相色谱 NH2 柱法 [4-5]，但该法重现性差，色谱柱使用寿命短、
成本高 [6]。本试验采用 C18 柱高效液相色谱法对甜菊叶中 2
种主要成分 RA 和 ST 进行定量分析，具有灵敏度高，成本低，
快捷等优点。
1 仪器与试药
1.1 仪器
液相色谱仪 Agilent-1100（美国安捷伦科技有限公司），
BIS210S 型 1/1 万电子分析天平（德国 Sartorius 公司），pH
计 pHS-3c 型（上海盛磁仪器有限公司），恒温水浴锅（余
姚市亚星仪器仪表有限公司），FW177 中草药粉碎机（天津
泰斯特仪器有限公司）。
1.2 试药
RA 对照品（自制，经 HPLC 法测定其纯度≥ 98%），
ST 对照品（自制，经 HPLC 法测定其纯度≥ 98%），乙腈
为色谱纯，水为纯化水，磷酸氢二钠、磷酸为分析纯。
1.3 药材
甜菊叶样品于 2012 年 9 月分别购买于江苏省盐城市东
台市（守田三号）、江西省赣州、安徽省蚌埠市（润德一号、
惠农二号）以及于 2012 年 8 月采自江西省赣州（嫩绿叶和
灰绿叶），所有样品经中南大学湘雅医院药剂科刘韶副教授
鉴定为菊科多年生草本植物甜叶菊（Stevia rebaudiana）。
2 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 系列标准溶液 准确称取 RA 对照品 0.125 5 g 于 25
mL 容量瓶中，加乙腈 - 水（35 ：65）约 20 mL，加热超声
溶解，冷却至室温后定容至刻度，摇匀，得到浓度为 5.020
mg • mL－ 1 RA 对照品储备溶液，分别取 5、4、3、2、1、0.5
mL 的 5.020 mg • mL－1储备液分别置于 10 mL 的容量瓶中，
定容，得到 2.510、2.008、1.506、1.004、0.502、0.251 mg •
mL－1的 RA 系列标准溶液，同样的方法制备了浓度为 2.500、
2.000、1.500、1.000、0.500、0.250 mg • mL－ 1 的 ST 系列标
准溶液。
0 2 4 6 8 10
t/min
2
1
0 2 4 6 8 10
t/min
2
1
图 1 甜叶菊的 RP-HPLC 色谱图
Fig 1 RP-HPLC chromatogram of Stevia rebaudiana
A. 对照品（control of RA and ST）； B. 样品（sample）；1. 莱鲍迪苷
A （ RA）；2. 甜菊糖苷（ST）
2.1.2 对照品溶液的配制 分别准确量取“2.1.1”项下 2.008
mg • mL－ 1 RA 标准溶液和 2.000 mg • mL－ 1 的 ST 标准溶液
4 mL 于同一 10 mL 的容量瓶中，定容，得到 RA：0.803 2
mg • mL－ 1，ST：0.800 0 mg • mL－ 1 的混合对照品溶液。
2.1.3 供试样品溶液的制备 取各地甜菊叶粉碎后的粉末
原料约 0.25 g置于 100 mL圆底烧瓶，加 20 mL乙腈 - 水
（35 ：65），沸水浴回流 1 h，放置室温后离心，取上清液
于 25 mL 容量瓶中，沉淀用 1～ 2 mL 乙腈 - 水（35 ：65）
洗涤 2 次，离心，将 2 次上清液合并到容量瓶中定容，摇匀，
0.45 μm 的微孔滤膜过滤，供液相色谱进行 RA 和 ST 含量测
定分析。
2.2 色谱条件
色谱柱：Welch Materials XB-C18（250 mm×4.6 mm，5
μm）；流动相 ：10 mmol • L－1磷酸酸钠缓冲液（pH ＝ 2.67）-
乙腈（65 ：35，v/v）；柱温：30 ℃；流速：0.7 mL • min－1；
进样量：5 μL；检测波长 210 nm。对照品及样品色谱图分别
见图 1。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液，按“2.2”
项下色谱条件重复进样 5 次，分别测得峰面积，按照外标法
定量，计算 RA 和 ST 峰面积 RSD 分别为 1.0% 和 0.96%，
表明仪器精密度良好。
2.3.2 稳定性试验 取“2.1.3”项下供试品溶液分别于 0、4、
8、12、16、20、24 h 进样分析，分别测得峰面积，按照外
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表 2 样品测定结果
Tab 2 Sample content determination
样品
（sample）
