全 文 ：长期不同施肥制度对潮棕壤微生物生物量碳、
氮及细菌群落结构的影响*
徐永刚1,2 摇 宇万太1**摇 马摇 强1 摇 周摇 桦1
( 1 中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 110016; 2 中国科学院研究生院, 北京 100049)
摘摇 要摇 以沈阳生态站长期定位试验为研究平台,采用传统氯仿熏蒸方法和现代 PCR鄄DGGE
技术探讨了长期不同施肥制度对土壤微生物生物量碳和氮及细菌群落结构的影响. 结果表
明:在整个试验期,土壤微生物生物量碳和氮的动态变化趋势基本相同;长期施用有机肥可显
著提高土壤有机碳和土壤微生物生物量碳和氮含量,而长期施用化肥明显降低土壤 pH,土壤
微生物生物量碳和氮含量也显著降低. DGGE图谱表明:不同施肥处理的细菌 16S rDNA 多数
条带分布相同,28 条带中有 18 条为共有条带,说明潮棕壤中细菌类群较稳定,但其数量受到
施肥的影响;长期施用有机肥促进潮棕壤细菌群落结构的多样性,而施用化肥处理则降低了
其多样性.
关键词摇 微生物生物量碳、氮摇 细菌群落结构摇 多样性摇 DGGE
文章编号摇 1001-9332(2010)08-2078-08摇 中图分类号摇 S182摇 文献标识码摇 A
Effects of long鄄term fertilizations on microbial biomass C and N and bacterial community
structure in an aquic brown soil. XU Yong鄄gang1,2, YU Wan鄄tai1, MA Qiang1, ZHOU Hua1
( 1 Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China; 2Graduate
University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2010,21
(8): 2078-2085.
Abstract: Taking a long鄄term field experiment on an aquic brown soil in the Shenyang Ecological
Station of Chinese Academy of Sciences as a platform, the methods of traditional chloroform fumiga鄄
tion and modern PCR鄄DGGE were adopted to study the effects of different fertilizations on the chan鄄
ges of soil microbial biomass and bacterial community structure. During the whole period of the ex鄄
periment, there was a similar trend in the dynamic changes of soil microbial biomass C and N.
Long鄄term application of organic manure increased the soil organic C and the soil microbial biomass
C and N significantly, while long鄄term application of chemical fertilizers had significant negative
effects on the soil pH and soil microbial biomass C and N. The DGGE patterns showed that under
different fertilizations, the majority of soil bacterial 16S rDNA bands were the same, 18 of the 28
bands being common, suggesting that the bacterial populations in test soil were more stable, but
their numbers were affected by different fertilizations. Long鄄term application of organic fertilizer
could promote the diversity of the bacterial community structure in aquic brown soil, while the ap鄄
plication of chemical fertilizers was in adverse.
Key words: microbial biomass C and N;bacterial community structure;diversity;DGGE.
*国家科技支撑计划项目(2008BADA7B08 和 2007BAD8PB02)资
助.
**通讯作者. E鄄mail: wtyu@ iae. ac. cn
2010鄄01鄄06 收稿,2010鄄06鄄02 接受.
摇 摇 在土壤养分循环、转化和平衡过程中土壤微生
物起着重要的调节作用. 土壤微生物生物量是土壤
养分的储存库和植物生长可利用养分的重要来
源[1],一方面与微生物个体数量指标相比,其作为
耕作、栽培、施肥方式等措施对土壤肥力影响的指标
更能反映微生物在土壤中的实际含量和作用潜力,
因而具有更加灵敏、准确的优点[2-3] .另一方面它调
配着植物生长对养分的吸收活动,并能灵敏地反映
环境因子的变化,是评价土壤质量的重要指标之
一[4-5] .
土壤微生物种类极其丰富,在土壤生态系统中
有着至关重要的作用.土壤中存在着大量的微生物,
其中以细菌的种类和数量最多,细菌在土壤营养元
素循环、有机物质的形成和分解、肥力的保持和提
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 8 月摇 第 21 卷摇 第 8 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Aug. 2010,21(8): 2078-2085
高、生态环境的改善、植物的生长发育和作物病虫害
防治等方面均起着极其重要的作用[6-7] . 在生态学
和环境科学中,关于土壤微生物的多样性及其作用
的研究越来越受到重视. 但是采用传统的平板培养
方法研究土壤微生物的多样性有很多的缺陷,不能
很好地反映土壤微生物的多样性. 如可分离的微生
物种类只占总数的 1% ~ 10% ,许多“存活但不能培
养冶的微生物不能被分离和鉴定,这就使得采用新
的技术和方法显得尤为必要[8] . 当前,群落水平生
理代谢分析法、微生物生物标记物分析法和分子生
物学方法是应用最广泛的方法[9] .
