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收稿日期:2011 － 03 － 25
基金项目:广西科技攻关项目(桂科攻 0992003 B-37) ;广西植物研究所基本业务费合同(桂植业 10001)和广西科技创新能力建设项目(桂科能
0992028-10)。
作者简介:陈宗游(1980 －) ，男，广西武宣人;助理研究员，主要从事经济植物的引种驯化栽培和分子生物学研究。
通讯作者:韦 霄，E-mail:weixiao@ scbg． ac． cn
块根紫金牛 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
陈宗游1， 史艳财1， 罗宝丽2， 邹 蓉1， 孔德鑫1， 韦 霄1
(1．广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所， 广西 桂林 541006;
2．广西师范大学生命科学院， 广西 桂林 541004)
Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Ardisia pseudocrispa
CHEN Zong-you1，SHI Yan-cai1，LUO Bao-li2，ZOU Rong1，KONG De-xin，WEI Xiao1
摘要:采用正交和单因素试验设计方法，研究 Mg2 +、dNTP 、引
物、TaqDNA 聚合酶、模板 DNA、退火温度及循环次数对 ISSR-
PCR扩增效果的影响，建立块根紫金牛 ISSR-PCR 反应体系和
扩增程序，即 25 ul 的体系中含 Mg2 + 2． 0 mmol /L，dNTP 0． 15
mmol /L，引物 1． 0 μmol /L，TaqDNA聚合酶 1． 0 U，模板 DNA 50
ng，10 × Buffer 2． 5 μl。适宜的扩增程序是 94 ℃预变性 5 min，94
℃变性 30 s，56． 6 ℃退火 45 s，70 ℃延伸 2． 0 min;45 个循环;72
℃延伸 7 min，4 ℃保存。采用正交和单因素试验可快速建立
ISSR-PCR反应体系。该体系稳定、可靠，可用于块根紫金牛遗
传多样性分析。
关键词: 块根紫金牛;ISSR-PCR;正交设计;单因素试验;
优化
中图分类号: R 282． 7 文献标志码: A
文章编号: 1001 － 4705(2011)07-0082-04
块根紫金牛(Ardisia pseudocrispa Pit．) ，又名小罗
伞、高郎伞、木生地，属紫金牛科(Myrsinaceae) ，紫金
牛属(Ardisia)植物。紫金牛属以富含止咳有效成分
岩白菜素而著称，朱砂根、紫金牛、走马胎、块根紫金牛
等在民间被广泛应用［1］，紫金牛等种的生药学、化学
成分、药理等已得到系统的研究［2］。块根紫金牛具有
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第 30 卷 第 7 期 2011 年 7 月 种 子 (Seed) Vol． 30 No． 7 Jul． 2011
活血化瘀、祛风除湿等功效［3］，有很好的药用价值，现
仅有化学成分方面的报道［4］。对块根紫金牛遗传多
样性进行研究对于种质资源开发和利用有重要意义。
ISSR是 Zietkiewicz 等人创建的一种新型分子标
记技术［5］，该技术具有操作简单、遗传多态性高、耗资
少等优点，适用于品种鉴定、遗传多样性分析、系统进
化等诸多研究领域［6］。目前已经在黄连［7］、天麻［8］、
白芷［9］、五味子［10］等药用植物的研究中应用。
ISSR的稳定性受到 Mg2 +、引物等因素的影响，优
化和采用统一的 PCR 反应条件是非常必要的。本试
验采用正交和单因素设计方法对影响 ISSR-PCR 扩增
效果的 7 个因素 Mg2 +、dNTP 、引物、TaqDNA聚合酶、
模板 DNA、退火温度及循环次数进行了筛选，建立块
根紫金牛 ISSR-PCR 最佳反应体系和程序，为块根紫
金牛种质资源遗传多样性评价、亲缘关系分析等奠定
基础。
1 材料与方法
1． 1 材 料
试验材料于 2010 年 10 月采自广西植物研究所种
质资源圃(北纬 25°11，东经 110°07)。采集 1 年生实
生苗的幼嫩叶片，采后即进行 DNA提取。
1． 2 仪器与试剂
引物(引物 844 序列为 CTCTCTCTCTCTCTCTRC，
R = A，T)、Mg2 +、dNTP、10 × PCR buffer、Taq DNA聚合
酶(上海生工生物工程技术服务有限公司) ;Markers
(华美生物工程公司) ;TU-1901 型双光束紫外可见分
光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司) ;PCR 仪
(美国 BIO-RAD 伯乐公司，Model:PTC-200) ;DYCP-34
型电泳槽(北京市六一仪器厂) ;离心机(珠海黑马医
学仪器有限公司) ;CDYY-6 C 型电泳仪(北京市六一
仪器厂) ;UVP凝胶成像系统。
1． 3 方 法
