全 文 ：第 43 卷 第 4 期 四 川 大 学 学 报 (工 程 科 学 版 ) Vol． 43 No． 4
2011 年 7 月 JOURNAL OF SICHUAN UNIVERSITY (ENGINEERING SCIENCE EDITION)
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July 2011
文章编号:1009-3087(2011)04-0174-05
毛细管电泳间接激光诱导荧光法测定苦蒿和青蒿中酸性成分
刘海峰1，薛洪宝1，2，焦艳娜1，杨甲甲1，庞国伟1，李 晖1*
(1．四川大学 化学工程学院，四川 成都 610065;2．蚌埠医学院 化学教研室，安徽 蚌埠 233000)
摘 要:利用毛细管电泳建立了中药苦蒿和青蒿及其制剂中 11 种酸性化合物的同时定量分析方法。其最佳电泳
条件为:熔融石英毛细管 50 cm(40 cm 处检测窗口)× 75 μm i． d．;分离电压:+ 15 kV;分离温度:25 ℃;缓冲液
(含:35． 7 mmol /L 磷酸钠，2． 86 × 10 －5mol /L 荧光素钠，少量甲醇，pH = 11． 42) ;进样压力:0． 5 psi(3． 45 kPa) ，进样
时间 5． 0 s;荧光素钠为激光诱导荧光响应试剂;LIF 激发光波长:488 nm，检测波长:520 nm。该方法线性范围宽、
相对标准偏差低、精密度高、重现性好，用于实际样品的测定，获得满意结果。
关键词:毛细管电泳;间接激光诱导荧光检测;酸性成分;苦蒿;青蒿
中图分类号:O657 文献标志码:A
Determination of Acidic Constituents Conyza blinii levl． ＆ Artemisia annua L． by Indirect LIF －CE
LIU Hai-feng1，XUE Hong-bao1，2，JIAO Yan-na1，YANG Jia-jia1，PANG Guo-wei1，LI Hui1*
(1． School of Chem． Eng．，Sichuan Univ．，Chengdu 610065，China;
2． Teaching and Research Section of Chem．，Bengbu Medical College，Anhui Bengbu 233000，China)
Abstract:A novel method was established to separate and quantify simultaneously 11 acidic compounds in traditional Chinese medicine
of Conyza blinii levl． and Artemisia annua L． using capillary electrophoresis (CE)． Optimized apparatus conditions were given． A
fused － silica capillary 50 cm (40 cm to detector)× 75 μm i． d． was used． Working voltage of + 15 kV was applied at 25 ℃ ． The buff-
er(pH = 11． 42)containing 35． 7 mmol phosphate sodium，2． 86 × 10 －5mol /L fluorescein sodium (respondence reagent) ，and small a-
mount of methanol was used． The hydrodynamic injection of a sample (0． 5 psi(3． 45 kPa) )during 5 sec was used． Indirect laser in-
duced fluorescence(LIF)detection was applied by LIF detector at wavelength of 488 nm(excitation) ，520 nm (detection)． The method
