全 文 ：文章编号：1007－2624（2014）02－00010－04 doi：10.13570/j.cnki.scc.2014.02.004
甜叶菊甜菊糖苷含量分析用RA和STV
乙醇超声提取体系优化
罗庆云，田 敏，谢越盛，林英英，王康才
（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：为建立一种甜叶菊叶片 RA 和 STV 提取方法，促进甜叶菊种质 RA 和 STV 等甜菊糖苷含量分析用样品制
备体系的优化，基于乙醇超声提取法，采用单因素结合正交设计实验，分析提取用乙醇体积分数、超声提取时间、超
声提取温度等因素对甜菊叶片 RA 和 STV 提取效率的影响，优化各参数，并以现有提取体系为参照，对其优越性进
行了检验。结果表明，本研究建立了一种 RA 和 STV 提取效率较现有体系明显优化的提取方法，具体操作方法为：将
甜叶菊叶片粉末按料液比 1∶20（m:v）加入 50%（v:v）乙醇，室温振荡过夜，40℃下超声提取 60min。
关键词：甜叶菊；甜菊糖苷；提取；优化；RA；STV
中图分类号：566.901 文献标识码：A
甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni），原产于巴拉圭[1]，为菊科多年生草本糖料作物，其叶含 30 多种甜菊糖
苷类组分[2－3]，自 1976年引入以来，我国已成为甜叶菊主产区，甜叶菊叶提取物甜菊糖苷出口量占世界出口总
量 80%[4－5]。 RA（莱鲍迪苷 A，Rebaudioside A）和 STV（甜菊糖苷，Stevioside）为甜叶菊叶片所含两种主要甜菊
糖苷类组分[6－7]，随着美国 FDA和欧盟食品安全局对 RA安全性的认可，欧美市场对“第三代糖源”RA 的需求
量加大[8]，我国及世界各地区高 RA 苷含量、高 RA/STV 甜叶菊新品种的种植面积将进一步扩大[7]。 为适应市
场需求对甜叶菊品种的要求，须大力开展高 RA苷含量和高 RA/STV的甜叶菊新品种选育。
甜叶菊种质 RA和 STV含量检测是甜叶菊新品种选育的依据。 甜叶菊种质 RA和 STV含量的测定包括
提取、分离和检测 3个步骤，其中，叶片所含 RA和 STV的高效提取是后继分离和检测的基础，只有对甜叶菊
叶片所含 RA和 STV进行充分提取，才能对甜叶菊种质甜菊糖苷含量进行准确评估[9-14]。此外，在甜叶菊种质
评估中，由于需要同时处理大量的样品，快速简便样品处理体系的建成显得非常重要。为此，本研究的目的就
是为甜叶菊种质甜菊糖苷含量的检测建立一种快速、简便、高效的 RA 和 STV 提取方法，推动高 RA 苷含量、
高 RA/STV甜叶菊新品种选育。
由于 RA 和 STV 都为具有一定水溶性的化合物，目前有关甜叶菊种质 RA 和 STV 提取的方法都是以溶
剂浸提法为基础发展起来的，所使用的溶剂包括水、甲醇等[10-14]，并通过超声、加热等方式来促进 RA 和 STV
向溶剂传递。 超声助溶乙醇提取法以操作简便、提取效率高、环境污染小而被人们广泛应用于植物化学组分
的分离提取[15-17]，但在甜叶菊 RA和 STV提取分离中的应用还未见报道。 为探讨超声助溶乙醇提取法在甜叶
菊 RA 和 STV 提取分离中的应用，优化现有提取体系，本研究采用单因素结合正交设计实验，对超声助溶乙
醇提取法中提取用乙醇体积分数、超声时间、超声提取水浴温度等因素对 RA和 STV提取效率的影响进行了
联合分析，优化了各提取参数，并以现有提取体系为参照，对本提取方法的优越性进行了检验。
1 材料和方法
1.1 材料处理
1.1.1 材料 研究所用材料为甜叶菊扦插苗鑫农 4号叶片，由安徽宿州群富甜叶菊专业合作社提供，经鉴定
为菊科植物甜叶菊（S. rebaudiana）。
1.1.2 材料的预处理 将所得鑫农 4 号叶片剔除杂质和色泽灰暗者后，80℃烘干，于研钵中研磨充分，过 60
目筛，于干燥器中保存备用。
1.1.3 材料的处理 精确称取 50mg 甜叶菊粉末，加入各体积分数的乙醇 1.0mL，混匀，室温振荡过夜，置相
应水温水浴的 KQ2200E型超声波清洗仪中超声提取相应时间后 10000r/min离心 10min，取上清，重复提取 3
