全 文 ：China Brewing
2016 Vol.35 No．9
Serial No．295
收稿日期：2016-04-26
基金项目：教育部春晖计划项目（Z2014061）；四川省应用基础项目（2014JY0045）；四川省科技支撑计划（2016FZ0023）；四川省教育厅重点
项目（14ZA0110；14Z0107）
作者简介：卢倩文（1992-），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物分子生态。
*通讯作者：向文良（1973-），男，教授，博士，研究方向为中国西南地区特色发酵食品微生物分子生态与生物过程学。
野樱桃（Cerasus tomentosa（Thunb.）Wall.）为蔷薇科
落叶灌木，其果实不仅味道鲜美而且营养成分丰富；富含
维生素C、各种氨基酸、花色素、糖，矿物质锌、铁、钾、锰、
铜等，其中含铁量居水果首位[1-2]。四川阿坝藏区气候冷凉
干燥、日照强烈，昼夜温差大，野樱桃分布十分广泛，在海
拔3 500 m左右均有自然生长，树势健壮，病虫危害极少，
深受消费者的青睐。但野樱桃季节性强，收获期短，一般
为10～15 d[3]，并且在室温下不耐贮藏，因此对其进行深加
工以延长货架期显得十分重要。将野樱桃开发成具有高
附加值的野樱桃酒，不仅可保留野樱桃的大部分营养成分，
延长野樱桃的货架期，而且符合粮食酒向果酒转变的国
家酒类行业政策，又符合追求天然、含糖量少、酒精度低且
有益于健康的果酒世界饮酒潮流[4-5]。
以科学方法酿造而成的野樱桃果酒中，含有丰富的有
机酸，其种类和含量直接影响到野樱桃酒的口感和质量，
还影响到野樱桃酒的颜色和陈酿效果[6-8]。因此建立一种
分析和测定野樱桃酒中有机酸的方法，对野樱桃酒的生产
和研发具有重要意义。目前，果汁和果酒中有机酸的分析
方法主要有滴定法、比色法、酶法、气相色谱法、离子色谱
法、毛细管电泳法和高效液相色谱（high performance liq-
川西藏区天然野樱桃酒中有机酸含量检测方法的构建
卢倩文1，蔡 婷1，秦 佳2，康 辉2，赵婷婷1，张楠笛1，向文良1*
（1.西华大学 食品与生物工程学院，四川省食品生物技术重点实验室，西华大学古法发酵（酿造）生物技术研究所，四川 成都 610039；
2.小金县夹金山天然野樱桃酒业有限公司，四川 阿坝 624000）
摘 要：建立高效液相色谱(HPLC)法对川西藏区天然野樱桃酒中有机酸的种类和含量的检测方法。采用Aminex HPX-87H离子排阻
色谱柱，以7 mmol/L H2SO4溶液(pH 2.20)为流动相，流速为0.6 mL/min，柱温60℃，紫外检测器检测波长为210 nm。经过方法学验证，
该检测方法重现性好、精密度及准确度高，在0.001～2.000 g/L线性范围内线性关系良好(R2＞0.99)，检出限为0.000 6 g/L，加标回收率
为86%～106%，重现性试验、精密度试验和回收率试验的相对标准偏差(RSD)均＜5%，适用于天然野樱桃酒中6种重要有机酸的同时
检测。结果表明，川西藏区天然野樱桃酒样品中含量最高的有机酸是草酸(1.92 g/L)和L-苹果酸(0.78 g/L)，其次是乙酸(0.17 g/L)和酒
石酸(0.18 g/L)，乳酸(0.15 g/L)和柠檬酸(0.15 g/L)含量最少。
关键词：高效液相色谱法；天然野樱桃酒；有机酸；检测
中图分类号：TS262.7 文章编号：0254-5071（2016）09-0154-05 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.035
Establishment of detection method of organic acids contents in natural wild cherry wine in
western Sichuan Tibetan areas
LU Qianwen1, CAI Ting1, QIN Jia2, KANG Hui2, ZHAO Tingting1, ZHANG Nandi1, XIANG Wenliang1*
(1.Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, Institute of Ancient Brewing Technology, College of Food and
Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2.Xiaojin Jiajin Natural Wild Cherry Wine Co., Ltd., Aba 624000, China)
Abstract: A HPLC method for determination of different kinds and contents of organic acids in natural wild cherry wine from western Sichuan Ti-
betan areas was established. Using Aminex HPX-87H ion exclusion chromatography column, 7 mmol/L H2SO4 as mobile phase, flow rate 0.6 ml/min,
column temperature 60 ℃ and detection wavelength 210 nm, the organic acids was determined by HPLC. Through the methodology validation, the
detection method had good reproducibility, high precision and accuracy. The method had a good linear relationship in the range of 0.001-2.000 g/L,
the limit of determination was 0.000 6 g/L, the adding standard recovery rate was 86%-106%, the relative standard deviation of reproducibility, preci-
sion and recovery rate experiments was all less than 5%, which indicated that the method was suitable for simultaneous detection of six kinds of im-
portant organic acids in natural wild cherry wine. The results showed that the highest contents of organic acids in natural wild cherry wine from west-
ern Sichuan Tibetan areas were oxalic acid (1.92 g/L) and L-malic acid (0.78 g/L), followed by acetic acid (0.17 g/L) and tartaric acid (0.18 g/L), the
contents of lactic acid (0.15 g/L) and citric acid (0.15 g/L) were the lowest.
