全 文 ：2007年第03期
Vol.28,No.03,2007
食品工业科技
木槿叶中混合氨基酸的
提取分离工艺研究
肖 劲,任凤莲*,廖 律
(中南大学化学化工学院,湖南长沙410083)
摘 要:以茚三酮分光光度法所测木槿提取液和洗脱液中混合氨
基酸的含量为考察指标,应用单因素和正交实验设计对
木槿叶中混合氨基酸的提取分离工艺进行了研究和讨
论。结果表明,盐酸与木槿干粉的液料比为25∶1,盐酸浓
度 6mol/L,100℃下回流提取 5h,提取 3次,氨基酸的提
取效果最佳。提取液脱色浓缩后,用732阳离子交换树脂
吸附,吸附6h,用3%氨水洗脱,分离效果最好。氨基酸的
提取率可达16.76%,氨基酸产品得率可达8.9%。
关键词:氨基酸,木槿叶,提取,分离
Abstract:Thesinglefactorexperimentsandorthogonaldesign
havebeenused tooptimizetheextractionand
separationprocessesofaminoacidsfrom Hibiscus
L.leavesbyusingaminoacidcontentsdetermined
withspectrophotometerastheindex.Theresults
shows that the optimum extraction condition
obtainedwasasfolows:theratioofliquidtosolidof
25∶1,hydrochloricacidof6mol/L,temperatureof
100℃,extractiontimeof5handextractiontimesof
3times;theseparationefectwasthebestwhen
absorbedby732positiveionexchangedion6h,
andelutedby3% ammoniasolution.Byusingthis
method,theextractionratecouldreach16.76%and
theyieldrateofaminoacidscouldreach8.9%.
Key words:amino acids;HibiscussyriacusL.;extraction;
separation
中图分类号:TS201.2+4 文献标识码:A
文 章 编 号 :1002-0306(2007)03-0153-05
收稿日期:2006-07-10*通讯联系人
作者简介:肖劲(1981-),在读硕士,主要从事天然产物的提取分离以
及分离检测方面的研究。
木槿(HibiscussyriacusL.),锦葵科木槿属落叶
灌木,产于我国中部,是集药用、食用、观赏、绿化、纤
维原料价值于一身的木本植物。木槿叶的医药作用
在我国早有记载。据《品江精要》载:主肠风,痢后热
渴。据《本草江言》载:能除诸热,滑利能导积滞,善治
赤白积痢,干涩不通,下坠欲解而不解,捣汁和生白
酒温饮。木槿嫩叶可食,做汤味鲜美,也可代茶饮,其
叶中含丰富的营养成分和人体必需的微量元素:蛋
白质、氨基酸、脂肪、粗纤维、糖类和原花青素、钙、
镁、铁、锌,可洗发。迄今为止,对木槿花、叶、籽中化
学活性成分的研究报道不多,而对于其活性成分的
提取分离等研究就更是甚少。本文对木槿叶中的氨
基酸进行了提取分离,以期为开发丰富的木槿资源
提供参考依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器
木槿叶 将采自洞庭湖边的新鲜木槿叶 50℃下
烘干,研磨成粉过2目筛即为原料,于干燥的广口瓶
中保存备用;谷氨酸 生化试剂;氨水、盐酸、无水乙
醇、活性炭、D-果糖、茚三酮、硝酸钾、无水乙醇 均为
分析纯;732阳离子交换树脂。
SHB-3循环水多用真空泵 郑州杜甫仪器厂;
W201恒温水浴锅、R208旋转蒸发器 上海申生科
技有限公司;GL-2型恒温加热磁力搅拌器 郑州
长城科工贸有限公司;800B离心机,D-2型往复式
振荡器。
1.2实验方法
1.2.1混合氨基酸的测定方法 提取条件的比较以茚
三酮显色分光光度法测定的吸光度值以及由吸光度
得出的含量为根据。提取液稀释到一定浓度后,移取
2mL至25mL比色管中,加入1mL茚三酮溶液,沸水
浴加热15min,取出,室温冷却30min以后,加入5mL
KIO3溶液,在分光光度计上,以试剂空白为参比,于
566nm处测定吸光度。
氨基酸提取率为提取液中氨基酸含量与干粉原
料质量的比值,氨基酸产品得率为提取得到的晶体
质量与干粉原料质量的比值。
1.2.2氨基酸的提取与分离 根据国内外关于植物中
游离氨基酸提取的报道,本实验以盐酸为提取剂,用
常用的加热回流方法提取木槿叶中的氨基酸。
称取5g粉末原料于250mL的烧瓶中,加入一定
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DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2007.03.042