施用肥料已经成为现行补充土壤养分,提高作
物产量的行之有效的办法,但长期施用肥料对土壤
质量造成的影响一直存在争议,通过研究土壤微生
物生物量来间接反映土壤质量情况是近年来研究的
热点之一[10-11],而对土壤微生物群落结构反映土壤
质量的研究鲜有报道.为此,研究长期不同施肥制度
对潮棕壤微生物生物量的动态变化及细菌群落结构
的影响,对进一步认识土壤微生物在潮棕壤物质循
环和能量流动中的作用以及对潮棕壤质量的培育与
维护具有重要意义.
1摇 研究地区与研究方法
1郾 1摇 试验地概况
中国科学院沈阳生态实验站位于沈阳市南 35
km处(41毅32忆 N,122毅23忆 E),地处下辽河平原,属于
暖温带半湿润大陆性季风气候,四季分明,雨热同
季,夏天炎热,冬天寒冷,年平均温度 7 益 ~ 8 益,最
高温度 39郾 3 益,最低温度-33郾 1 益,逸10 益活动积
温为 3300 益 ~ 3400 益,太阳总辐射量为 5409郾 9 ~
5599郾 8 MJ·m-2·a-1,年降雨量为 700 mm,年蒸发
量 1480 ~ 1756 mm,干燥度为 0郾 9,无霜期为 147 ~
164 d,平均早霜期出现在 9 月下旬,10 月中旬后常
有严霜. 供试土壤为潮棕壤,肥力水平中等偏上,
1990 年试验地土壤主要理化性质见表 1.
摇 摇 本研究长期施肥试验从 1990 年开始,涉及其中
的 6 个处理:1)对照(CK),不施肥;2)循环猪圈肥
(M),不施化肥,每年 80%收获产品经由饲喂鄄堆腐
后以猪圈肥形式返回;3)化肥 N;4)化肥 N+循环猪
圈肥(M),氨肥用量同 3),循环操作同 2);5)化肥
N、P、K;6)化肥 N、P、K+循环猪圈肥(M),N、P、K肥
用量同 5),循环操作同 2). N、P、K 肥分别是尿素、
重过磷酸钙和硫酸钾,其中肥料用量:N,150 kg·
hm-2;P,1990—1996 年磷肥用量为 17郾 9 kg P·
hm-2,1997 年后调整为 25 kg P·hm-2;K,60郾 0 kg·
hm-2 .试验地的轮作方式为大豆鄄玉米鄄玉米,小区面
积 162 m2,1990—2002 年大豆不施氮肥,2003 年后
大豆年施用氮肥 25 kg N·hm-2 .
1郾 2摇 样品采集
采样时间为 2009 年玉米生长期:播种前(4 月
15 日)、苗期(6 月 1 日)、拔节期(6 月 24 日)、抽穗
其(7 月 16 日)、灌浆期(8 月 14 日)、成熟期(9 月
17 日).采样区为玉米茬玉米区,深度为 0 ~ 20 cm,3
次重复,每个样品均由 5 点混合而成.新鲜土壤样品
剔除大的石砾、植物残体,通过 2 mm 筛后分成 3 部
分,一部分测定土壤微生物生物量,另一部分(100 g
左右)新鲜土放置于-20 益冰箱内储存用于微生物
多样性测定,剩余土样风干后用于测定其他理化性
质指标.
1郾 3摇 测定方法
1郾 3郾 1 微生物生物量碳、氮的测定 摇 土壤微生物生
物量碳、氮采用氯仿熏蒸鄄K2SO4 浸提法.提取时,称
取 30 g的新鲜过筛土样,在真空干燥器中用氯仿蒸
汽熏蒸 24 h,用反复抽真空方法除去残存氯仿后,另
取等量土样不熏蒸,再用 100 ml 0郾 5 mol · L-1
K2SO4 溶液浸提振荡 30 min 后立即过滤,滤出的浸
提液在-15 益下保存待测定. 提取液中有机碳含量
采用重铬酸钾氧化法测定,土壤微生物生物量碳计
算采用 BC = EC / KC,式中:EC 表示熏蒸与未熏蒸对
照土壤浸提液有机碳差值;KC 为转换系数,取值
0郾 38[12] .提取液中有机氮含量采用凯氏定氮法测
定,土壤微生物生物量氮计算采用 BN = EN / KN,式
中:EN 为熏蒸与未熏蒸对照土壤全氮的差值;KN 为
转换系数,取值 0郾 45[13] .