RA 含量
（RA content）/%
ST 含量
（ST content）/%
守田三号（江苏） 10.81 1.76
江西 1 14.41 1.55
江西 2（嫩绿叶） 13.75 1.21
江西 3（灰绿叶） 13.86 1.39
润德一号（安徽 1） 12.32 3.69
惠农二号（安徽 2） 13.23 1.90
表 1 回收试验结果 (n ＝ 6)
Tab 1 Recovery of RA and ST (n ＝ 6)
成分
（component）
取样量
（sample weight）
/ mg）
样品中含量
（sample content）
/ mg
添加量
（added content）
/ mg
测得量
（detected amount）
/ mg
回收率
（recovery）
/ %
平均回收率
（average recovery）
/ %
RSD
/%
RA 0.250 2 22.52 22.60 45.08 98.8
0.250 0 22.46 22.50 45.60 102.8
0.250 0 22.48 22.63 45.52 101.8
0.250 4 22.52 22.58 44.83 98.8 100.3 2.3
0.250 1 22.50 22.50 45.55 102.4
0.250 2 22.48 22.51 44.39 97.3
ST 0.250 2 6.46 6.49 12.80 97.7
0.250 0 6.50 6.51 13.22 103.2
0.250 0 6.52 6.49 12.87 97.8 101.0 2.5
0.250 4 6.47 6.50 13.09 101.9
0.250 1 6.48 6.48 13.13 102.6
0.250 2 6.47 6.46 13.30 102.9
标法定量，计算 RA 和 ST 峰面积 RSD 分别为 1.5% 和 0.97%，
表明样品在 24 h 内稳定。
2.3.3 重复性试验 取同一甜叶菊样品 6 份，按“2.1.3”项
下方法平行操作，分别制备 6 份供试品溶液，进样分析，结
果 RA 和 ST 的峰面积 RSD 均＜ 2.16%，表明该方法重复性
良好。
2.3.4 回收试验 精密称取同一甜叶菊样品 6 份，每份约
0.25 g，加 RA 和 ST 对照品适量，按“2.1.3”项下反复发操
作，分别进样分析，计算回收率，结果见表 1。RA 平均回
收率为 100.3%，RSD 为 2.3%（n＝ 6），ST 平均回收率为
101.0%，RSD 为 2.5%（n＝ 6），说明该方法可行。
2.4 样品含量测定
供试样品溶液分别按“2.2”项下色谱条件进样分析，
测得各批样品中 RA 和 ST 的峰面积，按照外标法定量，测
量结果见表 2。
3 讨论
3.1 色谱柱的选择
本 试 验 比 较 了 Welch Materials XB-Cl8（4.6 mm×250
mm，5 μm） 及 相 关 文 献 报 道 [7] 的 Kromasil- NH2（4.6
mm×250 mm，5 μm） 色 谱 柱 的 分 离 效 果。Kromasil XB-
NH2 （4.6 mm×250 mm，5 μm） 测 得 样 品 中 RA 分 离 分
析时间长，峰展宽，结果表明 Welch Materials XB-Cl8（4.6
mm×250 mm，5 μm）测得 RA 和 ST 对照品及样品中 RA
和 ST 峰形佳，色谱条件稳定，且 RA 分离分析时间大大缩短。
故选择 Welch Materials XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）
色谱柱。
3.2 流动相的考察
本试验所测 RA 与 ST 的最大吸收波长在 210 nm，在该
波长下，甲醇有紫外吸收，所以选乙腈作为流动相。试验发
现乙腈 - 水作为流动相，RA 与 ST 不能分离。用磷酸钠缓冲
液（10 mmol • L － 1 ，pH＝ 2.67）代替纯水，乙腈 - 缓冲液
体积比为 35 ：65 等梯度洗脱能使 RA 和 ST 较好分离。试
验还对乙腈 - 磷酸酸钠缓冲液（10 mmol • L －1）＝ 28 ：72 （v/
v），30 ：70 （v/v），40 ：60（v/v）进行了考察，RA 与
ST 均不能达到基线分离。

参考文献
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(收稿日期： 2013-03-11； 修回日期： 2013-03-30)