全 文 ：　　文章编号: 0412-0914( 2000) 02-0171-05
落葵上发现短小杆菌属 (Curtobacterium )
一个新的致病变种
陈永芳* ,　郭坚华 ,　方中达
(南京农业大学植保系病虫监测与治理农业部重点开放实验室 , 南京 210095)
摘要: 1994年在江苏省南京及镇江地区新发现了落葵细菌性叶斑病 ,从病斑所分离的 10个细菌菌
株经柯赫氏法则验证 ,均确系该病的病原菌。 采用形态观察、表型特征和生理生化特性测定、数值分
析、血清学反应、细胞化学成分分析和 DNA G+ C mol%测定进行了鉴定 ,并与植物病原棒形细菌 15
个标准菌株进行了比较。 该病原菌为革兰氏阳性细菌 ,不规则短杆状 ,有一根鞭毛 ,亚极生或侧生 ,结
合其生理生化特性、细胞化学成分和 DNA G+ C mo l%测定结果 ,认为应属于短小杆菌属
(Curtobacterium )的萎蔫短小杆菌 (Cur. f laccumfaciens) ,数值分析也支持这一结论。 此外 ,据血清学
反应结果及其对短小杆菌属的其它植物寄主的致病情况 ,认为该病原菌应是萎蔫短小杆菌种下一个新的
致病变种 ,定名为 Curtobacterium f laccumfaciens pv . basellae pv. nov . (萎蔫短小杆菌落葵致病变种 )。
关键词: 落葵 ; 细菌性叶斑病 ; 鉴定 ; 萎蔫短小杆菌 ; 致病变种
中图分类号: S436. 3　　　　文献标识码: A
A NEW PATHOVAR OFCurtobacterium f laccumfaciens ON MALABAR SPINACH
CHEN Yong-fang, GUO Jian-hua, FAN G Zhong-da
( Nan jing Agricul tural Univ ersi ty , Nanjing 210095, China)
Abstract: Bacterial leaf spo t disease of malabar spinach (Basella rubra ) was discovered in Jiangsu
Province in 1994. The disease has no t been reported before. Ten isolates were identified by the
means of classical methods, numerical analysis , cellular composi tion analysis , and DNA G+ C mol
% . The pathogen i s Gram-posi tiv e, i rregula r shor t rods. Lateral or subpolar flagella a re observed
in all the isolates. The DNA base composi tion is 69. 952 mol% G+ C. The resul ts show that the
characteris tics of the pathogen are consis tent with those of Curtobacterium f laccumfaciens .
According to the serological reaction as w ell as the pathog enici ty o f the isolates to other plant
hosts of the g enus, the pathogen is considered to be a new pathovar of the species. The nam e
sugg ested is Curtobacterium f laccumfaciens pv. basel lae pv. nov.
Key words: malabar spinach (Basel la rubra ) ; bacterial leaf spo t disease; identification;
Curtobacterium f laccumf aciens; pathova r
　　落葵 (Basella rubra , 又名木耳菜、紫豆藤、豆腐菜、胭脂菜等 )是我国重要的蔬菜和药用植
物 , 1994年在江苏省南京及镇江地区发现了落葵细菌性叶斑病 ,叶斑近圆形 ,直径 1～ 3 mm不
等 ,边缘紫褐色 ,病斑中部干枯 ,与落葵蛇眼病症状 [1 ]相似 ,但较其发病轻 ,病斑扩展不明显 ,紫褐
　　收稿日期: 1998-12-17;修回日期: 1999-08-14
　　基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39570476)