1郾 3郾 2 土壤微生物总 DNA 的提取和纯化 摇 土壤微
生物总 DNA的提取采取 Su等[14]的方法,按如下步
表 1摇 1990 年试验地土壤主要理化性质
Tab. 1摇 Main prosperities of tested soil in 1990
pH 有机碳
Organic C
(g·kg-1)
全 氮
Total N
(g·kg-1)
全 磷
Total P
(g·kg-1)
全 钾
Total K
(g·kg-1)
速效磷
Available P
(mg·kg-1)
速效钾
Available K
(mg·kg-1)
6郾 40 11郾 35 1郾 04 0郾 44 17郾 43 10郾 6 88郾 0
97028 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐永刚等: 长期不同施肥制度对潮棕壤微生物生物量碳、氮及细菌群落结构的影响摇 摇 摇 摇
骤操作:1)取土壤样品 5 g 与石英沙相混合放入含
有 850 ~ 1000 滋l 提取缓冲液的离心管中,其中土样
与石英沙质量比为 1 颐 0郾 5 ~ 2;而后将离心管置于
核酸提取仪内振荡 40 ~ 60 s,或在涡旋混合器上振
荡 10 ~ 20 min;2)将 50 ~ 100 滋l 浓度为 100 mg·
ml-1的溶菌酶加入初步裂解液中混匀,在 30 益 ~ 40
益温浴 30 ~ 60 min后,再加入 75 ~ 125 滋l 20% (W /
V)的 SDS(十二烷基硫酸钠),混匀,再在 60 益 ~ 70
益温浴 30 ~ 60 min,10000 ~ 12000 r·min-1离心 10
~ 20 min,收集上清;3)将裂解后的缓冲液经分离纯
化得粗提 DNA 溶液,而后将粗提液纯化,即得土壤
微生物基因组 DNA.采用 DNA回收试剂盒(博大泰
恒,北京),按照操作说明对 DNA粗提液进行纯化.
1郾 3郾 3 样品 PCR扩增摇 采用对大多数细菌和古细菌
的 16S rRNA 基因 V3 区具有特异性的引物 341GC
和 519[15](Lane)进行扩增.反应体系为 50 滋l,其中
包括 1 滋l 稀释 10 倍的 DNA 溶液(20 ng),0郾 4 滋l
Taq聚合酶(宝生物,大连),4 滋l dNTPs(宝生物,大
连),5 滋l 10伊PCR鄄buffer(缓冲液)(宝生物公司,大
连),前后引物各 1 滋l 和 37郾 6 滋l 的超纯水. PCR 扩
增程序为:94 益,预变性 4 min,30 个循环为 94 益
30 s,56 益 30 s,72 益 2 min,最后在 72 益下延伸 10
min.
1郾 3郾 4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析摇 用约 45 滋l
的 PCR产物进行 DGGE,所用仪器为 D鄄Code 基因突
变检测系统(Bio鄄Rad Laboratories Inc,Hercules,CA,
USA). DGGE 参数为:变性剂梯度为 30% ~ 40%
(100%变性相当于 7 mol·L-1尿素和 40%的去离子
甲酰胺),电泳缓冲液为1伊TAE buffer,60 益、200 V电
压下电泳 5 h,用 10 ml SyBR green I(Sigma)(1伊TAE
稀释10000倍)核酸染料染色30 min,在 Bio鄄Rad凝胶
成像仪中观察、拍照,并采用 Quantity One 软件(Bio鄄
Rad)对 DGGE图谱进行数字化处理和聚类分析.
1郾 3郾 5 土壤理化性质的测定 摇 土壤有机碳、全氮采
用元素分析仪(Vario EL,III,德国);pH值以 2郾 5 颐 1
的水土比用 pH鄄S3 型酸度计测定;全磷测定采用
Na2CO3 融熔鄄钥锑抗还原比色法;全钾测定采用
NaOH融熔鄄火焰光度法;速效磷测定采用 Olsen 法;
速效钾测定采用乙酸铵提取鄄火焰光度计法[16] .