Key words: HPLC; natural wild cherry wine; organic acids; detection
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中 国 酿 造
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uid chromatography，HPLC）法等，其中滴定法[9]、比色法[10]、
酶法[9-10]影响因素较多，准确度较差；气相色谱法[11]样品前
处理繁琐费时；离子色谱[12]不适合做复杂的样品分析；毛
细管电泳法[13]重现性存在明显不足；HPLC法[14-15]是目前有
机酸分析中最成熟、也最常用的方法。
本试验旨在以采摘于川西藏区的天然野樱桃为原
料，通过发酵工艺制备天然野樱桃果酒，优化色谱条件，
建立一种更加方便、快捷的针对川西藏区天然野樱桃酒
中6种重要有机酸（草酸、酒石酸、L-苹果酸、乙酸、乳酸和
柠檬酸）的高效液相色谱法，为野樱桃的精深加工和优化
野樱桃果酒工艺奠定了一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
天然野樱桃：采摘于川西藏区（阿坝州小金县）；天然
野樱桃果酒：西华大学古法发酵生物技术研究所酿造。
蔗糖：市售一级；果胶酶（酶活力10 000 U/g）：美国
Sigma公司；果酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；皂土、
硅藻土：广州市喜亿陇贸易有限公司；过氧酸：西陇化工
股份有限公司；氯化钠（分析纯）：天津市瑞金特化学品有
限公司；草酸、酒石酸（均为色谱纯）：天津市科密欧化学试
剂有限公司；L-苹果酸、柠檬酸（均为色谱纯）：成都西亚试
剂有限公司；乙酸、乳酸（均为色谱纯）：成都华夏化学试剂
有限公司；浓硫酸（分析纯）：重庆川东化工（集团）有限公司。
1.2 仪器与设备
LPS-5离心式破碎机：旭郎机械成都分公司；WBL25C56
榨汁机：美的（Midea）集团股份有限公司；5L发酵罐、陈酿
罐：镇江汇能达生物工程设备有限公司；SW-CJ-2F双人洁
面净化工作台：苏州净化有限公司；DHP-9052电热恒温培
养箱：上海益恒实验仪器有限公司；JA2003电子天平：舜宇
恒平仪器有限公司；pHS-3C酸度计：成都世纪方舟科技有限
公司；Waters 2698高效液相色谱仪（2695紫外检测器）：美国
Waters公司；Aminex HPX-87H离子排阻色谱柱：BIO-RAD
公司；UPH-Ⅱ-5T超纯水机：四川优普超纯科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 野樱桃果酒加工工艺流程及操作要点[16-18]
果胶酶 加SO2
↓ ↓
新鲜的野樱桃→分选→清洗→破碎打浆→原汁→离心分
离→调配→接种活化酵母→发酵→澄清→陈酿→贮存→过滤→
野樱桃酒
操作要点：
原材料预处理：挑选新鲜、颜色鲜红、成熟度高、无腐
烂的野樱桃为原料，用流速为5 m3/h的流动清水洗净后，
再用0.2%～0.3%过氧酸杀菌水溶液浸泡1 min后，用流动
清水清洗，沥水40～50 min。
添加SO2及果胶酶处理：为抑制杂菌的生长繁殖，野
樱桃打浆后应立即添加0.10～0.15 g/L SO2（120 mg/L的偏
重亚流酸钾）。添加SO2约5 h后再添加0.1～0.3 g/L果胶酶
（10 000 U/g）增强澄清效果和提高出汁率，果胶酶可以软
化果肉组织中的果胶物质，使之分解生成半乳糖醛酸和果
胶酸，使果汁中的固形物失去依托而沉降下来。
调配：添加蔗糖调整发酵培养基中的糖含量为17%～
20%，用柠檬酸将培养基的pH值调至4.0～5.0。
发酵：将成分调整好的发酵液置于发酵罐中，然后加
入0.03%的酵母菌进行发酵主发酵温度为24～28℃，时间
为16 d，后发酵温度为16℃，发酵时间为28 d。
澄清处理：野樱桃果酒用0.2～0.4 g/L的皂土进行下
胶处理，7～8 d后进行转罐，同时采用硅藻土过滤，再将澄
清处理后的果酒采用错流膜过滤系统处理，操作参数为：
透膜压差0.13～0.15 MPa，错流切向速度4～6 m/s，过滤时
