全 文 ：藤三七 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
思彬彬，石巧层 (北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川 750021)
摘要 ［目的］建立和优化藤三七稳定 ISSR-PCR反应体系和扩增程序。［方法］采用5因素4水平的正交试验和单因子梯度优化相结合
的方法。［结果］适用于藤三七的 25 μl ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度分别为:10 × buffer 2． 5 μl，dNTPs 0． 15 mmol /L，Mg2 + 2． 0
mmol /L，Taq酶 1． 0 U，引物0． 5 μmol /L，DNA 100 ng。［结论］对于藤三七 ISSR-PCR试验，一次正交试验完全可以建立满足要求的 ISSR-
PCR体系。
关键词 藤三七;ISSR-PCR;正交设计;单因子
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)02 －00643 －03
Establishment and Optimization of Boussingaultia ISSR-PCR Reaction System
SI Bin-bin et al (School of Biological Sciences and Engineering，Northern University for Nationalities，Yinchuan，Ningxia 750021)
Abstract ［Objective］The aim was to establish and optimize the ISSR-PCR reaction system and amplification program for Boussingaultia．
［Method］The five factors and four level orthogonal test and single factor test were adopted．［Result］The optimum concentration for each factor in
25 μl ISSR-PCR reaction system were 10 × buffer 2． 5 μl，dNTPs 0． 15 mmol /L，Mg2 + 2． 0 mmol /L，Taq enzyme 1． 0 U，primer 0． 5 μmol /L，DNA
100 ng．［Conclusion］A orthogonal test could establish qualified ISSR-PCR system．
Key words Boussingaultia;ISSR-PCR;Orthogonal design;Single factor test
基金项目 北方民族大学资助项目(2011ZQY031)。
作者简介 思彬彬(1977 － ) ，女，宁夏银川人，讲师，硕士，从事植物病
理学研究，E-mail:sibinbin115@ 163． com。
收稿日期 2011-10-13
藤三七为落葵科植物藤三七(Boussingaultia)的珠芽，具
有补益肝肾、壮腰膝、消肿散痰的功效［1］，民间常用于治疗腰
膝痹痛、病后体弱、跌打损伤等。目前市场上已出现了以该
药材为主要成分的保健食品。
ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子标记是 Zietk-
iewicz等［2］于 1994年创建，是基于微卫星技术发展而来的一
种新型分子标记技术，具有多态性高、稳定性好、产物特异性
强等特点［3］。目前已被广泛应用于植物的品种鉴定、基因定
位、遗传作图、分类与进化等诸多领域［4 －6］。运用 ISSR标记
技术时，不同的反应体系可产生不同的结果，为确保 ISSR分
析结果的可靠性和重复性，进行 ISSR-PCR 反应体系的建立
与优化非常必要。
笔者采用正交和单因素相结合的试验设计，建立藤三七
ISSR-PCR的最佳反应体系，获得最佳扩增结果，为今后藤三
七的遗传多样性、亲缘关系、种源鉴定等研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试材料。试验所用材料为藤三七，采自北方民族
大学试验基地。
1． 1． 2 主要试剂与仪器。ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大
学(UBC)提供的序列由上海生物工程公司合成;PCR反应相
关试剂购自大连宝生物工程有限公司。主要仪器:Palm-Cy-
cle梯度 PCR 仪(澳大利亚 Corbett Research 公司) ;电泳仪
(北京六一仪器厂) ;核酸检测仪(BECKMAN DU 800 核酸蛋
白检测仪;美国贝克曼库尔特有限公司) ;凝胶成像分析仪
(伯乐 Gel Doc2000凝胶成像系统;美国伯乐公司)
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA的提取。以藤三七叶片为材料，采用改