1郾 4摇 数据处理方法
试验数据处理均由 Excel 2003 完成,采用方差
分析(one鄄way ANOVA)、最小显著差异法(LSD)进
行均值比较,计算过程采用 SPSS 13郾 0 完成.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 长期不同施肥制度下土壤理化性质的变化
经过 19 年不同的施肥,土壤理化性质发生了明
显变化.从表 2 可以看出,与 CK 相比,所有化肥处
理(N、N+M、NPK和 NPK+M)的 pH均显著降低(P<
0郾 05),而单施有机肥处理(M)的 pH 明显升高(P<
0郾 05);除 N处理外,其他施肥处理的有机碳、全氮
含量较 CK 处理均明显升高(P<0郾 05),其中 N+M
和 NPK+M 处理增加幅度最高,且两者间无显著差
异;对于土壤全磷而言,4 种无磷处理间(CK、M、N
和 N+M)无显著差异,只有 NPK 和 NPK+M 处理的
全磷含量明显增加(P<0郾 05);而从土壤全钾、速效
磷和速效钾 3 项指标来看,N 处理与 CK 处理间无
显著差异,其他 4 种处理均明显增加,其中以 NPK+
M处理最高. 综合来看,有机无机肥配施明显改善
土壤养分状况,而长期施用化肥明显降低土壤 pH.
2郾 2摇 不同施肥制度下土壤微生物生物量 C的变化
农田生态系统中土壤微生物生物量 C 的变化
主要受环境条件、植物生长、施肥方式等因素的综合
影响.施肥方式不同,植物残体、根系残留物和根系
分泌物在土壤中积累亦不同,则土壤微生物可利用
碳源数量不同,从而使土壤微生物生物量 C 在不同
施肥处理下表现出较大差异.
表 2摇 2009 年土壤主要理化性质
Tab. 2摇 Main prosperities of tested soil in 2009
处 理
Treatment
pH 有机碳
Organic C
(g·kg-1)
全 氮
Total N
(g·kg-1)
全 磷
Total P
(g·kg-1)
全 钾
Total K
(g·kg-1)
速效磷
Available P
(mg·kg-1)
速效钾
Available K
(mg·kg-1)
CK 6郾 06依0郾 01b 10郾 0依0郾 01d 0郾 94依0郾 00c 0郾 36依0郾 00c 16郾 1依0郾 02c 2郾 2依0郾 08e 62郾 7依1郾 21e
M 6郾 19依0郾 01a 12郾 2依0郾 03b 1郾 04依0郾 00b 0郾 38依0郾 01c 16郾 4依0郾 01b 3郾 0依0郾 04d 74郾 6依0郾 64d
N 5郾 37依0郾 03e 10郾 0依0郾 03d 0郾 93依0郾 00c 0郾 36依0郾 01c 16郾 1依0郾 02c 2郾 4依0郾 01e 62郾 8依0郾 64e
N+M 5郾 42依0郾 01d 13郾 1依0郾 01a 1郾 16依0郾 00a 0郾 37依0郾 01c 16郾 4依0郾 01b 3郾 4依0郾 09c 77郾 2依1郾 05c
NPK 5郾 42依0郾 01d 11郾 5依0郾 01c 1郾 03依0郾 01b 0郾 44依0郾 00b 17郾 5依0郾 05a 11郾 5依0郾 18b 80郾 4依0郾 64b
NPK+M 5郾 53依0郾 02c 13郾 4依0郾 00a 1郾 19依0郾 00a 0郾 49依0郾 01a 17郾 6依0郾 02a 16郾 0依0郾 24a 94郾 4依1郾 63a
同列不同字母表示处理间差异显著(P<0郾 05)Different letters in the same column meant significant difference among treatments at 0郾 05 level.