间1～2 h，酒液温度-0.5～-0.1℃和反冲间隔2～4 min。
陈酿：将澄清处理后的酒液在12～15℃陈酿3～6个
月，使成品的风味得到改善，形成典型的野樱桃果酒风味。
1.3.2 高效液相法检测色谱条件
色谱柱：Aminex HPX-87H离子排阻色谱柱（300 mm×
7.8 mm，9 μm），流动相：7 mmol/L的H2SO4溶液（pH值为
2.20），流速：0.6 mL/min，紫外检测波长：210 nm，柱温：
60℃，进样量：20 μL。
1.3.3 样品预处理及标准溶液的配制
样品预处理：取一定量的成品野樱桃酒经0.45 μm微
孔滤膜过滤，收集滤液待测。
有机酸标准品溶液：分别称取草酸、酒石酸、L-苹果酸、
乙酸、乳酸和柠檬酸各0.5 g，加超纯水溶解并分别定容到
50 mL容量瓶中，配制成质量浓度为1 g/L的6种有机酸的标
准储备液，经0.45 μm滤膜过滤，作为定性工作液使用。
有机酸混合标准品溶液：分别精密称取草酸0.201 0 g、
酒石酸0.100 2 g、L-苹果酸0.101 2 g、乙酸0.100 3 g、乳酸
0.101 1 g、柠檬酸0.101 4 g用超纯水溶解于同一烧杯中，定
容到100 mL容量瓶中，经0.45 μm滤膜过滤，作为定量工
作液使用。
1.3.4 定性定量方法
定性方法：分别将6种有机酸标准品按照1.3.2的色谱
条件进行分析，以出峰时间定性确定不同的有机酸。
定量方法：将处理好的样品按照1.3.2的色谱条件进行
分析，以出峰面积定量确定不同有机酸的含量。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的确定
2.1.1 检测波长的确定
取有机酸混合标准溶液进行光谱扫描，扫描结果见
图1，结果表明，6种有机酸在210 nm附近有较大的吸收，重
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图2 有机酸混合标准品(A)及野樱桃果酒样品(B)的高效液相色谱图
Fig. 2 HPLC chromatogram of organic acids mixed standards (A)
and the wild cherry wine sample (B)
复性好，且硫酸溶液在波长210 nm处几乎没有紫外吸收，
故采用210 nm的紫外波长进行检测。
2.1.2 色谱柱的选择
在果酒中有机酸的检测中，色谱柱的选择尤为关键，
相关文献中使用C18较多，为了使有机酸的分离效果较好，
常常在流动相中要加入一定比例的有机溶剂，如甲醇和乙
腈，这使色谱条件变得比较繁琐[19-20]。本研究采用Aminex
HPX-87H离子排阻色谱柱，该色谱柱是检测有机酸的专
用柱，相比于C18柱而言，不仅可以在短时间内有效地分离
多种有机酸，而且所需的流动相种类单一，大大简化了色
谱条件的选择工作，提高了检测效率[21-22]。
2.1.3 柱温及流动相中H2SO4浓度的确定
柱温和流动相的离子强度对于有机酸的分离效果有
着明显的影响[23-24]。研究了柱温和H2SO4浓度对于草酸、酒
石酸、L-苹果酸、乙酸、乳酸和柠檬酸的分离效果的影响。其
中分别选择45℃、50℃、55℃、60℃、65℃柱温条件，结果表
明，随着温度的升高，6种有机酸的分离度增加，但当温度
超过60℃时，基线漂移严重，因此选择60℃作为测试柱温，
可以有效实现6种有机酸的分离。其他条件不变，考察了不
同H2SO4浓度（3 mmol/L、5 mmol/L、7 mmol/L、9 mmol/L）
对6种有机酸分离效果的影响，结果表明，当H2SO4的浓度
为7 mmol/L时，对6种有机酸的分离达到定量要求，有机
酸混合标品及野樱桃果酒样品的高效液相色谱图见图2。
2.2 标准曲线和线性范围
根据1.3.3方法配制不同浓度有机酸混合对照溶液在
优化色谱条件下，分别以5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL
体积进样，记录峰面积。以有机酸质量浓度（x）为横坐标，
峰面积（y）为纵坐标，绘制各有机酸标准曲线，对标准曲线
进行线性回归，结果见表1。
由表1可知，6种有机酸的相关系数R2均＞0.99，表明