1． 3． 1 DNA提取与检测
采用 CTAB法提取块根紫金牛总 DNA。用 1%琼
脂糖凝胶电泳法检验 DNA质量，用紫外分光光度计检
测 DNA浓度，稀释至 30 ng /μl，置于 4 ℃冰箱中保存。
1． 3． 2 ISSR-PCR反应体系的正交试验
采用 L16(4
5)正交试验设计，试验因素及水平见表
1，具体方案见表 2。PCR 反应体系总体积是 25 μl，每
个体系还含有 2． 5 μl的 10 × PCR buffe，超纯水补至 25
μl。引物为 844，每一组合设 2 次重复。
预扩增程序:94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，
57 ℃退火 45 s，70 ℃延伸 2． 0 min，35 个循环;72 ℃延
伸 7 min，4 ℃保存。取 10 μl扩增产物在 1． 5%的琼脂
糖凝胶中电泳 1． 5 h 左右，EB 液(0． 5 ug /ml)染色 20
min，然后置于 UVP凝胶成像系统中拍照。
表 1 正交试验的因素与水平
水平
Mg2 +
(mmol /L)
dNTP
(mmol /L)
引物
(μ mol /L)
Taq
(U /25 μ l)
DNA
(ng)
1 0． 5 0． 1 0． 6 0． 5 10
2 1． 0 0． 15 0． 8 1． 0 30
3 1． 5 0． 2 1． 0 1． 5 50
4 2． 0 0． 25 1． 2 2． 0 70
表 2 ISSR-PCR正交试验 L16(4
5)
序号
因 素
Mg
(mmol /L)
dNTP
(mmol /L)
引物
(μ mol /L)
Taq
(U /25 μ l)
DNA
(ng)
1 0． 5 0． 1 0． 6 0． 5 10
2 0． 5 0． 15 0． 8 1． 0 30
3 0． 5 0． 2 1． 0 1． 5 50
4 0． 5 0． 25 1． 2 2． 0 70
5 1． 0 0． 1 0． 8 1． 5 70
6 1． 0 0． 15 0． 6 2 50
7 1． 0 0． 2 1． 2 0． 5 30
8 1． 0 0． 25 1． 0 1． 0 10
9 1． 5 0． 1 1． 0 2． 0 30
10 1． 5 0． 15 1． 2 1． 5 10
11 1． 5 0． 2 0． 6 1． 0 70
12 1． 5 0． 25 0． 8 0． 5 50
13 2． 0 0． 1 1． 2 1． 0 50
14 2． 0 0． 15 1． 0 0． 5 70
15 2． 0 0． 2 0． 8 2． 0 10
16 2． 0 0． 25 0． 6 1． 5 30
1． 3． 3 ISSR-PCR单因素试验
根据正交试验结果选择扩增效果较好的组合进行
单因素试验，变化单一因素，其他因素不变，每一个条
件确定后作为后续研究的一个条件。每因素设置 6 个
水平，Mg2 +为 0． 25、0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5 mmol /L，
dNTP为0． 05、0． 10、0． 15、0． 20、0． 25、0． 30 mmol /L，引
物为 0． 4、0． 6、0． 8、1． 0、1． 2、1． 4 μmol /L，TaqDNA 聚
合酶为 0． 25、0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、2． 5 U /25 μl，模板
DNA为 5、10、30、50、70、90 ng。每个梯度设 2 次重复。
1． 3． 4 ISSR-PCR反应程序优化
确定反应体系后，对循环次数和退火温度进行筛
选。循环次数设 20、25、30、35、40、45 次。退火梯度范
围设为引物理论退火温度 Tm ± 5 ℃(56 ± 5) ，PCR 仪
自动形成 12 个梯度 51． 0、51． 3、52． 0、53． 0、54． 2、55．
4、56． 6、57． 8、59． 0、60． 0、60． 7、61． 0 ℃。每个梯度设
2 次重复。
2 结果与分析
·38·
问题探讨 陈宗游 等:块根紫金牛 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
2． 1 正交试验结果
由图 1 可知，正交试验 16 个组合间存在明显差
异。1、2、4 组合效果最差，都扩不出条带;3、5、6、7、8、
12 扩增出的条带数目少，条带背景弥散，清晰度差;9、
10、11 扩增效果基本一致，但其条带数目相对较少;
13、14、15、16 扩增效果相近，以组合 14 扩增效果相对
最好，其条带数目多，主带清晰，易于区分。综合以上
分析，确定选用 14 组合，即在 25 体系中含 Mg2 + 2． 0
mmol /L，dNTP 0． 15 mmol /L，引物 1． 0 μmol /L，TaqDNA
聚合酶 0． 5 U /25 μl，模板 DNA 70 ng。
图 1 ISSR-PCR正交试验结果
注:1 ～ 16 为表 2 的处理组合编号。
2． 2 Mg2 +对 ISSR-PCR的影响