次后合并上清，4℃保存备用。 同时设 3个提取重复。
在 2.3验证对比实验中涉及的前人相关样品处理方法分别参照相应文献方法进行（表 2）。 其中，文献 1
收稿日期：2013-08-30
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金项目“磷酸化修饰对甜叶菊糖基转移酶 UGT76G1 糖基化 Stevioside 形成
Rebaudioside A 的调控机制研究”（20120097120033）。
作者简介：罗庆云（1974-），男，重庆市垫江人，博士，讲师。 研究方向：植物次生代谢生理与遗传。 E-mail: qyluo@njau.edu.cn
中 国 糖 料
Sugar Crops of China
2014 年
第 2 期10
1 RA
STV
R A/STV
为利用甲醇室温超声提取 10min，重复提取 3次合并提取液[10]。文献 2是以水为提取用溶剂室温振荡浸提 2h
后再用正丁醇萃取的方法，重复提取 3次合并提取液[11]。 文献 3是利用水 100℃振荡浸提 30min，重复提取 3
次合并提取液[12]。文献 4是利用 pH为 7.0的 0.01M磷酸缓冲液（钠盐）100℃振荡浸提 5min，重复提取 3次合
并提取液[13]。文献 5是利用 pH为 7.0的 0.01M磷酸缓冲液（钠盐）68℃振荡浸提 32min，重复提取 3次合并提
取液[14]。 各提取液的精制等后续处理参照 Liu[14]等方法进行。
1.2 样品的检测
参照 JECFA （2010）[18]方法检测各样品 RA及 STV含量。 利用 EXCEL（2007）处理各检测数据和制图。
2 结果与分析
2.1 单因素实验
2.1.1 乙醇体积分数对 RA 和 STV 提取效率的影响 图 1 结果显示 RA 和 STV 得率受提取所用乙醇体积
分数的影响较大。 在料液比 1∶20（m:v），室温下超声提取 40min的条件下，随提取所用乙醇体积分数从 0%增
大至 30%，RA 和 STV 得率迅速增大，当提取所用乙醇体积分数为 30%，50%和 70%时，RA 和 STV 得率受所
用乙醇体积分数的影响不明显，当提取所用乙醇体积分数超过 70%时，RA 和 STV 得率下降，当提取所用乙
醇体积分数为 100%时，RA和 STV的得率都降到最低。
1-1
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2 RA STV RA/STV
3 RA STV
RA/STV
罗庆云，等：甜叶菊甜菊糖苷含量分析用 RA 和 STV 乙醇超声提取体系优化第 2 期
同时，图 1结果还显示 RA和 STV得率比例也受提
取所用乙醇体积分数的影响。总的表现为随提取所用乙
醇体积分数的增大而逐渐降低，当提取所用乙醇体积分
数为 100%时，RA 和 STV 的得率比例最低，但是当提取
所用乙醇体积分数为 30%、50%和 70%时，RA 和 STV
的得率比例间差异不显著。
2.1.2 超声提取时间对 RA 和 STV 提取效率的影响
根据实验 2.1.1 的结果，用体积分数为 30%的乙醇以料
液比 1∶20，在室温下超声提取不同时间，以检测超声提
取时间对 RA和 STV得率及其得率比例的影响。
图 2结果显示，超声提取时间对 RA和 STV得率及得率比例的影响不是特别明显，但当超声提取时间小
于 20min时，RA和 STV得率及其得率比例随超声提取时间的延长而增大， 当超声提取时间大于 20min 时，
RA 和 STV 得率及其得率比例受超声提取所用时
间的影响不明显，各处理间差异不显著。
2.1.3 超声提取温度对 RA和 STV 提取效率的影
响 根据实验 2.1.1 和实验 2.1.2 的结果， 用体积
分数为 30%的乙醇以料液比 1∶20， 分别在室温
（25℃）、40℃、60℃和 80℃下超声提取 40min，以检
测超声提取水浴温度对 RA 和 STV 得率及其得率
比例的影响。 图 3结果显示，超声提取水浴温度对
RA和 STV得率及其得率比例的影响不明显，但当
11
料糖国中 年4102
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超声提取水浴温度超过 40℃时，RA 和 STV 得率表现出轻微
