全 文 ：现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2008, Vol.24, No.11
1100
零余子多糖的分离纯化及抗氧化研究
秦恩华
(湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000)
摘要：主要对零余子多糖的分离纯化工艺进行了探讨，同时对零余子粗多糖对超氧自由基的清除作用进行了研究。结果发现不
同浓度的乙醇沉淀的多糖得率有所不同，零余子中以 30%的乙醇沉淀的得率最高，但其多糖纯度并不高。用 30%乙醇沉淀的多糖对
超氧自由基的清除率随着多糖浓度的增加而增加，但是用 60%乙醇沉淀的多糖对超氧自由基的清除率却正好相反，随着浓度的增加
而降低，当多糖浓度增加到一定程度的时候，对超氧自由基具有了促进作用。采用 DEAE-Celloluse52 分离纯化零余子多糖，NaCl 梯
度洗脱，得到的多糖经 SephadexG-200 证明为单一的糖，但这些多糖类物质有可能是和蛋白质结合到一起。
关键词：零余子多糖；多糖提取；含量测定；多糖的抗氧化
中图分类号：O629.12；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)11-1100-04
Separation and Purification of the Yam Bean Polysaccharides and its
Antioxidation Character
QIN En-hua
Abstract: The separation and purification of fleshy bud polysaccharide were studied and its elimination effect on free radicals was also
investigated. Results showed that the highest yield of deposit from yam bean was achieved by 30% ethanol, but the purity of the corresponding
deposit was somewhat low. The scavenging rates of the deposit by 30% ethanol increased with increasing its concentration, while that of the
deposit by 60% ethanol decreased. The much higher concentration of the latter even facilitated the function of super-oxide. The crude
polysaccharide was purified by ion chromatographic analysis with NaCl solution as gradient eluate and identified by gelatin chromatography on
a SephadexG-200 column. This polysaccharide was considered to be conjoined with proteins.
Key words: fleshy bud polysaccharide; extraction polysaccharide; oxidation resistance
零余子为薯蓣科植物薯蓣 Dioscoreaopposita
Thunb. 叶腋间的珠芽[1,2]，俗称“山药豆”，呈卵圆形或
椭圆形，直径约 0.4~2 cm，外表皮淡黄色，有细皱纹，
气味淡而不苦，口嚼粘腻，零余子含有 16 种氨基酸、
胆碱、尿素、植酸、多种维生素、淀粉酶，山药素等
特种物质，自古就是营养价值很高的滋补食品和药用
价值很高的药材，可食用，还具医疗价值[3]。
利川山药是恩施州的特色蔬菜之一，现有总种植
规模 5.0 万亩，其中利川市种植规模在 2 万亩以上，
其他县市亦有零星种植。现在的栽培条件下，若雨水
调顺，每亩可收鲜山药 1200~2200 kg，零余子 250~500
kg，即使进行一定程度的疏芽，零余子亩产量也可保
持在 100~150 kg 间。但是目前对零余子的加工技术为
空白，面对产量较高的零余子，当地人们除了少部分
收稿日期：2008-06-17
基金项目：湖北省教育厅重点项目，项目编号：B200729006；湖北民族学院
青年项目
作者简介：秦恩华(1964-)，女，实验师，研究方向：食品微生物及资源开发
煮食和作为繁殖材料之外，大部分作为饲料使用，为
了进一步提高山药产业的附加值，对零余子的开发利
用尤为必要。因此本文对零余子的多糖进行分离提
取，同时对其体外自由基清除作用进行了研究，以期
为零余子的综合开发利用奠定理论基础。
1 实验材料、试剂与设备
1.1 实验材料
零余子：购于利川团堡，于 60 ℃干燥粉碎后备
用。
1.2 实验试剂
95%乙醇，Tris（三羟甲基氨基甲烷），浓盐酸(12