　　* 现通讯地址:中国农科院植保所 , 北京 100094
　　作者简介:陈永芳 ( 1970— ) ,女 ,山西省介休市人 ,中国农科院植保所博士后 ,主要从事植物病理学研究。
第 30卷　第 2期
2000年　 5　 月 植　物　病　理　学　报ACTA PHYTO PATHOLOGIC A SIN ICA 　Vo l. 30　 No. 2　 May 　　 2000
DOI : 10. 13926 /j . cnki . apps . 2000. 02. 014
色晕圈较窄 ,有时这 2种叶斑可同时出现于叶片上 ,将细菌性叶斑切下镜检 ,可见大量细菌溢出。
该病在国内外均无报道。本文报道其病原菌致病性、表型特征、生理生化特性、数值分析、血清学
反应、细胞化学成分分析和 DNA G+ C mol%测定的研究结果 ,以确定其分类地位 ,为该病害的
防治提供科学依据。
1　材料和方法
1. 1　试验菌株
选取病叶上的初期病斑作为分离材料 ,在 NA平板上划线、稀释分离 ,置 28℃下培养 ,第 4 d
挑取单菌落纯化。 选 10个菌株 ,保存于灭菌蒸馏水中及冷冻干燥待用 [ 2]。试验用菌株情况见表 1。
表 1　试验菌株及来源
Table 1　 Strains used
菌株 ( St rain )　　　 代号 ( No. ) 寄主 ( Hos t ) 主要症状 ( Symptom) 来源 ( Source)
落葵细菌性叶斑病菌 ( Pathogen of
malabar spinach leaf spot dis ease)
BR1-10 落葵 ( Malabar spinach) 叶斑 ( Leaf spot ) 南京 ( Nanjing )
糖甜菜细菌性叶斑病菌 ( Pathogen
of sugar beet leaf spot dis ease)
CV 30 糖甜菜 ( Sugar beet ) 叶斑 ( Leaf spot ) 内蒙 ( Neim eng )
Cu rtobacterium f laccumf aciens
pv. f laccumf aciens
2584 菜豆 ( Bean) 萎蔫 (Vascular wi lt ) ICM P*
Cu r. f . pv. betae 2594 红甜菜 ( Red beet ) 银叶 ( Si lvering) ICM P
Cu r. f . pv. poinsett iae 2566 一品红 ( Poinset tia) 茎溃疡 ( Stem canker) ICM P
Cu r. f . pv. oort ii 2632 郁金香 ( Tulip) 溃疡 ( Leaf and bulb canker) ICM P
Clavibacter mich iganense subsp.
michig anense
2550 番茄 ( Tomato) 溃疡 ( Canker) ICM P
Cl . m . su bsp. nebraskense 3298
玉米
Maize
萎蔫、疫病、叶斑
Wilt , Blight , Leaf spo t
ICM P
Cl . m . su bsp. insidiosum 2621 苜蓿 ( Alfalfa) 萎蔫 (Vascular wi lt ) ICM P
Cl . m . su bsp. tessela rius 7221 小麦 ( Wheat ) 花叶 ( Leaf mosaic) ICM P
Cl . m . su bsp. sepedonicum Mahuan 马铃薯 ( Po tato) 环腐 ( Ring ro t) 中国 ( China)
Cl . rathayi 2574 鸭茅草 ( Cocks foo t grass )蜜穗 ( Gumming seed heads ) ICM P
Cl . iranicum 3496 伊朗小麦 ( Iran wh eat ) 蜜穗 ( Gumming seed heads ) ICM P
Cl . tri tici 2626 小麦 ( Wheat ) 蜜穗 ( Gumming ears, leaves) ICM P
Cl . f angi i Ta-19 小麦 ( Wheat ) 苗枯 ( Seed ling wi th ered) 扬州 ( Yang zhou)
Rhodococcus fascians 5833 甜豌豆 ( Sw eet peas) 带化 ( Fasciat ion) ICM P
Ar throbacter il icis 2607 美国冬青 ( American h olly) 疫病 ( Bligh t) ICM P
　　* ICM P: International Col lection of Micro-Organisms f rom Plan ts ( New Zealand) .