0802 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
表 3摇 不同施肥制度下土壤微生物生物量 C的变化及综合比较
Tab. 3摇 Changes and comprehensive comparison of soil microbial C under different fertilizer systems (mg·kg-1)
处 理
Treatment
播种前
Before seeding
苗 期
Seedling stage
拔节期
Jointing stage
抽雄期
Tesseling stage
灌浆期
Filling stage
成熟期
Mature stage
平均
Mean
CK 122郾 2依3郾 1Bb 83郾 5依3郾 1Cd 110郾 8依3郾 2Cbc 119郾 7依3郾 2Bbc 108郾 4依7郾 6Cc 195郾 7依5郾 4Ba 123郾 4依1郾 8C
M 142郾 9依3郾 1Ad 112郾 0依3郾 1Be 160郾 7依3郾 2Acd 184郾 5依9郾 6Ab 172郾 5依7郾 6Abc 246郾 4依19郾 0Aa 169郾 8依3郾 3A
N 110郾 7依3郾 0Cb 55郾 9依3郾 1Dd 78郾 1依5郾 5Dc 53郾 6依6郾 4Dd 81郾 9依2郾 8Dc 131郾 4依6郾 1Ca 85郾 3依1郾 6E
N+M 142郾 6依3郾 0Aa 117郾 5依6郾 2Bb 116郾 9依5郾 5Cb 125郾 5依5郾 4Bb 124郾 2依7郾 4Bb 123郾 7依3郾 0Cb 125郾 1依3郾 0C
NPK 127郾 0依3郾 1Ba 119郾 7依5郾 4Bab 116郾 1依3郾 1Cbc 94郾 8依3郾 1Cd 90郾 8依2郾 8Dd 109郾 9依3郾 0Dc 109郾 7依0郾 0)D
NPK+M 151郾 6依2郾 9Aa 142郾 7依3郾 1Aab 135郾 5依6郾 3Bb 132郾 0依3郾 0Bb 135郾 4依2郾 8Bb 145郾 5依5郾 3Cab 140郾 5依2郾 4B
大写字母表示同一时期不同处理间差异显著,小写字母表示同一处理不同时期差异显著(P<0郾 05)Significant difference at 0郾 05 level of different
treatments at the same stage was showed by capital letters, while that of different stages in the same treatment was showed by litter letters下同 The same
below.
摇 摇 从整个试验期间土壤微生物生物量 C的动态变
化来看(表 3),N+M、NPK 及 NPK+M 处理的微生物
生物量 C季节变化幅度很小,变异系数分别为 0郾 07、
0郾 13和 0郾 04,最高值都出现在播种前.由于前一年秋
季玉米收获后大量根茬等植物残体还田,这些有机体
经过腐殖化作用和冬季到早春的冻融过程产生一定
量的有机质,为微生物快速生长、繁殖提供了充分条
件.因此,4月各处理均表现出较高的微生物生物量
C.在整个玉米生育期,作物生长需要吸收大量养分,
同时气温逐渐升高,微生物活性增强,尤其是呼吸作
用强烈,消耗土壤中的碳源,使得微生物碳量有所减
少[17] .
CK、M和 N 处理微生物生物量 C 季节变化幅
度比较大,变异系数分别为 0郾 31、0郾 27 和 0郾 36,这
是由于这 3 种处理养分较为匮乏,在维持植物生长
需要的同时,作物与微生物竞争养分状况更为激烈,
微生物所能利用 C 源有限,土壤中微生物生物量 C
含量随玉米生长及水热状况变化明显[17] . 3 种处理
微生物生物量 C 的变化规律有一定相似性:最高值
都出现在成熟期,最低值都出现在苗期. 苗期(5—6
月),玉米开始快速生长并消耗土壤中有限的养分,
同时气温升高使得微生物活性增强,消耗大量的碳
源,因此在此期出现最低值. 值得注意的是,这 3 个
处理最高峰均出现在成熟期,这可能是由于本年灌
浆期干旱严重影响了玉米生长,玉米生育期延迟,在
成熟期玉米根系活动依然活跃,根系分泌物、凋落物
增多,丰富的基质和合适的水分条件促进了微生物
的繁殖[18] .
由表 3 可以看出,不同处理微生物生物量 C 的
差异并未随季节变化及玉米生育期影响而明显改
变.除拔节期外,M 处理的微生物生物量 C 均显著
高于其他处理;除成熟期外,N处理的微生物生物量
C均显著低于其他处理. 单施氮肥土壤的微生物生
物量 C 在整个试验期均显著低于 CK 处理 ( P <
0郾 05),而 NPK处理的微生物生物量 C在前期与 CK
持平或高于 CK,后期则明显低于 CK. 总体来看,不
同施肥处理土壤微生物生物量 C 含量(平均值)的
大小顺序为 M>NPK+M>N+M逸CK>NPK>N.