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浓度盐酸,一定温度下加热回流数小时,水解完全
后,溶液赶酸,抽滤,滤液中加入活性炭脱色,85℃加
热30min,趁热过滤。
脱色滤液减压浓缩后加入2倍量体积的无水乙
醇,沉淀去除水溶性杂质后,取清液,上柱,吸附数小
时后,用二次蒸馏水洗脱至对茚三酮呈阳性,再用一
定浓度的氨水洗脱至洗脱液对茚三酮呈阴性。收集
洗脱液,减压浓缩至有晶体析出时放入冰箱中过夜,
析出晶体,倾出上层清液继续将其浓缩,析出晶体,
合并两次晶体。
用水溶解晶体,加入少量活性炭,充分搅拌后过
滤,滤液中通 HCl气体至饱和后,放入冰箱中过夜,
析出氨基酸晶体,再将其用无水乙醇洗涤干净,于烘
箱里50℃烘干可得氨基酸晶体。
2结果与分析
2.1木槿叶中氨基酸的提取
2.1.1氨基酸提取单因素实验 在其他条件一致的情
况下,研究不同液料比、提取时间、提取温度、提取次
数、盐酸浓度对提取氨基酸效果的影响,见图1～图5。
由图1～图5可知,随着提取次数和提取温度的
提高,加热回流提取氨基酸的提取效果增强;液料比
25时,提取效率最高,而后随着液料比的增加,提取
效果缓慢减小;回流提取时间在 5h之前,提取效果
随着提取时间的增加而增加,而后有所降低;盐酸浓
度在6mol/L时到达最高,而后又快速下降。根据单因
素条件的研究结果,设置正交实验的水平和因素,进
一步讨论氨基酸的提取工艺。
2.1.2氨基酸提取正交实验 根据单因素实验,设定
正交实验的水平和因素,选用L16(45)正交表,其因素
和水平见表 1。其中:A为提取温度,℃;B为提取时
间,h;C为盐酸浓度,mol/L;D为液料比(v/m);E为提
取次数。其实验结果见表2,方差分析见表3。
2.1.2.1直观分析 各因素的极差 R值如表 2所示,
通过比较R值的大小可以得出,影响氨基酸提取因
素的顺序为:提取次数>提取温度>盐酸浓度>液料
比>提取时间;最佳提取条件为A4B3C3D3E4,但由于提
图4提取温度的影响
0.55
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
提取温度(℃)
A
50 60 70 80 90 100 110
图1液料比的影响
0.52
0.48
0.44
0.40
0.36
0.32
料液比(v/m)
A
10 15 20 25 30 35 40
图2回流时间的影响
0.55
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
时间(h)
A
2 3 4 5 6 7 8
图3盐酸浓度的影响
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
盐酸浓度(mol/L)
A
2 4 6 8 10 12
图5提取次数的影响
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
25
提取次数
A
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
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取次数越多,提取所需的试剂用量和提取时间随之
增加,且木槿叶氨基酸在提取3次后基本提取完全,
出于此考虑,我们选择的最佳条件为A4B3C3D3E3,即
用6mol/L的盐酸,100℃下回流提取5h,液料比25∶1,
提取3次。由于正交表中没有此条件,故另外考察此
条件的提取率,结果发现,提取率为16.76%。
2.1.2.2方差分析 对正交实验结果进一步作方差分
析,结果见表 3。经方差分析得:FA=22.909,FC=
25.944,FE=73.361,它们均大于临界值 F0.05 (3,3)=
9.28,说明A、C、E因素具有显著性差异,表明提取温
度、盐酸浓度和提取次数对木槿叶中氨基酸的提取
有显著性影响,而回流时间和液料比在正交实验设
计的水平之内对提取率的影响较小。
提取次数对木槿叶中氨基酸的提取效果有着最
为显著的影响,这与单因素实验结果相同。在提取过
程中,随着溶剂向木槿干粉的渗透,植物细胞不断被
破坏,蛋白质被水解,而后,经蛋白质水解得到的氨
基酸分子不断向溶剂主体扩散,当细胞内氨基酸的
浓度与溶液中的氨基酸浓度达到动态平衡即氨基酸
在溶液中趋于饱和时,氨基酸分子不再向提取液中
扩散,提取次数加大,即更换提取溶剂后,氨基酸分
子继续扩散,从而达到近乎完全提取的目的。但是,
提取次数越多,所需要的溶剂用量和提取时间也增
加。因此,为使工艺简单,减少盐酸用量,需减少提取
次数,经实验确定,提取次数为3次。
在正交实验中考察提取次数的条件下,提取时
间对提取效果的影响不显著,这与单因素实验现象
不相符,可能是由于一些实验提取次数多,在其提取
时间不多的情况下仍然表现出较好的提取效果,提
取次数的增多也可看成其累积提取时间的增多。
温度越高,分子运动越剧烈,扩散速度越快,且
高温给予了蛋白质水解时肽键断裂需要的能量,故