的下降；而 RA 和 STV 得率比例受超声提取水浴温度的影响
不明显，各处理间差异不显著。
2.2 正交设计实验
根据实验 2.1.1、实验 2.1.2 和实验 2.1.3 的结果，用正交
设计实验联合分析提取用乙醇体积分数、超声提取水浴温度
和超声提取时间三因素对 RA 和 STV 得率的影响，具体的实
验及分析结果见表 1－1、1-2。 RA 和 STV 得率受提取用乙醇
体积分数、超声提取水浴温度和超声提取时间三因素影响由强到弱的顺序都表现为超声提取时间>提取用乙
醇体积分数>超声提取水浴温度。在上述三因素中，除提取温度对 RA和 STV得率的影响都一样外（最佳提取
温度为 40℃），提取用乙醇体积分数和超声提取时间对 RA和 STV得率的影响不同。
首先，提取用乙醇体积分数对 RA 和 STV 得率影响出现极化现象，即，对 RA 最适合的提取用乙醇体积
分数为 30%，而对 STV 最适合的提取用乙醇体积分数为 70%；而超声提取时间对 RA 和 STV 得率的影响都
表现为适当延长超声提取时间可以提高 RA 和 STV 得率，对 RA 最适合的超声提取时间为 60min，而对 STV
最适合的超声提取时间为 40min。 为实现 RA 和 STV 的充分提取和同步检测，结合表 1 结果，本研究将甜叶
菊叶片 RA和 STV 提取各参数确定为：提取用乙醇体积分数为 50%、超声提取水浴温度为 40℃、超声提取时
间为 60min。
2.3 验证对比实验
为进一步验证实验 2.2 所确定的超声提取各因素组合对 RA 和 STV 得率及得率比例的影响， 本实验在
正交设计实验 2.2的基础上，联合已发表的相关方法对本研究正交设计实验 2.2所确定的 RA 和 STV 提取方
法进行了验证。 表 2的结果表明，与已发表的 5 种方法相比较，实验 2.2 所确定的方法在提高 RA 和 STV 得
率、维持 RA和 STV得率比例参数的稳定性等方面显示出了较好的优越性，可作为准确评估甜叶菊种质叶片
RA和 STV含量及其比例的提取方法。
3 讨论和结论
RA 和 STV 为现有甜叶菊栽培品种叶片中的主要甜菊糖苷类物质，随着市场对 RA 需求量的增加 [11]，须
大力开展高 RA 苷含量和高 RA/STV 含量比值的甜叶菊新品种选育，为促进甜叶菊新品种的选育，有必要建
立一种可用于甜叶菊种质 RA和 STV含量特性分析的快速、简便、高效的 RA和 STV提取方法。 超声助溶乙
醇提取法以其溶媒极性可调、操作简便、提取效率高、环境污染小而被广泛应用于植物化学组分的分离提取
[15-17]，但在甜叶菊 RA和 STV提取分离中还未见报道。为此，本研究对以水和乙醇的混合溶媒在甜叶菊种质评
价时 RA和 STV提取上的应用进行了探讨。
正交设计实验结果表明提取用溶媒极性对 RA 和 STV 得率影响是除提取时间外影响最大的因素 （表
1）。现有的 RA和 STV提取方法都是基于单一溶媒（水或甲醇）而建立的，我们在研究中发现 RA和 STV具有
不同的水溶性，其中 RA 由于其分子结构上具有 3 个葡萄糖基团，其水溶性较 STV 强，而 STV 的脂溶性较强
（未发表资料）。 图 1的结果显示：RA 和 STV 得率在纯水和纯乙醇的情况下远低于使用混合溶媒的情况，这
是目前为止有关混合溶媒在 RA 和 STV 提取上的首次应用报道。 这一结果同时也得到了实验 2.3 中相关研
究结果的印证，表明在甜叶菊种质评价中，与采用纯合试剂作为提取用溶媒相比，较宜利用两极性不同的溶
剂配制适宜比例的混合溶剂来提取。 可以进一步推断的是，由于甜叶菊体内存在的 30 多种甜菊糖苷类化合
物间分子结构和极性差异大，若欲进一步详细评价甜叶菊种质中各甜菊糖苷组分含量，深入评估不同极性混
12
罗庆云，等：甜叶菊甜菊糖苷含量分析用 RA 和 STV 乙醇超声提取体系优化第 2 期
合溶媒在各甜菊糖苷组分提取中的可行性应是一个大的研究方向。
适宜水浴温度可促进溶质向溶媒的扩散，提高超声提取效率，图 3的结果显示，与常温相比较，当水浴温
度为 40℃时，RA和 STV的得率有所提高；但是，当水浴温度高于 40℃时，RA 和 STV 的得率反倒表现出不明