2郾 3摇 不同施肥制度下土壤微生物生物量 N的变化
土壤微生物生物量 N 含量是土壤微生物对 N
素矿化与固持作用的综合反映,凡是影响土壤氮素
矿化与固持过程的因素都会影响土壤微生物生物量
N,如土壤含水量、土壤温度和土壤养分状况等. 从
表 4 可见,试验所有处理的微生物生物量 N 在播种
前都表现出较高值,但在整个玉米生育期变化趋势
不尽一致:CK、M和 N 处理在整个玉米生育期变化
幅度较大,变异系数分别为 0郾 32、0郾 26 和 0郾 43,最
高峰值都出现在成熟期,这与土壤微生物生物量 C
的变化相似. 而 N+M、NPK 和 NPK+M 处理的微生
物生物量 N在整个玉米生育期变化幅度较小,变异
系数分别为 0郾 10、0郾 12 和 0郾 11,最高峰值出现在拔
节期,并且在成熟期也出现次高峰,这与土壤微生物
生物量 C 变化不同.在拔节期,气温开始升高,土壤
N矿化和转化能力增强,此时正处于玉米的追肥期,
土壤中的氮比较充裕,被微生物固持到微生物体内
的氮也增加[19];在抽雄期和灌浆期,玉米生长需要
大量 N素,与微生物竞争激烈,使得固定在微生物
体内的氮有所减少[20];到了成熟期,玉米代谢依然
旺盛,根系分泌物、凋落物积累,但对氮素的吸收相
对减少,进而造成 3 种处理微生物生物量 N 小幅度
上升.从以上分析看,不同施肥处理微生物生物量
C、N动态变化趋势的差异是各处理自身养分状况、
气候及作物等因素综合作用的结果,具体机理有待
于进一步研究.
摇 摇 从表 4 可以看出,与微生物生物量 C 变化相
似,不同处理土壤微生物生物量N的差异随季节变
18028 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐永刚等: 长期不同施肥制度对潮棕壤微生物生物量碳、氮及细菌群落结构的影响摇 摇 摇 摇
表 4摇 不同施肥制度下土壤微生物生物量 N的变化及综合比较
Tab. 4摇 Changes and comprehensive comparison of soil microbial N under different fertilizer systems (mg·kg-1)
处 理
Treatment
播种前
Before seeding
苗 期
Seedling stage
拔节期
Jointing stage
抽雄期
Tesseling stage
灌浆期
Filling stage
成熟期
Mature stage
平均
Mean
CK 20郾 2依1郾 1Bb 11郾 5依1郾 3Cd 21郾 5依1郾 1Bb 20郾 0依2郾 1Bb 17郾 2依1郾 0Cc 31郾 2依1郾 4Ba 20郾 3依0郾 7D
M 23郾 5依1郾 0Ad 20郾 6依2郾 9Bd 29郾 4依0郾 5Ac 35郾 1依1郾 2Ab 31郾 8依2郾 9Abc 41郾 9依2郾 1Aa 30郾 4依1郾 0A
N 18郾 5依1郾 3Bb 8郾 4依1郾 3Cd 14郾 3依1郾 4Cc 9郾 0依1郾 0Cd 12郾 7依0郾 6Dc 25郾 4依3郾 1Ca 14郾 7依0郾 9E
N+M 24郾 5依1郾 0Aab 21郾 8依1郾 5ABb 25郾 6依2郾 9Ba 20郾 4依3郾 2Bb 20郾 7依0郾 6BCb 24郾 9依1郾 3Cab 23郾 0依1郾 1C
NPK 20郾 1依1郾 3Bb 20郾 9依0郾 0Bb 24郾 4依1郾 4Ba 18郾 3依0郾 5Bb 17郾 4依1郾 5Cb 20郾 1依2郾 1Db 20郾 2依0郾 1D
NPK+M 24郾 7依0郾 6Abc 25郾 1依1郾 3Aab 29郾 4依1郾 8Aa 21郾 8依3郾 3Bc 23郾 1依0郾 3Bbc 26郾 9依1郾 0BCab 25郾 2依0郾 3B
化及玉米生育期无明显改变.与微生物生物量 C 变
化的主要区别在于前 3 个时期(播种前、苗期和拔
节期),NPK+M处理保持较高的微生物生物量 N,而
后 3 个时期(抽雄期、灌浆期和成熟期),M 处理微
生物生物量 N 含量明显高于其他处理. 总体来看,
不同施肥处理土壤微生物生物量 N(平均值)的大
小顺序为:M>NPK+M>N+M>CK逸NPK>N.