峰面积和有机酸组分质量浓度的线性相关性良好。
2.3 HPLC检测方法学验证
2.3.1 重现性试验
取同一标准有机酸酸样品平行测定5次，测定其峰面
积，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），
结果见表2。6种有机酸保留时间的标准偏差在 0.09～0.18，
RSD均＜2%，表明该方法具有较好的重现性。
2.3.2 精密度试验
取6种有机酸标品混合溶液5 mL，按照优化色谱条
图1 有机酸标准品的紫外吸收光谱扫描图
Fig. 1 Ultraviolet absorption spectrum scannogram of organic acids
standard substance
表1 标准曲线回归方程及线性范围
Table 1 Regression equation and linear range of standard curves
有机酸 回归方程
线性范围/
（g·L-1）
检出限/
（g·L-1）
相关系数
（R2）
草酸 y =4×105x+1×107 0.001～2.000 2.000 0.999 6
柠檬酸 y = 929 311x-878 042 0.001～0.200 0.200 0.996 0
酒石酸 y =1×106x + 640 050 0.001～0.200 0.200 0.995 0
L-苹果酸 y =767 149x-905 178 0.001～0.200 0.200 0.996 3
乳酸 y =492 407x-675 219 0.001～0.200 0.200 0.995 6
乙酸 y =570 167x-741 435 0.001～0.200 0.200 0.995 5
表2 重现性试验结果
Table 2 Results of repeatability experiments
有机酸 草酸 柠檬酸 酒石酸 L-苹果酸 乳酸 乙酸
平均
峰面积
24 650 375 1 808 041 4 228 375 11 030 274 696 559 1 183 662
RSD/% 1.30 1.67 1.56 1.51 1.14 1.22
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件，连续进样5次，记录色谱图，分别计算各有机酸峰面积
的相对标准偏差，结果见表3。由表3可知，6种有机酸检测
结果RSD均＜2%，表明该方法精密度较好。
2.3.3 回收率试验
取成品野樱桃果酒4份，其中1份作为本底，另3份分别
添加高、中、低浓度的草酸、酒石酸、L-苹果酸、乙酸、乳酸、
柠檬酸标准液，进行加标回收率试验，结果见表4。由表4
可知，该方法的回收率在87%～106%之间，RSD均＜3%，表
明该方法准确度较好。
2.4 天然野樱桃酒中有机酸的检测
制备野樱桃果酒，按照优化色谱条件进样，设3次重
复，测定野樱桃酒中有机酸的含量。结果表明，天然野樱桃
酒中有机酸以草酸和L-苹果酸为主，占总酸含量的80.8%，
质量浓度分别为1.920 g/L、0.778 g/L，其中柠檬酸0.145 g/L、
酒石酸0.179 g/L、乳酸0.148 g/L、乙酸0.169g/L。野樱桃酒
中有机酸的含量由高到低依次为：草酸＞L-苹果酸＞酒石
酸＞乙酸＞乳酸＞柠檬酸。
3 结论
以采摘川西藏区生长的天然野樱桃为原料，经过酿
造发酵得到天然野樱桃果酒，利用HPLC法检测到成品酒
中草酸、柠檬酸、酒石酸、L-苹果酸、乳酸和冰乙酸的含量
分别为1.920 g/L、0.145 g/L、0.179 g/L、0.778 g/L、0.148 g/L
和0.169 g/L。本试验采用二极管阵列检测器，Aminex
HPX-87H离子排阻色谱柱，以7 mmol/L的H2SO4溶液（pH值
为2.20）为流动相，流速为0.6 mL/min，检测波长为210 nm，
柱温60℃，6种有机酸在15 min内得到有效分离和定量。本
检测方法样品前处理方法简单，建立了一种快速、便捷、高
效测定野樱桃酒中有机酸的方法，在0.001～2.000 g/L线
性范围内线性关系良好（R2＞0.99），检出限为0.000 6 g/L，
加标回收率为86%～106%，重现性、精密度和加标回收率