mol/L)，98%浓硫酸，6%苯酚溶液，邻苯三酚，葡萄
糖，氯化钠，氢氧化钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，
纤维素 DEAE-52 柱，Sephadex G-200（葡聚糖凝胶
G-200）。
1.3 实验设备
DL-5-B 型低速大容量离心机；722S 型可见光分
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2008.11.018
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2008, Vol.24, No.11
1101
光光度计；旋转蒸发器 RE-52；S53⁄54 紫外可见分光
光度计；恒温水浴锅；层析设备。
2 实验方法
2.1 零余子多糖的提取工艺流程[3]
零余子→清洗→打浆→沸水提取→(200 目)尼龙
布过滤→渣进行二次沸水提取→尼龙布过滤→合并过滤液→
醇沉(30%乙醇沉淀)→离心→沉淀→干燥→多糖 1
↓
上清液→浓缩→60%乙醇沉淀→离心→沉淀→干燥→多糖 2
2.2 多糖的纯化工艺
粗多糖→复溶→脱蛋白(Sevege 法)→过 DEAE-52 层析柱
→洗脱→浓缩→透析脱盐→纯度鉴定（过 SephadexG-200 层析
柱和紫外扫描）
2.3 多糖含量测定
苯酚-硫酸法[4]
2.3.1 标准曲线的制备
精密称取105 ℃下恒重的葡萄糖标准品10 mg置
于 100 mL 容量瓶中，蒸馏水定容，使其质量浓度为
0.1 mg⁄mL。精密量取标准品溶液 0、0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0 和 1.2 mL，分别加入到 20 mL 的试管中，依
次加入蒸馏水使其最终体积为 2 mL，各管再加入 6％
苯酚 1.0 mL 混匀后迅速加入 5.0 mL 浓硫酸摇匀，静
置 5 min 后，放入沸水中加热 20 min，取出后冷却至
室温。在 490nm 处测定吸光度，以葡萄糖的含量为横
坐标（C），吸光度为纵坐标（A），绘制标准曲线，得
线性回归方程：A=0.0067C+0.0147，R=0.999051，在
20~100 μg 范围内线性关系良好。
2.3.2 样品含量测定
吸取样品溶液 1.0 mL（3 份），分别置于 20 mL
的试管中，依次加入蒸馏水使其最终体积为 2.0 mL，
各管再加入 6％苯酚 1.0 mL 混匀后迅速加入 5.0 mL
浓硫酸摇匀，静置 5 min 后，放入沸水中加热 20 min，
取出后冷却至室温。在 490 nm 处测定吸光度。
2.3.3 多糖含量计算
样品中多糖（％）=[查曲线所得糖量(μg)×稀释倍
数]÷[样重(g)×106]×100%
2.4 零余子多糖对超氧自由基的清除作用
邻苯三酚自氧化法测定[5]。
取 4.5 mL pH 8.2 的 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，
4.2 mL 蒸馏水，混匀后在 25 ℃水浴中保温 20 min，
取出后立即加入在 25 ℃预热过的 3.0 mmol/L 邻苯三
酚 0.3 mL（以 10 mmol/L HCl 配置，空白管用 10
mmol/L HCl 代替邻苯三酚的 HCl 溶液）迅速摇匀后
倒入比色皿，325 nm 下每隔 30 s 测定吸光度，计算线
形范围内每分钟吸光度的增加。在加入邻苯三酚前，
先加入一定体积的多糖溶液，蒸馏水减少，然后按下
述方法计算抑制率：
抑制率（％）=（ A△ 0－ A△ ）⁄ A△ 0×100％
其中： A△ 0 为邻苯三酚的自氧化速率，单位为吸光度每
分钟的增值。
2.5 零余子多糖的分离纯化[6]
首先对 DEAE-52 分别用 0.5 mol/L NaOH 浸泡 30
min，水洗至 pH 7.0，改用 0.5 mol/L HCl 浸泡 30 min，
水洗至 pH 4.0，再用 0.5 mol/L NaOH 浸泡 30 min 后
水洗至 pH 7.0。而后湿法装柱，平衡后上样，首先用
水洗脱，而后以 0、0.5 mol/L NaC1 溶液进行梯度洗脱，
控制流速为 0.5 mL/min，苯酚一硫酸法跟踪检测，收
集主要的高峰部分的洗脱液，洗脱液经过减压浓缩、
透析、醇沉、洗涤、干燥，得灰白色零余子多糖。将
此多糖继续以 Sephadex G-200 柱进行纯度鉴定。
2.6 多糖的紫外扫描
取浓缩液进行多糖测定，结果为 1.84 mg/mL，用
此溶液在 756MC 紫外可见分光光度计于 200~400 nm
进行紫外扫描。
3 结果与分析
3.1 不同乙醇沉淀的多糖的得率
采用不同浓度的乙醇进行多糖沉淀，具体见表 1。
表1 不同浓度乙醇沉淀的多糖得率
Table 1 Extracting rate of fleshy bud polysaccharide by
different concentration ethnol
30%乙醇沉淀多糖 60%乙醇沉淀多糖
多糖得率(鲜重) 10.19% 0.4941%