水解越完全,所以提取稳定对氨基酸的提取效果影
响显著。正交实验结果与单因素实验结果相符。
盐酸浓度对氨基酸提取效果影响显著,其影响
趋势也与单因素实验结果相同。盐酸提供了蛋白质
水解的能量,盐酸的浓度低,蛋白质水解不充分,但
浓酸会造成提取物的破坏,生成副产物,使氨基酸提
取率降低。
料液比小,酸用量少,会引起热传递不良,且起
催化作用的酸少,蛋白质水解率低,使氨基酸提取率
降低;料液比增大,盐酸过多,会加速高酸度下的副
反应,使蛋白质水解生成的氨基酸发生二次反应,所
以氨基酸得率又会降低。
2.2木槿叶氨基酸的分离[2,9,10]
木槿叶的盐酸溶液提取液中,除含有氨基酸外,
还含有一些水溶性的蛋白质、多糖、单糖等,且这些
杂质的存在还会影响氨基酸的结晶,所以需进一步
进行分离和纯化。本实验根据氨基酸的性质和树脂
水平
因素
A B C D E
1 70 3 2 15 1
2 80 4 4 20 2
3 90 5 6 25 3
4 100 6 8 30 4
表1因素与水平表
实验号
因素
提取率(%)
A B C D E
1 1 1 1 1 1 2.14
2 1 2 2 2 2 7.29
3 1 3 3 3 3 10.86
4 1 4 4 4 4 10.75
5 2 1 2 3 4 10.09
6 2 2 1 4 3 7.79
7 2 3 4 1 2 9.23
8 2 4 3 2 1 6.23
9 3 1 3 4 2 9.86
10 3 2 4 3 1 7.55
11 3 3 1 2 4 9.85
12 3 4 2 1 3 10.08
13 4 1 4 2 3 12.59
14 4 2 3 1 4 13.51
15 4 3 2 4 1 7.58
16 4 4 1 3 2 9.05
k1 7.760 8.670 7.208 8.740 5.875
k2 8.335 9.035 8.760 8.990 8.857
k3 9.335 9.380 10.115 9.387 10.330
k4 10.683 9.027 10.030 8.995 11.050
极差 2.923 0.710 2.907 0.647 5.175
表2L16(45)正交表及实验结果分析
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的性质,选用732阳离子树脂对提取液中氨基酸的
分离工艺条件进行研究。
2.2.1732阳离子交换树脂总交换容量的测定 将
21mL732阳离子交换树脂湿法装柱,用5%NaCl溶液
通过树脂,直到流出液为中性,再用蒸馏水洗涤,合
并流出液,以标准 0.5mol/LNaOH滴定流出液至甲基
红终点。结果消耗NaOH共52.5mL,因而总交换容量
为1.25mol/L湿树脂。对于氨基酸来讲,总交换容量
为172.5g氨基酸每升树脂。
2.2.2离子交换树脂对氨基酸吸附的动力学考察和
吸附时间的确定 准确称取已处理好的用来装柱的
树脂 2g,置 250mL具塞磨口三口瓶中,加入脱色醇
沉后的提取液10mL,在室温下于摇床上振荡一段时
间以后,吸取上层液,测定溶液中氨基酸的含量,从
而由树脂对氨基酸的吸附量,考察离子交换树脂对
氨基酸的吸附情况。
q(mg)=(C0-Ce)V
式中:q为吸附量,C0为上柱液氨基酸浓度,Ce
为吸附后氨基酸浓度,V为上柱液体积。
由图6可知,随着时间的增加,树脂对氨基酸的
吸附量明显增加,6h后,吸附达到饱和,因此上柱吸
附时间选为6h。
2.2.3 洗脱剂的选择及洗脱液浓度的确定 用
20mL732阳离子交换树脂湿法装柱,取20mL处理好
的浓缩液上柱,用蒸馏水洗涤后,吸附6h,分别用3%
NH4Cl、NH4Cl-NH3·H2O、NH4Ac、NH4Ac-NH3·H2O、
NH3·H2O五种洗脱剂洗脱,收集洗脱液 100mL,用茚
三酮分光光度法测量吸光度,考察各洗脱剂的洗脱
效果,结果见表4。
由表4可知,NH4Ac-NH3·H2O和 NH4Ac洗脱效
果最好,这是因为当洗脱剂阴离子为弱酸根离子时,
阴离子能与洗脱下来的氨基酸结合,从而使洗脱下
来的氨基酸阳离子不再与树脂发生离子交换,因此
洗脱剂中的阴离子在不同程度上对阳离子交换过程
有影响,弱酸根阴离子对氨基酸洗脱起到一定的积
极作用。但是在用NH4Ac-NH3·H2O和NH4Ac来进行
洗脱的过程中,不可避免的使产品中含有 NH4Ac,这
样就给产品纯化带来更多困难,因此本实验采用氨
水为洗脱剂。
分别用不同体积浓度的氨水洗脱,每隔10mL收
集一次洗脱液,测定不同体积洗脱液下不同浓度氨
水对氨基酸的洗脱量,从而考察氨水浓度对洗脱效
果的影响(见图 7),结果表明,随着洗脱剂浓度的增
加,洗脱量增大,而且洗脱速率也随之增加,但浓度
太高,会使洗脱液pH加大,且使树脂再生难度加大,
因此选用3%的氨水为洗脱剂。
3结论
本文通过单因素实验和正交实验设计,对氨基
注:临界值 F0.05(3,3)为9.28。
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
提取温度 19.679 3 22.909 9.280 .