2郾 4摇 不同施肥制度对土壤细菌群落结构的影响
6 种不同处理土壤样品 16S rDNA PCR 产物的
变性梯度凝胶电泳结果如图 1 所示,细菌群落的丰
富度和多样性指数如表 5 所示. 从图 1 和表 5 可以
看出,与 CK 相比,M 处理细菌群落丰富度(DGGE
条带数)和多样性指数均明显提高,其他化肥处理
细菌群落丰富度和多样性指数均有所降低,说明长
期施用有机肥可以提高土壤细菌群落结构的多样
性,而长期施用化肥对土壤细菌群落结构多样性有
一定的负作用.不同施肥处理共出现 28 条 DGGE条
带,其中共有条带达到 18 条,占总数的 62郾 3% ,说
明在各处理细菌优势菌群结构基本一致,这些细菌
种群不易受施肥措施的影响. 在 DGGE 图谱中,处
于不同位置的每条 DNA带及其相对浓度(亮度)代
表微生物群落中某一特定微生物种及其在群落中的
相对丰度[21] .从公共条带的亮度来看,不同处理下
的优势菌数量及所占比例明显不同,这表明施肥措
表 5摇 不同施肥制度下土壤细菌群落丰富度和多样性指数
Tab. 5摇 Number of DGGE bands and diversity index (H)
of soil microbial community under different fertilizer sys鄄
tems
处理 Treatment 丰富度 Richness 多样性指数 H
CK 25 3郾 17
M 28 3郾 28
N 22 3郾 08
N+M 23 3郾 13
NPK 23 3郾 13
NPK+M 24 3郾 17
图 1摇 不同施肥处理土壤细菌 16S rDNA DGGE图谱
Fig. 1摇 DGGE band patterns of 16S rDNA of soil bacteria under different fertilizer systems.
2802 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
表 6摇 土壤微生物生物量、细菌群落丰富度和多样性指数与理化因子的相关系数
Tab. 6摇 Correlation coefficients between microbial biomass, richness, H and physical and chemical factors
微生物生物量 C
Microbial biomass C
微生物生物量 N
Microbial biomass N
丰富度
Richness
多样性指数
H
pH 0郾 700** 0郾 595** 0郾 850** 0郾 923**
有机碳 Organic C (g·kg-1) 0郾 587* 0郾 666** 0郾 331 0郾 170
全 氮 Total N (g·kg-1) 0郾 451* 0郾 542* 0郾 164 0郾 001
全 磷 Total P (g·kg-1) 0郾 205 0郾 262 0郾 062 -0郾 077
全 钾 Total K (g·kg-1) 0郾 137 0郾 233 0郾 004 -0郾 143
速效磷 Available P (mg·kg-1) 0郾 098 0郾 176 -0郾 050 -0郾 191
速效钾 Available K (mg·kg-1) 0郾 415 0郾 448 0郾 191 0郾 020
*P<0郾 05; **P<0郾 01.
图 2摇 土壤细菌群落 DGGE 指纹图谱聚类分析
Fig. 2摇 DGGE cluster analysis (UPGMA) of 16S rDNA profiles
of soil bacterial communities.
施在很大程度上影响优势菌细菌的数量.
摇 摇 进一步利用 Quantity One 软件 ( Bio鄄Rad)对
DGGE 图谱的条带数和亮度进行数字化处理,并依
此为据进行聚类分析,得到各处理间的聚类分析结
果(图 2). 6 个处理聚类为两类,NPK 和 NPK+M 为
一类,CK、M、N和 N+M 为另一类,说明均衡施肥对
土壤细菌群落的影响明显区别于非均衡施肥,也从
另一面说明长期 N、P 和 K 肥的配合施用对土壤细
菌群落具有明显影响.从相似性指数来看,各处理间
的相似度比较大,相似性都大于 67% ,其中 NPK 与
NPK+M之间的相似性最高,达到 83% .
2郾 5摇 土壤微生物生物量、细菌群落丰富度和多样性
指数与理化因子的相关分析
从表 6 可以看出,土壤微生物生物量、细菌群落
丰富度和多样性指数均与土壤 pH 呈极显著正相
关,说明在此 pH 范围内(5郾 37 ~ 6郾 19),它们随 pH
的降低而降低,土壤 pH 已成为土壤微生物生物量
和细菌群落多样性的限制因素. 土壤微生物生物量
与有机碳呈极显著正相关(P<0郾 01),与全氮呈显著
正相关(P<0郾 05),与全磷、全钾、速效磷和速效钾无
显著相关性,说明土壤微生物生物量能灵敏地反映
土壤有机质变化,可作为土壤肥力变化的有效指标.