had a wide linear range，low relative standard deviation，high precision and perfect reproducibility． Real samples assay result was a-
chieved perfectly in this condition．
Key words:capillary electrophoresis(CE) ;indirect laser induced fluoresence detection;acidic constituents;Conyza blinii levl．;Arte-
misia annua L．
苦蒿又名金龙胆草(Conyza blinii levl．) ，为菊科
白酒草属植物，在四川、云南和贵州等地分布较广。
具有清热解毒、消炎祛痰、止咳平喘之功效，用于慢
性气管炎、胃肠炎、肾炎、肝炎、痢疾、口腔炎、中耳
炎、风火牙痛、湿疹、痔疮、外伤出血、烫火伤及牲畜
创伤［1 － 2］。苦蒿的化学成分主要有萜类、皂苷、酚性
物质、酸性物质、挥发油及生物碱等［3］。而关于苦
蒿中主要化学成分的研究目前仅局限于定性方
面［4］。青蒿为菊科植物，又称黄花蒿(Artemisia annua
收稿日期:2010 － 07 － 20
作者简介:刘海峰(1974 －) ，男，博士生，讲师． 研究方向:色谱
分析．
* 通讯联系人
L．) ，在治疗肿瘤、心率失常、流感，甚至治疗艾滋病
方面，也是一种颇具开发价值的中药［5］。
据报道，苦蒿和青蒿中的酸性化合物具有抗菌、
抗炎症、防衰老、降低心脏病发病率等功效［6 － 7］。但
由于酸性化合物成分复杂，结构多样，除芳香酸及酚
酸有紫外吸收外，多数脂肪酸类紫外吸收弱，难于分
离及检测［8 － 9］。作者利用毛细管电泳结合高灵敏度
的间接激光诱导荧光检测法，对两种蒿属中强极性
酸性成分的分离及定量进行了研究，并建立了 11 种
酸性成分同时定量的分析方法。该方法样品前处理
简单，实验条件容易达到，线性范围宽，检测灵敏度
高，实验操作简单，避免了荧光试剂衍生化的繁琐步
骤及其衍生化不完全等中间环节处理不当产生的人
为误差。在研究苦蒿和青蒿药效成分、制剂生产工
DOI:10.15961/j.jsuese.2011.04.010
艺和质量监测中具有实际的应用价值。
1 实验部分
1． 1 仪器及材料
P /ACETMMDQ毛细管电泳系统(Beckman Coul-
ter，Fullerton，CA，USA) ，激光诱导荧光(LIF)检测
器;内壁未涂层熔融石英毛细管，内径 75 μm，总长
50 cm，有效长度 40 cm，河北永年锐沣色谱器件有
限公司;32Karat电泳分析软件;TU － 1901 双光束紫
外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公
司。苦蒿，青蒿，分别采收于 9 月中旬，产地:四川省
攀枝花市;金龙胆草浸膏片，成都明日制药有限公
司;复方青蒿安乃近片，成都倍特药业有限公司;酸
性化合物标准品，成都科龙试剂厂。
1． 2 标准对照品溶液的制备
11 种酸性化合物所称重量见表 1。用 3 次蒸馏
水溶解，定容至 50 ml，制得标准混合溶液。分别取
一定量的该溶液稀释成不同浓度系列，经 0． 45 μm
滤膜过滤，待分析。
表 1 酸性化合物标准样重量
Tab． 1 The content of acidic compounds standard samples
酸性化合物 草酸 琥珀酸 苹果酸 酒石酸 柠檬酸 月桂酸
抗坏血酸
(维生素 C)
阿魏酸 安息香酸 水杨酸
对羟基
苯甲酸
重量 / g 0． 0224 0． 0215 0． 0231 0． 0149 0． 0289 0． 0223 0． 0257 0． 0371 0． 0222 0． 0246 0． 0123
1． 3 样品的前处理
分别精确称取粉碎 2． 794 5 g和 2． 686 3 g的苦
蒿和青蒿原药材，放入 50 ml 锥形瓶中，加入 25
ml95%乙醇，振摇均匀。与文献［10 － 11］中的处理
方法略同，间歇超声浸提 5 h，获得提取液。同样的
方法浸提残渣 2 次，合并 3 次提取液，用 0． 45 μm微
孔滤膜过滤，得褐色提取液，4 ℃保存待分析。另取
金龙胆草浸膏片和复方青蒿安乃近片除去表面糖
衣，精确称取 0． 287 2、0． 767 4 g采取上述同样处理