如图 2 所示，Mg2 +浓度在 0． 25 ～ 1． 5 mmol /L 时，
扩增不出条带或者扩增产物量不足，不易区分;提高
Mg2 +浓度，条带数目和清晰度提高，当浓度为 2． 0
mmol /L时扩增效果最好。故 Mg2 +的最佳浓度为 2． 0
mmol /L。
图 2 Mg2 +对 ISSR-PCR的影响
2． 3 dNTP对 ISSR-PCR的影响
由图 3 可知，在不同 dNTP 浓度条件下均可扩出
条带。随着浓度的升高，条带强度的变化趋势是:由弱
到强，再由强逐渐到弱。当浓度为 0． 15 mmol /L时，反
应稳定且扩增出的条带清晰度最好，故选择 0． 15
mmol /L为最佳浓度。
图 3 dNTP对 ISSR-PCR的影响
2． 4 引物对 ISSR-PCR的影响
如图 4 所示，不同浓度的引物扩出的带型基本一
致。随着引物用量的增加，条带的清晰度随之提高且趋
于稳定。当引物浓度大于 1． 0 μmol /L 时，条带最为清
晰，考虑实验成本，以 1． 0 μmol /L为引物的最佳浓度。
图 4 引物对 ISSR-PCR的影响
2． 5 TaqDNA聚合酶对 ISSR-PCR的影响
如图 5 所示，当 TaqDNA 聚合酶浓度为 0． 25、
0． 5 U时，扩增出的条带弱且数目少。随着浓度的升
高，条带数目增多。当浓度为 1． 0、1． 5 U时，条带最为
清晰。继续提高浓度，则非特异性扩增增强，不易区
分。确定 TaqDNA聚合酶的最佳浓度为 1． 0 U。
图 5 Taq DNA聚合酶对 ISSR-PCR的影响
2． 6 模板 DNA对 ISSR-PCR的影响
如图 6 所示，模板 DNA 浓度为 5 ～ 50 ng 时，条带
的数目与清晰度逐渐提高。当浓度大于 50 ng 时，条
带的数目与清晰度没有明显的变化。故确定模板
DNA的最佳浓度为 50 ng。
图 6 模板 DNA对 ISSR-PCR的影响
·48·
第 30 卷 第 7 期 2011 年 7 月 种 子 (Seed) Vol． 30 No． 7 Jul． 2011
2． 7 循环次数对 ISSR-PCR的影响
如图 7所示，循环次数为 20、25 次时，扩增不出条
带。增加循环次数，扩增产物的量随之增加。循环次数
为 45次时，条带数目多、清晰度高，为最佳循环次数。
图 7 循环次数对 ISSR-PCR的影响
2． 8 退火温度对 ISSR-PCR的影响
如图 8 所示，温度较低时(51． 0 ～ 53． 0 ℃) ，除主
带外，杂带多，背景弥散，不易区分。随着退火温度升
高(53． 0 ～ 56． 6 ℃) ，引物与模板结合的特异性增强，
在 56． 6 ℃时，扩增效果最好。继续提高温度，非特异
性扩增加强。选择反应的退火温度为 56． 6 ℃。
图 8 退火温度对 ISSR-PCR的影响
3 讨论与结论
已有的报道中，多采用单因素或者正交试验设计
方法摸索 ISSR-PCR最佳反应条件［11］。单因素试验可
对各个主要因子进行系统的研究，但无法探讨不同因
素间的相互作用，试验结果分析多采用直观分析［11］。
正交试验可有效分析不同因素间的相互作用，但所获
得的只能是试验所用水平的某种组合，优选结果不会
超越所取水平的范围，其结果分析带有主观成分。如
何建立对 PCR扩增结果评判的客观标准，提高试验结
果的可信度和易操作性，对于促进 ISSR-PCR 技术的
发展具有重要价值［11］。先采用正交设计对反应条件
进行初步筛选，然后结合单因素试验设计进一步优化，
可快速、有效地建立反应体系，为较好的方法。
反应体系选用合适的 Mg2 + 浓度非常重要，因
TaqDNA 聚合酶是 Mg2 + 依赖性酶，其活性大小受
Mg2 +浓度的影响，Mg2 +还可维持反应体系的 pH 值。
试验结果表明，反应对 Mg2 +要求严格，Mg2 +浓度过低
时，不能进行有效扩增。浓度选用 2． 0 mmol /L时最为
合适，扩增出的条带多，背景清晰。底物浓度过低，会
过早消耗完，使产物单链化;浓度过高，容易产生非特
异性扩增，还会与 Mg2 +结合，降低体系中 Mg2 +浓度。
本体系中 dNTP浓度在 0． 15 mmol /L左右时效果最好。
PCR 扩增产率和稳定性主要受引物与模板结合能力
影响。引物少，扩增产物少，引物过多则容易形成引物
二聚体和进行非特异性扩增，试验中合适的引物浓度
是 1． 0 μmol /L。TaqDNA聚合酶浓度过低合成效率低，
过高则增大非特异性扩增与成本，试验中选用 1． 0 U
较为合适。ISSR-PCR反应对模板 DNA浓度的要求范
围较宽［12］，试验结果与报道相一致。试验中确定模板
DNA浓度为 50 ng。
试验对扩增程序中两个比较重要的因素循环次数
和退火温度进行了筛选，确定扩增程序为:94 ℃预变
性 5 min，94 ℃变性 30 s，56． 6 ℃退火 45 s，70 ℃延伸
2． 0 min，45 个循环;72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。
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