1. 2　致病性测定
采用摩擦法和针刺法接种 ,供试植物有落葵、菜豆、大豆、甜菜、郁金香、一品红 [3 ]。
1. 3　细菌形态和培养特征
在 PDA、 NA、 D2培养基 [3 ]上观察菌落形态、颜色、质地等 ,电镜观察菌体及鞭毛 [2 ]。
1. 4　生理生化特性
参照有关文献进行 [2, 3 ]。
1. 5　数值分析
用平均连锁聚类法分析 93项生理生化及表型性状 ,获得菌株间相似系数 ,绘出树状图 [3 ]。
1. 6　血清学反应
以 BR10为免疫原 ,按常规方法免疫实验兔。 在试管凝集反应效价达 1∶ 1280时颈动脉采
血 ,用琼脂双扩散方法进行测定 [2 ]。
172 植　　物　　病　　理　　学　　报 30卷
1. 7　细胞化学成分分析
　　采用 SDS-PAGE进行全细胞水溶性蛋白质电泳 [ 3] ;胞壁氨基酸分析和磷酸类脂分析参照 Lechevalier
的方法 [4 ] ;全细胞糖组分分析参照 Hasegaw a的方法 [5 ] ;甲基萘醌分析参照吴诚华的方法 [6 ]。
1. 8　 DNA G+ C mol%测定
主要参照 Marmur [7 ]的方法进行。
2　结　　果
2. 1　致病性测定
10个落葵菌株接种后 7～ 10 d,只有落葵叶片斑点扩展 ,且出现与原始症状类似的色与形 ,
而其它植株均无反应 ,与灭菌水接种相似。 从接种产生的落葵病斑可镜检到细菌溢 ,分离所得的
菌株与原始菌株一致。交互接种的结果 Curtobacterium f laccumf aciens的 4个致病变种均只能使
自己原先相应的寄主发病 ,对落葵没有影响。
2. 2　细菌形态和培养特征
细菌呈短杆状 ,直、微弯或楔形 ,大小为 0. 3～ 0. 6μm× 1. 0～ 3. 0μm,单细胞为主 ,弯曲分
裂 ,出现一些 V型菌 ,部分运动 ,具 1根鞭毛 ,亚极生或侧生 ,无芽孢 , D2上培养 4 d后细菌由短
杆状变为椭圆形。在 NA平板上分离 ,第 4 d长出可见菌落 ,圆形、隆起、光滑、全缘、黄色 ;在 PDA
培养基上生长较慢、色浅 ,而在 D2培养基上生长较快 , 36 h即可长好。
2. 3　其它表型特征和生理生化特性试验
革兰氏阳性。好气 ,接触酶阳性。不抗酸。需要生长因子 ,最适生长温度 24～ 27℃。能从葡
萄糖、蔗糖、果糖、纤维二糖、阿拉伯糖、半乳糖、丙三醇、肌醇、甘露糖、甘露醇、麦芽糖、蜜二糖、棉
子糖、鼠李糖、水杨苷和木糖氧化产酸 ,但不能从山梨糖、山梨醇、肝糖、淀粉、甜醇、赤丝草醇、侧
金盏醇产酸。 可以利用甲酸、乙酸、苯甲酸、谷氨酸、酒石酸、果胶酸、柠檬酸、琥珀酸、丁二酸等作
为碳源。 不还原硝酸、不产生吲哚 、氧化酶、脲酶 ,不液化明胶、不从蛋白胨产生氨 ,可水解酪蛋
白、淀粉、七叶苷和 Tw een80,可从半胱氨酸、胱氨酸及硫代硫酸钠产 H2 S。
　　具有鉴别性的试验结果见表 2。
表 2　落葵叶斑病菌与其它棒形细菌的鉴别性试验*
Table 2　 Dif ferential characteristics of BR and some other coryneform bacteria
试　验 ( Test ) BR1-10 2584 2594 2566 2632 2550 5833 2607
鞭毛
Flagellum
1根 ,亚极
生或侧生
1, subpo la r
o r la tera l
1～ 3根 ,极
生或侧生
1- 3, po lar
or la tera l
3根 ,周生
或极生
3, peritr icha te
o r pola r
1～ 2根 ,极
生或侧生
1- 2, polar
o r la teral
1根 ,
极生
1, po lar
无
None
无
N one
无
None
色素 ( Pigment ) 黄 ( Y) 黄、橙黄、紫 ( Y, O, Pu) 黄 ( Y) 粉红 ( Pi ) 黄 ( Y) 黄 ( Y) 橙黄 ( O) 黄 ( Y)
产酸
Acid f orm
核糖 ( Ribose) - - - - - - + -
山梨醇 ( So rbitol ) - - - - - - + -
菊粉 ( Inulin) + + + + + - - -
纤维二糖 ( Cellobiose) + + + + + + - +
棉子糖 ( Raf fino se) + + + + + - - -
利用
Utiliza tion
乙酸 ( Acetat e) + + - + - - + +
甲酸 ( Fo rmat e) + W W + - - + +
水解
Hydrolization
七叶苷 ( Esculin) + + + + + + - +
酪蛋白 ( Casein) + - - - - - - +
Tween80 + + + + + - + -
　　* “+ ”表示阳性反应 ,“ - ” 表示阴性反应 ,“W”表示弱阳性反应。
“+ ” po si tiv e reaction; “- ” negativ e reaction; “W” weak reaction; “ Y” yellow; “ O” o range; “ Pu” purple; “ Pi” pink.