方法，获取待测液进行分析。
2 结果与讨论
苦蒿和青蒿中酸性化合物结构如文献［1］。从
结构可知:除后 4 种有苯环结构外，前 7 种酸性物质
属于脂肪族化合物，没有较大的共轭结构，紫外吸收
较小不适合利用紫外检测器检测。要达到上述 11
种物质的同时分离检测，且要达到较高灵敏度，采用
荧光素钠(图 1)为缓冲液背景添加剂，因其可见光
区最大吸收波长 490 nm，实验中采用激发光波长
488 nm，检测波长 520 nm，间接激光诱导荧光检测
法，以实现 11 种酸性物质的同时定量分析。
2． 1 最佳分析条件的选择
2． 1． 1 分离温度的选择
15、20、25、30、35 ℃测定结果见图 2。整体看
来，样品保留时间随温度升高而缩短，其主要原因可
能是:高温样品及缓冲溶液对流扩散严重;高温溶液
体系粘度减小，电渗流增大，保留时间缩短。当温度
较低(15、20 ℃)时，前面 10 种物质的分离效果较
好，但最后一种物质保留时间长达 45 min 以上。为
图 1 荧光素钠吸收光谱图
Fig． 1 Absorption spectrogram of fluorescein sodium
了保证所有物质都能得到较好的分离，且保留时间
相对较短，15、20℃不是适宜温度。相反，当温度
30、35 ℃时，样品组分对流扩散现象明显，从而导致
部分电泳峰形发生畸变，其中 35 ℃时表现更为明
显。所以实验中选择 25 ℃作为最佳分离温度。
图 2 不同温度下 11 种酸性化合物电泳图
Fig． 2 Electrophoretogram of eleven kinds of acidic
compounds in different temperature
571第 4 期 刘海峰，等:毛细管电泳间接激光诱导荧光法测定苦蒿和青蒿中酸性成分
2． 1． 2 分离电压的选择
在 10、15、20、25、29 kV 下进行分离(图 3) ，样
品留出时间随电压升高，电场强度较大，电场强度与
电渗流成正比，电渗流较大，保留时间较短。当分离
电压很低(10 kV)时，样品组分的对流扩散导致的
峰形畸变现象严重。当电压较高(20、25、29 kV)
时，电渗流较大，样品组分保留时间较短，且电压很
高时电流过大，焦耳热效应明显，样品纵向扩散，分
离效率降低。因此，在保证峰形不发生畸变的条件
下采用 15 kV为分离电压。
图 3 不同电压下 11 种酸性化合物电泳图
Fig． 3 Electrophoretogram of eleven kinds of acidic
compounds in different voltage
2． 1． 3 缓冲液浓度的选择
缓冲液浓度对样品分离效果影响很大。实验中
分别选取 4 个不同浓度的磷酸盐缓冲液进行分离，
从图 4 中可见，随着缓冲溶液浓度的升高，样品组
分保留时间延长。当缓冲液浓度较小(17． 9mmol /
L)时，基线平稳，但分离效果很差，未能实现样品组
分的有效分离，不宜采用。当缓冲液浓度过高
(42． 9、71． 4 mmol /L)时，基线波动，且峰形畸变厉
害，不宜采用。因实验中采用间接方法检测，缓冲液
中有荧光试剂本体背景。缓冲液浓度高低对荧光背
景吸收可能有一定影响，其机理目前尚不清楚，有待
于进一步深入研究。通过实验证明缓冲液浓度为
35． 7 mmol /L 时，基线平稳，且样品分离效果较好，
所以缓冲液浓度为该浓度。
2． 1． 4 缓冲液酸度的选择
缓冲液酸度是影响样品的分离关键因素，适当
的缓冲液酸度对于样品的有效分离及检测起着至关
重要的作用。在 pH值为 9． 71、10． 50、11． 42、12． 21
条件下进行分离，电泳图(图5)显示，pH值为
11． 42 时分离效果最好，其它 pH值下分离效果均较
差。
通过分离温度、分离电压、缓冲液浓度、酸度等
条件优化，本实验的最佳电泳条件是:熔融石英毛细
图 4 不同缓冲液浓度下 11 种酸性化合物电泳图
Fig． 4 Electrophoretogram of eleven kinds of acidic
compounds in different concentration of buffer
管 50 cm(40 cm处检测窗口)× 75 μm i． d．;缓冲液
(含:35． 7 mmol /L磷酸钠，2． 86 × 10 －5mol /L荧光素