3摇 讨摇 摇 论
3郾 1摇 不同施肥制度对土壤微生物生物量的影响
施用化肥对土壤微生物生物量影响的研究结论
不尽一致[22-23],这主要与施肥方式和年限有关. 本
研究结果显示,长期施用化肥明显降低土壤微生物
生物量.这与于树等[24]研究结果一致. 分析其主要
原因有:1)长期施用化肥使得土壤 pH显著降低(表
2),造成土壤酸化,对土壤微生物产生胁迫;2)长期
施用氮肥可增加植物根茬等的残留,但土壤的 C / N
比下降[2],这加速了土壤原有有机碳的分解,导致
土壤中积累的有机碳总量并无增加,不能为微生物
生长提供更丰富的碳源.姚政等[25]的研究结果亦显
示,单施化肥会使微生物生物量 C 下降,并认为可
能是由于化肥的使用改变了土壤 pH 值,从而使土
壤微生物群落结构相应地发生了改变,导致微生物
生物量 C降低.有机肥处理(M、N+M和 NPK+M)微
生物生物量均高于其他处理,说明长期施用有机肥,
可以使土壤保持较高的供碳、氮能力,从而使微生物
生物量 C、N增加.这是因为施用有机肥不仅可带入
大量微生物,而且能为土壤原住微生物提供丰富的
C源,促进其生长[26] .总之,施用有机肥可提高土壤
微生物生物量,使更多的碳、氮素固持在微生物体内
并使之免遭流失,可加速微生物的新陈代谢活动和
土壤营养元素的周转,有利于土壤营养元素的快速
供应.
3郾 2摇 不同施肥制度对土壤细菌群落结构的影响
DGGE是一种快速、可靠的检测微生物群落结
构组成的分子生物学方法. 本研究利用该技术对 6
种长期不同施肥处理土壤细菌群落结构进行研究.
研究表明:长期施肥处理显著地改变了土壤细菌群
落结构特征,这与 Marschner等[27]研究结果相同.与
CK相比,所有化肥处理(N、N+M、NPK 和 NPK+M)
的细菌群落结构多样性均有所降低,只有单纯施有
38028 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐永刚等: 长期不同施肥制度对潮棕壤微生物生物量碳、氮及细菌群落结构的影响摇 摇 摇 摇
机肥处理(M)的细菌群落结构多样性明显提高. Sun
等[28]研究长期施用化肥和有机肥对土壤细菌群落
结构的影响,结果表明施用化肥降低了土壤细菌多
样性,这与本研究结果一致.产生这种现象的原因可
能归结于长期施用化肥明显降低土壤 pH,破坏了土
壤生境,导致土壤细菌群落结构多样性降低.而施用
有机肥处理,尽管其养分含量不是很高,但 pH 明显
高于其他处理, 有利于细菌多样性的保持.
O爷Donnell等[29]也认为施肥措施影响了微生物的群
落结构,主要是因为施肥改变了土壤 pH 值,导致了
微生物群落结构的变化.本试验地经过长期(19 年)
不同施肥处理,还导致土壤有机碳、全氮、速效磷和
速效钾的明显变化(表 2),这表明土壤环境发生了
明显的改变.不同处理间土壤细菌群落结构的相似
性或多样性变化主要是由于不同施肥处理下的土壤
环境改变所致.
土壤微生物种类不同其功能也有所不同,因此
微生物多样性的降低,将直接影响到各种微生物不
同功能的发挥,以及相互间的互作关系,从而对土壤
各种营养元素的循环、有机物的分解利用、植物对养
分的吸收和生长发育产生影响,同时这也可能是土
壤退化的一个重要原因[20] . 因此,长期施用化肥最
终可能间接造成土壤退化,影响土壤质量,而施用有
机肥可在一定程度上缓解或遏制这种情况的发生.
4摇 结摇 摇 论
本试验结果显示,长期不同施肥制度对潮棕壤
土壤微生物生物量及细菌群落结构产生明显影响.
对于供试的潮棕壤土来讲,长期施用有机肥对土壤
微生物生物量和细菌群落多样性的提高有促进作
用,而长期施用化肥则降低土壤微生物生物量和细
菌群落多样性.不同施肥制度下土壤微生物生物量
和细菌群落结构的变化可能主要是由于不同施肥改
变了土壤环境条件,其中 pH 和有机碳是影响它们
变化的主要因素.
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作者简介摇 徐永刚,男,1984 年生,硕士研究生. 主要从事土
壤微生物研究. E鄄mail: xuyonggang1228@ 163. com
责任编辑摇 肖摇 红
58028 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 徐永刚等: 长期不同施肥制度对潮棕壤微生物生物量碳、氮及细菌群落结构的影响摇 摇 摇 摇