1732期 陈永芳等: 落葵上发现短小杆菌属 (Curtobacterium )一个新的致病变种
2. 4　数值分析
不同菌株间相似系数及树状图见图 1。 落葵菌株以 87%的相似性与短小杆菌属的 4个致病
变种归在 1个分类簇中。
图 1　植物病原棒形细菌数值分析树状图
Fig . 1　 The dendrog ram o f the plant pathogenic co rynefo rm bacteria
图 2　琼脂双扩散试验
Fig. 2　 Ouch terlong gel
double diffusion test
(抗体 Antibod y: BR10;抗原 An tig en:
1. BR10, 2. BV 30, 3. 2566,
4. 2584, 5. 2594, 6. 2632)
2. 5　血清学反应　用 BR10制备的抗血清在琼脂双扩散反应中
与所有落葵菌株都形成白色沉淀线 ,与其它菌株间则都不产生。见
图 2。
2. 6　细胞化学成分分析
落葵菌株的全细胞水溶性蛋白质电泳图谱与 2584、 2594、
2566、 2632这 4个萎蔫短小杆菌致病变种基本相似 ,但与
Clavibacter属菌株 2550、 5833及 2607的电泳图谱则差异明显。落
葵叶斑病菌 BR10细胞壁中的特征性双碱基氨基酸为鸟氨酸
( Orn) ;全细胞糖组分为鼠李糖、木糖、半乳糖和葡萄糖 ;磷酸类脂
属 PIV型 , 组分为 GluN us; 醌组分按主次排列为: M K-9、 M K-8
( H2 )、 MK-8。 以上结果均与短小杆菌属相符 ,见表 3。
2. 7　 DNA G+ C mol%
落葵叶斑病菌 DNA的 G+ C mol%为 69. 952 mo l% ( Tm= 89. 2℃ ) ,正在短小杆菌属细菌
的 DNA G+ C mo l%值范围内。
3　结论与讨论
国际植物病理学会 ( ISPP)的植物病原细菌分类委员会于 1980年提出植物病原细菌致病变
种的国际标准: 致病变种是亚种以下的分类单位 ,也称致病型 ,指一个菌株或具有相同或相似特
征的菌株 ,与同一个种或亚种的其它菌株在致病性方面 (包括危害症状、寄主范围 )有区别 ,还可
以存在生物化学的、血清学的或其它非致病性特性方面的区别 ,但这些区别与致病性区别相比在
分类上是次要的 [10 ]。
174 植　　物　　病　　理　　学　　报 30卷
表 3　落葵叶斑病菌与植物病原棒形细菌已知属的细胞化学成分
Table 3　 Chemical compositions of BR and genus of plant pathogenic coryneform bacteria
性状 ( Characteris tics) BR10 Cu rtobacterium* Clavibacter* A rthrobacter* Rhodococcus*
特征性肽聚糖氨基二羧酸
Diamino acid in peptidoglycan
鸟氨酸 Orn. 鸟氨酸 Orn. 二氨基丁酸 DAB 赖氨酸 Lys 二氨基庚二酸 DAP
胞壁肽聚糖类型 ( Cell w all
peptid og lycan type)
B2β B2β B2γ A3α A1γ
主要甲基萘醌
异戊二烯单位
Major menaquinones
M K-9 MK-9 M K-9
M K-10
MK-9( H2 ) M K-9( H2)
M K-8( H2)
磷脂酰肌醇 ( PI)和磷脂
酰肌醇甘露糖苷 ( PIM )
PI& PIM
— — — PI PIM
细胞糖类 ( Cellular sugars )
鼠李糖 ( rha)、木糖
( xyl )、葡萄糖 ( glu)、
半乳糖 ( gal )、阿拉
伯糖 ( ara)
rh a
xyl
glu
gal
rh a
x yl
g lu
gal
rha
xyl
glu
gal
glu
gal
glu
g al
ara
DN A G+ C mol% 69. 952 68. 3～ 75. 2 67～ 78 59～ 66 60～ 69