显的轻微下降，这可能是由于过高的提取温度易于引起混合溶媒中乙醇的部分挥发，使提取体系中乙醇随提
取时间的延长而部分减少所致。需要说明的是，为克服这一现象，本研究采用的是密闭体系，但也观察到提取
用试管的局部区域出现液滴，这有可能就是在超声过程中挥发出的乙醇，从而引起与物料实际接触的溶媒中
乙醇量的减少。 当然，由水浴温度所引起的提取体系局部乙醇量轻微减少对 RA和 STV得率影响并不严重，
因为实验 2.2的正交设计分析结果表明提取用水浴温度对 RA 和 STV 的得率的影响在本研究所探讨的 3 个
因素中为最小（表 1），这一结果也为实验 2.1.3 有关超声提取水浴温度对 RA 和 STV 得率及其得率比例影响
不明显的结果所印证（图 3）。
实验 2.3的结果表明，与现有已发表的方法相比较，依照本研究所建立的方法所得 RA 和 STV 得率明显
较高，同时，数据误差小、精确性高（表 2）。 为此，本研究建立了一种在 RA 和 STV 得率等方面明显优于已有
方法，可更充分地提取甜叶菊叶片所含以 RA 和 STV 为代表的甜菊糖苷，为更快速准确评价甜叶菊种质 RA
和 STV含量特性奠定了基础，具有快速、简便、高效等优点，具体的提取方法为：将甜菊叶片粉末按料液比 1∶
20（m:v）加入 50%（v:v）乙醇，室温振荡过夜，40℃下超声提取 60min。
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Optimization of Ultrasonic-assisted Ethanol Extraction of RA and STV
for Analysis of Steviosides Content in Stevia
LUO Qing-yun, TIAN Min, XIE Yue-sheng, LIN Ying-ying, WANG Kang-cai
(College of Horticulture, Agricultural University of Nanjing, Nanjing 210095, China)
Abstract: Method of ultrasonic-assisted ethanol extraction was optimized for establishing a sample preparation
system for RA and STV content analysis in stevia germplasm. Firstly, 3 factors of the ethanol concentration,
extraction time and extraction temperature were optimized by using single factor experiments combined with
orthogonal design experiments, and then the superiority of the established sample preparation system was tested
by compared with 5 the existed preparation systems. Results showed that the newly established system was better
than existed ones in the yields of RA and STV, and the specific operation process for the stevia leaf powder was
added 20 times (m:v) 50% ethanol and oscillated at room temperature overnight, and then ultrasonic extracted
under 40℃ for 60 minutes.
Key words: stevia; stevioside; extraction; optimization; RA; STV
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