钠，少量甲醇，pH = 11． 42) ;分离电压:+ 15 kV;进
样压力:0． 5 psi(3． 45 kPa) ，进样时间 5． 0 s;分离温
度:25 ℃;LIF 激发光波长:488 nm，发射波长:520
nm。文中未特殊指明处皆为此实验条件。
图 5 不同缓冲液酸度下的 11 种酸性化合物电泳图
Fig． 5 Electrophoretogram of eleven kinds of acidic
compounds in different acidity of buffer
2． 2 电泳分析方法的建立
2． 2． 1 标准曲线的绘制
在最佳电泳条件下，按照 1． 2 节制备标准溶液
系列进行分析，结果如图 6 所示。
图 6 标准样电泳图
Fig． 6 Electrophoretogram of standard solution
671 四川大学学报(工程科学版) 第 43 卷
尽管前 7 个组分出现倒峰，且第 6 号和第 7 号
峰之间出现尖锐的系统峰，根据不同浓度峰面积仍
呈线性关系，当浓度过高时 8、9、10 号峰未达到基线
分离，不影响定量分析结果。以峰面积绘制标准曲
线，求出各成分平均保留时间、相对标准偏差、检测
限、线性范围、线性系数(r)及线性回归方程等结果
如表 2 所示。
同时由表 2 所示的检测限显示，所有酸性化合
物检测限在 0． 58 － 37． 90μg /L之间，线性范围在两
个数量级以上，与文献［6］结果基本相符。抗坏血
酸和阿魏酸标准曲线线性关系偏低，可能是由于出
现倒峰和正峰交叉处，峰面积定量关系不准所造成，
但基本能满足定量分析要求。
2． 2． 2 重现性、精密度及准确性
分别取 1． 3 中苦蒿药材提取物样品重复测定 5
次，测得 RSD%见表 3。表明精密度高，重现性好。
另取 1 份，采用加标回收方法，测得平均加标回收率
在 95． 2% ～104． 5%之间。表明该方法准确性高。
表 2 酸性化合物标准样的保留时间及线性关系
Tab． 2 Retention time and linear relationship of the standard sample for acidic compounds
酸性
化合物
平均保留
时间 /min
RSD /%
(n = 5)
检测限 /
(μg·L －1)
线性范围 /
(mg·L －1)
r
线性回归方程*
A B
1 6． 784 2． 59 37． 90 0． 62 ～ 123． 80 0． 999 3 1 214 10 551
2 8． 098 1． 96 5． 81 1． 23 ～ 246． 60 0． 999 3 68 611 119 818
3 9． 328 3． 97 18． 60 1． 11 ～ 222． 30 0． 999 6 8 304 38 275
4 9． 627 2． 62 11． 79 1． 86 ～ 371． 50 0． 999 8 18 394 98 948
5 9． 927 2． 97 13． 51 1． 29 ～ 257． 70 0． 999 8 22 591 59 292
6 10． 544 2． 31 0． 68 1． 12 ～ 223． 80 0． 998 9 － 2 141 460 5 479 170
7 10． 718 2． 60 0． 58 1． 45 ～ 289． 40 0． 997 9 － 92 208 1 920 960
8 10． 830 2． 43 1． 08 0． 75 ～ 149． 70 0． 997 8 － 3 471 390 3 447 760
9 12． 298 4． 44 2． 47 1． 16 ～ 231． 70 0． 998 7 － 4 411 340 2 879 900
10 12． 957 3． 15 7． 60 1． 08 ～ 215． 90 0． 998 5 － 8 103 520 1 525 900
11 35． 693 6． 14 13． 19 1． 12 ～ 224． 40 0． 999 6 － 16 020 600 1 755 390
注:* 线性方程:y = A + B × x
表 3 重现性及回收率实验结果
Tab． 3 The result of reproducibilities and recoveries
酸性
化合物