良 CTAB法提取其 DNA。用 1． 0%琼脂糖电泳和核酸检测仪
检测 DNA质量浓度，并稀释至 50 ng /μl，－20 ℃保存。
1． 2． 2 ISSR-PCR反应体系正交试验设计。采用 L16(4
5)正
交试验设计，对 dNTPs 、Mg2 +、引物、模板 DNA和 Taq酶进行
5因素 4水平筛选(表 1)。根据表 1 制备总体积为 25 μl 的
反应体系，除表中变化因素外，每管中还含有 2． 5 μl 10 ×
PCR Buffer，引物选用 809，PCR 扩增程序为:94 ℃预变性 5
min;94 ℃变性 45 s，适当的退火温度下退火 90 s，72 ℃延伸
90 s，41 个循环;72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。PCR 产物在
1． 2%琼脂糖凝胶上电泳检测，凝胶中含 0． 05%的溴化乙锭，
电极缓冲液为 1 × TAE，电压 5 V /cm。电泳结束后在凝胶成
像分析仪上观测分析并拍照。
表 1 ISSR-PCR 正交实验设计表 L16(4
5)
水平
组合
Taq酶
U/25 μl
Mg2 +
mmol /L
模板 DNA
ng /25 μl
dNTPs
mmol /L
引物
μmol /L
1 0． 75 1． 5 50 0． 10 0． 2
2 0． 75 2． 0 100 0． 15 0． 3
3 0． 75 2． 5 150 0． 20 0． 4
4 0． 75 3． 0 200 0． 25 0． 5
5 1． 00 1． 5 100 0． 20 0． 5
6 1． 00 2． 0 50 0． 25 0． 4
7 1． 00 2． 5 200 0． 10 0． 3
8 1． 00 3． 0 150 0． 15 0． 2
9 1． 25 1． 5 150 0． 25 0． 3
10 1． 25 2． 0 200 0． 20 0． 2
11 1． 25 2． 5 50 0． 15 0． 5
12 1． 25 3． 0 100 0． 10 0． 4
13 1． 50 1． 5 200 0． 15 0． 4
14 1． 50 2． 0 150 0． 10 0． 5
15 1． 50 2． 5 100 0． 25 0． 2
16 1． 50 3． 0 50 0． 20 0． 3
1． 2． 3 ISSR-PCR 反应体系单因子试验。依据正交试验结
果，选择扩增效果较好的反应体系，在此基础上进行单因素
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(2):643 － 645 责任编辑 朱琼琼 责任校对 傅真治
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.02.182
试验，进一步优化影响扩增效果的因素。引物为 810，其中
Mg2 +浓度梯度设为 1． 25、1． 50、1． 75、2． 00、2． 25、2． 50 mmol /L
6个处理;dNTPs浓度梯度设为 0． 10、0． 15、0． 20、0． 25、0． 30、
0． 35 mmol /L 6个梯度;引物浓度设置 0． 1、0． 2、0． 3、0． 4、0． 5、
0． 6 μmol /L 6 个梯度;DNA 模板设置 75、100、125、150、175、
200 ng 6个梯度;Taq酶用量设置 0． 625、0． 750、0． 875、1． 000、
1． 125、1． 250 U 6个梯度。每一个最佳条件确定后作为后续
研究的一个条件。
1． 2． 4 ISSR-PCR 反应优化退火温度。在确定最佳反应体
系基础上，利用引物 810对退火温度进行优化筛选。根据所
选引物序列计算理论退火温度 Tm，设置的退火温度在(Tm －
3)～(Tm +3)℃之间，扩增仪自动生成 12个梯度，比较退火
温度对条带数量和条带清晰度的影响。
2 结果与分析
2． 1 PCR正交设计直观分析 根据 L16(4
5)正交试验 PCR
产物电泳结果(图 1) ，对其从高到低依次打分。条带数量丰
富且清晰度高记为 16分，与此相反，最差则记为 1 分。以特
异谱带多态性高、背景干扰低、主带清晰、副带明显为原则，
同时考虑试验成本，确定第 8 组合为藤三七 ISSR-PCR 的最
佳反应体系。
注:1 ～16为表 1中的处理编号;M为 Marker DL2000。
图 1 正交设计 ISSR-PCR反应体系扩增结果
注:1． 0． 10 mmol /L;2． 0． 15 mmol /L;3． 0． 20 mmol /L;4． 0． 25
mmol /L;5． 0． 30 mmol /L;6． 0． 35 mmol /L。
图 2 dNTPs浓度对藤三七 ISSR-PCR扩增结果的影响
2． 2 单因子试验结果分析 在对 Mg2 +、dNTPs、引物、模板
DNA、Taq酶 5个因子进行了梯度对比后发现，各因子的浓度
均在较大的范围内对扩增产物不造成显著影响。dNTPs 是
PCR的原料，浓度太高易产生错误掺入，浓度太低则产率太
低，常用的是 0． 05 ～ 0． 20 mmol /L［7］。该试验发现藤三七