表 1 可看出，30%乙醇沉淀的多糖得率要高得多。
3.2 零余子多糖对超氧自由基的清除作用
首先配制 5 mg/mL 的零余子多糖溶液，然后按表
2 进行超氧自由基清除实验。
由表 2 可以看出，用 30%乙醇沉淀的多糖对超氧
自由基的清除率随着多糖浓度的增加而增加，但是用
60%乙醇沉淀的多糖对超氧自由基的清除率却正好相
反，随着浓度的增加而降低，当多糖浓度增加到一定
程度的时候，对超氧自由基具有了促进作用。
3.3 DEAE-Celloluse52 对零余子多糖的分离效果
因为零余子中含有淀粉类物质，因此为了去除
30%乙醇沉淀的多糖中的淀粉的影响，首先用蒸馏水
作为洗脱液进行洗脱，而后采用 0~0.5 mol/L 的 NaCl
进行梯度洗脱，收集 40 管，用苯酚—硫酸法在 490 nm
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2008, Vol.24, No.11
1102
下测其吸光度，以管数为横坐标，以吸光度为纵坐标
作图，绘制洗脱曲线，具体结果见图 1。从图 1 知采
用 NaCl 梯度洗脱同样可将多糖类分离为两种组分，
其中绝大多数富集在 3~11 管，收集此管进行多糖产品
制备，以便进行多糖的纯度鉴定。
表2 零余子多糖对超氧自由基的清除作用
Table 2 Elimination effect of the polysaccharide on the O2-•
对照组 自氧化 30%乙醇沉淀多糖 60%乙醇沉淀多糖
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tris—Hcl/mL 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5
蒸馏水/mL 4.2 4.2 3.3 2.4 1.5 0.6 3.3 2.4 1.5 0.6
多糖溶液⁄mL 0 0 0.9 1.8 2.7 3.6 0.9 1.8 2.7 3.6
邻苯三酚/mL 0 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
HCl 溶液/mL 0.3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0.046 0.083 0.156 0.214 0.233 0.260 0.405 0.543 0.688
30 s 0 0.064 0.102 0.177 0.233 0.258 0.288 0.428 0.560 0.703
60 s 0 0.083 0.119 0.197 0.250 0.279 0.313 0.449 0.577 0.722
90 s 0 0.101 0.140 0.217 0.275 0.302 0.336 0.468 0.594 0.739
120 s 0 0.120 1.161 0.237 0.294 0.325 0.362 0.487 0.613 0.751
150 s 0 0.137 0.179 0.255 0.315 0.350 0.383 0.503 0.632 0.767
180 s 0 0.154 0.195 0.278 0.334 0.368 0.405 0.524 0.646 0.782
kg
210 s 0 0.170 0.215 0.290 0.353 0.387 0.425 0.548 0.663 0.795
清除率/% 6.452 8.065 12.097 16.129 33.065 15.323 –3.226 -13.71
图1 DEAE-Celloluse52对零余子多糖的梯度洗脱曲线
Fig.1 Elution profile of the polysaccharides from bulbil on a
DEAE-Celloluse52 column
3.4 零余子多糖的纯度鉴定
3.4.1 SephadexG-200 柱层析鉴定
图2 SephadexG-200零余子多糖的洗脱曲线
Fig.2 Elution profile of the polysaccharides from bulbil on a
SephadexG-200 column
由图 2 可看出，经过 SephadexG-200 柱层析，只
出现一个多糖吸收峰，证明经过 DEAE-Celloluse52 分
离的多糖为单一的糖。
3.4.2 零余子多糖的紫外扫描图谱
图3 零余子多糖的紫外扫描图
Fig.3 UV spectrum of polysaccharides from bulbil
由图 3 可看出，在紫外区 260 nm 出现了明显的
蛋白质吸收峰，这证明在多糖中仍含有蛋白质类成分，
但蛋白质与多糖的结合方式有待于进一步研究。
3.4.3 零余子多糖的红外扫描图谱
由零余子多糖的红外扫描图谱可看出，在
3500~3300 cm-1 出现的吸收峰主要是由多糖的配糖体
羟基(缔合) 的伸缩振动引起的[7]；2927cm-1 处的吸收
峰与碳氢键的伸缩振动相对应；在 1200~1000 cm-1的
一组吸收峰与羟基的 C-O 伸缩振动相对应；1250~950