　　* 参照文献 8, 9。 ( From reference 8& 9. )
　　落葵叶斑病病原细菌的形态、染色反应、鞭毛着生情况、菌落特征及生理生化特性等结果均
同短小杆菌属细菌相似 ,结合其细胞化学成分分析和 DNA G+ C mol% ,该菌应属于短小杆菌属
的萎蔫短小杆菌 (Cur . f laccumf aciens ) ,而血清学反应及致病性测定均表明该病原菌与 Cur.
f laccumf aciens的任一致病变种都不相同。 短小杆菌属植物病原细菌的寄主分属于豆科、藜科、
大戟科和百合科 ,落葵属于落葵科。据上文致病种定义 ,可将落葵叶斑病病原细菌作为 Cur.
f laccumf aciens种下一个新的致病变种 ,提议定名为 Curtobacterium f laccumfaciens pv . basellae
pv . nov . (萎蔫短小杆菌落葵致病变种 )。
参 考 文 献
[1 ]　吕佩珂 ,李明远 ,吴钜文 .中国蔬菜病虫原色图谱 [M ] .北京: 农业出版社 , 1992. 171-172.
[2 ]　方中达 .植病研究法 [M ].北京:农业出版社 , 1979. 161-222.
[3 ]　任欣正 .植物病原细菌的分类和鉴定 [M ] .北京:农业出版社 , 1994. 9-71, 191-211.
[4 ]　 LECHEV ALIER M P, L ECHEV ALIER H A. A universi ty labo ratory approach [ A] . DIET Z A, et a l. Actinomyces ta-
xonomy [M ]. Arlington: SIM Spec. Publ. , 1980. 170-178.
[5 ]　 HASEGAWA T, T AKIZAW A M, T AN IDA S. A rapid analysis for chemical grouping of aerophi lic act inomycetes [ J ].
J. Gen. Appl. M icrobiol. , 1983, 29: 319-322.
[6 ]　吴诚华 ,陆晓涛 ,秦敏 ,等 .高效液相色谱 ( HPLC)用于微生物中醌的分析 [ J ].微生物学通报 , 1989, 16( 3): 176-178.
[7]　 M ARM UR J, DO TY P J. Determinat ion of bas e composi ti on of deoxyribonucleic acid f rom i ts thermal d enaturation
temperatu re [ J]. J. M ol. Biol. , 1962, 5: 109-118.
[8 ]　 COLLINS M D, JON ES D. Reclassi fi cation of Corynebacterium f laccumfaciens , C. betae, C. oorti i and C . poinsettiae in
th e g enus Cu rtobacterium , as Cur tobacter ium f laccumfaciens comb. Nov [ J ] . J. Gen. M icrobiol. , 1983, 129: 3545-
3548.
[9]　 SNEATH P H A. Bergey s manual of sys tematic bacteriology [M ]. v. 2. Baltimore: Wil liams & Wilkins, 1986. 1261-
1479.
[10 ] YOUNG J M, TAKIKAW A R, G ARDAN L, et al . Ch anging concept in th e taxonomy of plan t pathogenic bacteria [ J ].
Annu. Rev. Ph ytopathol. , 1992, 30: 67-105.
1752期 陈永芳等: 落葵上发现短小杆菌属 (Curtobacterium )一个新的致病变种