PCR扩增中 0． 10 ～ 0． 35 mmol /L 的 dNTPs 均可产生扩增条
带(图 2)。但 dNTPs浓度的变化对扩增条带的数量及亮度
均有一定的影响。随着 dNTPs浓度的增高，扩增条带的数量
略有减少，条带亮度略有下降。相对而言，dNTPs 浓度为
0． 15 mmol /L时条带较清晰，为最适浓度。
Mg2 +在 1． 25 ～ 2． 50 mmol /L 浓度内均扩增出谱带(图
3)。Mg2 +浓度会影响 PCR扩增的特异性，该试验中 Mg2 +浓
度在 6个浓度下的扩增谱带无显著差异。相比而言，Mg2 +浓
度为 2． 00 mmol /L时条带较清晰，背景较干净，为最适浓度。
注:1． 1． 25 mmol /L;2． 1． 50 mmol /L;3． 1． 75 mmol /L;4． 2． 00
mmol /L;5． 2． 25 mmol /L;6． 2． 50 mmol /L。
图 3 Mg2 +浓度对藤三七 ISSR-PCR扩增结果的影响
由图 4可知，在不同引物浓度下均能扩出条带，随着引
物浓度的增高，扩增的条带数量稍有减少，而亮度有所增加。
经比对，引物浓度为 0． 5 μmol /L 时条带较清晰，数量较多，
为最适浓度。
注:1． 0． 1 mmol /L;2． 0． 2 mmol /L;3． 0． 3 mmol /L;4． 0． 4
mmol /L;5． 0． 5 mmol /L;6． 0． 6 mmol /L。
图 4 引物浓度对藤三七 ISSR-PCR扩增结果的影响
446 安徽农业科学 2012 年
对大多数物种的 PCR扩增来说，Taq酶浓度变化对试验
结果影响较大，酶用量过高会造成非特异扩增，过低则会降
低产物合成效率。在该试验25 μl的反应体系中，从0． 625 ～
1． 250 U的范围内，Taq酶浓度的变化对藤三七 ISSR条带数
量的影响较大，但对亮度的影响并不大。随着 Taq酶浓度的
增高，扩增条带的数量稍有减少。相比而言，Taq 酶浓度为
1． 000 U时条带较清晰，数量较多，为最适浓度(图 5)。
一般认为模板浓度对反应体系的影响不大，但在该试验
中有所不同。在 25 μl 的反应体系中，模板量在 75 ～ 200 ng
的范围内，随着 DNA 浓度的增高，扩增条带的数量有所减
少，而对亮度的影响并不大。相比而言，DNA 浓度为 100 ng
时条带较清晰，数量较多，为最适浓度(图 6)。
注:1． 0． 625 U;2． 0． 750 U;3． 0． 875 U;4． 1． 000 U;5． 1． 125 U;6．
1． 250 U。
图 5 Taq酶用量对藤三七 ISSR-PCR扩增结果的影响
注:1． 75 ng;2． 100 ng;3． 125 ng;4． 150 ng;5． 175 ng;6． 200 ng。
图 6 模板 DNA对藤三七 ISSR-PCR扩增结果的影响
2． 3 退火温度对 ISSR-PCR的影响 退火温度是影响扩增
特异性的主要因素之一，较低的退火温度会使引物与模板错
配，产生非特异性条带;而过高则会抑制引物和模板结合。
在 Tm 值的基础上，适当提高退火温度可提高 PCR反应的特
异性。
该试验中，引物退火温度设置为 50． 0 ～ 55． 0 ℃，中间温
度由 Palm-Cycle梯度 PCR 仪自动生成，共 12 个温度梯度，
UBC810为引物。从图 7 可以看出，当退火温度为 50． 0 ～
51． 0 ℃时，条带亮度减弱且模糊;当退火温度为 51． 4 ～ 54． 5
℃时，扩增的条带数目多、带型清晰、亮度适当;当退火温度
高于 55 ℃后，扩增的条带数目减少。由此，可将最适温度定
为 53． 6 ℃。
注:1 ～12对应的退火温度依次为:50． 0、50． 5、51． 0、51． 4、51． 9、
52． 3、52． 7、53． 1、53． 6、54． 0、54． 5、55． 0 ℃。
图 7 不同退火温度下 ISSR-PCR扩增结果
3 讨论
基于 ISSR-PCR的研究，反应体系的建立是第一步，这关
系着后续的试验能否顺利进行并获得理想的结果。ISSR-
PCR反应体系的优化方法多采用正交或单因素设计，正交设
计可以更快更有效地分析不同因素的互相作用，但其处理水
平的设置相对有限，而单因素设计可以较系统和精细地研究
各主要因子的影响，但其无法探讨因素间的互作效应。该试
验首先采用正交设计筛选出可扩增出条带的 PCR 反应体
系，再结合单因子设计进一步优化体系，弥补上述试验不足，
可以简单快速地建立藤三七 ISSR-PCR 反应体系，得到稳定
且多态性丰富的扩增谱带。试验表明，在正交初选体系基础
上，改变各个因子浓度，在较大浓度范围内对 PCR结果影响
均不大。因此，藤三七 ISSR-PCR优化体系即为25 μl反应体
系中包括 10 × buffer 2． 5 μl、dNTPs 0． 15 mmol /L、Mg2 + 2． 0
mmol /L、Taq酶 1 U、引物 0． 5 μmol /L和 DNA 100 ng。
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54640卷 2期 思彬彬等 藤三七 ISSR-PCR反应体系的建立与优化