cm 之间存在吸收峰，提示糖链构型为吡喃型；810
cm-1处无特征吸收，表明多糖糖基中不存在甘露糖[8]。
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2008, Vol.24, No.11
1103
图4 零余子多糖的红外光谱
Fig. 4 IR spectrum of polysaccharides from bulbil
4 结论
4.1 不同浓度的乙醇沉淀的多糖得率有所不同，零余
子中以 30%的乙醇沉淀的得率最高。
4.2 用 30%乙醇沉淀的多糖对超氧自由基的清除率
随着多糖浓度的增加而增加，但是用 60%乙醇沉淀的
多糖对超氧自由基的清除率却正好相反，随着浓度的
增加而降低，当多糖浓度增加到一定程度的时候，对
超氧自由基具有了促进作用。
4.3 用DEAE-Celloluse52分离纯化零余子多糖，NaCl
梯度洗脱，得到的多糖经 SephadexG-200 证明为单一
的糖，但紫外扫描表明这些多糖类物质有可能是和蛋
白质结合到一起。
4.4 本文只进行了零余子两种粗多糖在体外对超氧
自由基的清除作用，而纯化多糖对其作用还有待于进
一步研究。
参考文献
[1] 中国科学院.中国植物志·16 卷:第一分册[M],北京:科学出
版社,1985
[2] 赵冰.山药栽培新技术.北京:金盾出版社,1998:31-40
[3] 孙锋,谷文英,丁霄霖.山药粗多糖的提取工艺[J].食品与生
物技术学报,2006,(3):
[4] 李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].高等教育出版
社,2000年7月第一版：
[5] 萧能庚,余瑞元,生物化学实验原理和方法[M],北京大学出
版社,2008(2):92-95。
[6] 程超,李伟.几种植物水溶性多糖的体外抗氧化作用[J].食品
工业科技,2006,27(9):63-65
[7] 方幼兰,刘艳如.凤尾菇子实体多糖的提取及其部分性质[J].
中国食用菌,2004,22(5):43-45
[8] 刘娟,彭仁磅,乐江,等.当归多糖的分离纯化及其部分理化
性质的研究[J].华西药学杂志,2004,19(6):412-414
（上接第1110页）
由图 6 可以看出，加酶量对反应速度起着决定性
的作用，随着加酶量的增大反应速度不断加快。当加
酶量大于 15 U/mL 时，继续增大酶的用量底物转化率
没有明显提高，说明继续增加酶用量对反应的影响不
显著，而且加大酶的用量会导致成本的增加。因此选
用最佳的加酶量为 15 U/mL。
3 结论
在磷酸盐缓冲液体系中，利用自制的 β-呋喃果糖
苷酶催化甜菊糖与蔗糖进行转果糖基反应，对甜菊糖
进行改性。通过单因素实验确定了较好的反应条件为：
pH 6.5，反应温度 40 ℃，St、RA 与蔗糖的摩尔比分
别为 0.007、0.003，加酶量 15 U/mL，反应时间 15 h。
在此反应条件下，St 和 RA 的转化率分别为 63.6%和
63％。甜菊糖作为新型甜味剂具有巨大的发展潜力，
以上研究探讨了甜菊糖的酶法改性，为去除其后苦味
提供了理论与工业化基础。
参考文献
[1] 张雪颖,徐仲伟,战宇,等.甜叶菊水提取液的絮凝研究[J].现
代食品科技,2007,23(2):8-10
[2] Hanson, J.R., de Oliveira, B.H.. Stevioside and related sweet
diterpenoid glycosides[J]. Nat. Prod. Rep., 1993, 10:301-309
[3] Geuns, J.M.C. Stevioside[J]. Phytochemistry,2003,64: 913-
921
[4] 马健标,史作清,何炳林.甜菊甙的结构改造与构味关系[J].
中国调味品,1989,10:5-8
[5] Ishikawa, H., Kitahata, S., Ohtani, K., et al. Production of
stevioside and rubusoside derivatives by transfructosylation
of beta-fructofuranosidase[J]. Agric. Biol. Chem.,1990, 54:
3137-3143
[6] Prenosil, J. E., Stuker, E., Bourne, J. R.. Formation of
oligosaccharides during enzymatic lactose hydrolysis and
their importance in a whey hydrolysis process: part II.
experimental[J]. Biotechnol. Bioeng., 1987,30: 1026-1031
[7] Yang, S. T., Okos, M. R. Effects of temperature on lactose
hydrolysis by immobilized galactosidase[J]. Biotechnol.
Bioeng.,1989,33:873-885