药材 1 /
(mg·L －1)
药材 2 /
(mg·L －1)
药材 3 /
(mg·L －1)
药材 4 /
(mg·L －1)
药材 5 /
(mg·L －1)
平均值 /
(mg·L －1)
RSD /%
加入量 /
(mg·L －1)
检测量 /
(mg·L －1)
回收率 /%
1 23． 12 23． 92 23． 31 23． 86 23． 21 23． 48 1． 61 25． 00 48． 19 98． 8
2 2． 98 2． 76 2． 79 3． 01 2． 99 2． 91 4． 15 3． 00 5． 90 99． 9
3 151． 28 155． 91 154． 94 154． 88 154． 72 154． 35 1． 15 150． 00 300． 27 97． 3
4 137． 41 139． 47 139． 95 136． 42 139． 17 138． 48 1． 08 150． 00 286． 15 98． 4
5 20． 96 20． 69 20． 79 21． 01 20． 98 20． 89 0． 67 20． 00 39． 92 95． 2
6 2． 71 2． 61 2． 49 2． 56 2． 42 2． 56 4． 35 3． 00 5． 49 97． 8
7 11． 72 12． 69 11． 81 12． 32 12． 01 12． 11 3． 28 15． 00 26． 52 96． 1
8 6． 23 6． 57 6． 39 6． 26 6． 59 6． 41 2． 63 5． 00 11． 60 103． 9
9 1． 76 1． 97 1． 89 1． 78 1． 88 1． 86 4． 64 2． 00 3． 89 101． 8
10 5． 52 5． 82 5． 49 5． 98 5． 93 5． 75 3． 99 5． 00 10． 90 103． 1
11 10． 13 10． 81 10． 52 10． 32 10． 23 10． 40 2． 59 10． 00 20． 85 104． 5
771第 4 期 刘海峰，等:毛细管电泳间接激光诱导荧光法测定苦蒿和青蒿中酸性成分
2． 3 实际样品测定结果
图 7 所示结果是苦蒿和青蒿药材、中药复方制
剂实际样品的电泳图。表 4 是各成分的测定结果。
可见，苦蒿和青蒿中酸性化合物含量差异较大。
a 空白，b 苦蒿药材，c 青蒿药材，d 苦蒿制剂，e 青蒿制剂
图 7 样品的电泳图
Fig． 7 Electrophoretogram of the samples
表 4 苦蒿和青蒿中酸性化合物含量测定结果
Tab． 4 Determination results of acidic compounds in Cony-
za blinii levl ． and Artemisia annua L．
酸性化合物
药材 /(mg·L －1)
苦蒿 青蒿
制剂
苦蒿 青蒿
1 23． 55 22． 65 33． 65 103． 90
2 2． 92 3． 85 3． 96 9． 09
3 154． 35 6． 18 5． 22 63． 79
4 138． 48 7． 69 7． 15 35． 28
5 20． 89 20． 40 12． 44 98． 53
6 2． 56 2． 85 0． 80 0． 78
7 12． 11 10． 18 1． 08 0． 63
8 6． 41 1． 91 1． 43 4． 35
9 1． 86 1． 78 1． 66 2． 10
10 5． 75 5． 85 6． 92 6． 29
11 10． 40 16． 02 13． 44 15． 34
3 结 论
建立了毛细管电泳(激光诱导荧光检测器)间
接激光诱导荧光检测中草药苦蒿和青蒿及其制剂中
11 种酸性成分同时定量的分析方法。其中，样品前
处理简单，实验条件容易达到，线性范围宽，检测灵
敏度高，实验操作简单，避免了荧光试剂衍生化的繁
琐步骤及其衍生化不完全等中间环节处理不当产生
的人为误差。鉴于本方法的快速、便捷、灵敏等优
点，在研究苦蒿和青蒿药效成分、制剂生产工艺和质
量监测中具有实际的应用价值。
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(编辑 黄小川)
871 四川大学学报(工程科学版) 第 43 卷