提取时间 1.008 3 1.173 9.280
盐酸浓度 22.286 3 25.944 9.280 .
液料比 0.859 3 1.000 9.280
提取次数 63.017 3 73.361 9.280 .
误差 0.86 3
表3提取条件方差分析
图6吸附时间的考察
35
30
25
20
15
10
5
0
0 2 4 6 8 10
吸
附
量
( m
g)
时间(h)
洗脱液 NH4Cl NH4Cl-NH3·H2O NH4Ac NH4Ac-NH3·H2O NH3·H2O
A566 0.326 0.346 0.431 0.455 0.420
表4不同洗脱液对氨基酸洗脱效果的影响
图7洗脱剂浓度对洗脱效果的影响
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 50 100 150 200
洗
脱
量
( m
g)
洗脱体积(mL)
1%
2%
3%
5%
(下转第159页)
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酸的提取和分离工艺进行了研
究,结果表明:氨基酸提取工艺中,使用25倍于木槿
原料干粉量的6mol/L盐酸回流提取氨基酸,100℃下
提取5h,提取3次后,提取效果最好,提取率可达
16.76%;将氨基酸提取液浓缩赶酸,活性炭脱色,醇
沉,初步除去糖类和蛋白质后,用732阳离子交换树
脂吸附6h,然后用3%氨水洗脱,收集洗脱液,然后减
压浓缩结晶,最后得到的氨基酸晶体得率为8.9%。
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(上接第156页)
3.3微生物指标
大肠菌群≤90cfu/100mL;致病菌未检出。
4结论
4.1本产品的最佳配方为:奶粉4.5%、甜菊素0.2‰、
木糖醇 2.5%、香精 1‰,乳化稳定剂最佳组合为:单
甘酯0.06%、蔗糖酯0.08%、CMC-Na0.12%。此条件
下荞麦乳均匀一致,呈浅褐色;状态均匀,无分层、无
气泡及沉淀现象,无脂肪上浮;具有独特的荞麦乳的
香味,无异味,甜度适宜,口感细腻。
4.2本产品的研制开发考虑到消费人群中的一部分
为糖尿病人,因此在进行调味时采用的无糖型甜味
剂—木糖醇和甜菊糖复合调制。木糖醇在人体肠道
中滞留,具有缓慢吸收作用,可促进肠道内有益菌群
如双歧杆菌的增殖,能调节胃肠功能,提高人体免疫
力。本研究采用的甜菊糖是一种高甜度、低热量的天
然甜味剂,糖尿病人食用不会增加血糖浓度,其甜度
是蔗糖的250倍,替代蔗糖可降低成本60%。而且甜
菊糖安全性高,无任何副作用。同时本产品以荞麦为
原料,其中含有丰富的黄酮类化合物。资料证明,黄
酮类化合物具有防治糖尿病、高血压、冠心病、抗癌、
防止内出血、延缓衰老等多种生理功能。因此,本产
品具有广阔的开发前景。
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图3均质压力对稳定性的影响(离心法)
3
2.5
2
1.5
1
均质压力(MPa)
沉
淀
率
( %
)
0 5 1015 20 25 303540
图4均质压力对稳定性的影响(静置法)
8
6
4
2
0
稳
定
性
( d
)
均质压力(MPa)
0 510 15202530 35 40

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