试验结果的相对标准偏差（RSD）均＜5%。同时，对川西藏
区的天然野樱桃中的6种主要有机酸进行了定量分析，这
对川西藏区天然野樱桃的后续加工中的品质控制提供了
一定参考。
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表4 加标回收率试验结果
Table 4 Results of adding standard recovery rate experiments
有机酸
本底值/
（g·L-1）
加入量/
（g·L-1）
测定值/
（g·L-1）
回收率/
%
RSD/
%
1.001 2.903 99.4 1.17
5.010 6.891 99.4 0.78草酸 1.920
10.013 12.002 100.6 0.91
1.002 1.210 105.5 2.16
0.203 0.391 102.4 0.64
2.001 2.156 98.9 1.21酒石酸 0.179
4.010 4.204 100.4 1.68
1.004 1.762 98.9 1.24
0.101 0.235 94.4 0.56
1.002 1.128 98.1 2.62
乙酸 0.169
0.101 0.261 96.7 1.56
1.002 1.158 98.9 1.37
2.014 2.270 104.0 1.64
0.201 0.302 87.3 1.23
柠檬酸 0.145
2.003 2.200 102.4 1.35
0.502 1.310 102.3 0.45
L-苹果酸 0.778
5.013 5.820 100.5 1.79
0.148
2.003 2.249 104.6 0.81
乳酸
表3 精密度试验结果
Table 3 Results of precision experiments
有机酸 草酸 柠檬酸 酒石酸 L-苹果酸 乳酸 乙酸
平均
峰面积
22 630 798 4 269 435 6 549 584 3 449 250 2 173 336 2 527 406
RSD/% 1.27 1.56 1.21 1.83 1.78 1.16
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《中国酿造》杂志征稿启事
《中国酿造》创刊于1982年，是由中国商业联合会主管，中国调味品协会及北京食品科学研究院主办的综合性科技期刊。并历次
被评为全国中文核心期刊、中国科技核心期刊、《中国知网》重点收录期刊、《万方数据库》全文收录期刊、《中文科技期刊数据库》来
源期刊、中国学术期刊网络出版总库收录期刊、美国《乌利希期刊指南》（UPD）收录期刊、英国《食品科学文摘》（FSTA）收录期刊、英
国《国际农业与生物科学研究中心》（CABI）收录期刊、美国《化学文摘》（CA）收录期刊、俄罗斯《文摘杂志》（AJ）收录期刊、中国科学
评价研究中心（RCCSE）数据库收录期刊，也是学位与研究生教育的中文重要期刊。
本刊主要面向全国各大高等院校、科研院所、各级党政机关、相关企事业单位的广大专家学者、工程技术人员、本科生、硕士博
士研究生、管理人员等。
《中国酿造》主要栏目有：研究报告、专论综述、创新与借鉴、经验交流、分析与检测、产品开发、酿造文化、海外文摘等。
欢迎踊跃投稿！
网站：www.chinabrewing.net.cn邮箱：zgnzzz@163.com电话：010-83152738/83152308
征稿范围：
（1）新工艺、新技术、新设备在酿造行业的应用；（2）调味品的研发创新与推广应用；（3）调味品产业生产管理及产品质量安全评
价；（4）食品添加剂在酿造行业的应用；（5）现代高新检测技术在酿造行业的应用；（6）酿酒产品开发、生产管理及产品质量安全的控
制；（7）发酵法制备酒精、氨基酸、高级醇及有机酸等工艺研究；（8）微生物发酵工艺及培养基发酵条件优化；（9）发酵工程菌种的筛
育与人工诱变、杂交选育及基因工程改造研究；（10）生物质能源的开发利用及规模化制备；（11）传统发酵食品生产工艺改进、微生
物菌种改良、发酵机理及规模化生产研究；（12）食品及发酵工业废水、废渣处理及综合利用；（13）益生菌及功能型发酵乳制品研究
与开发；（14）行业实用技术、政策、法规、标准及行业动态和最新举措等。
注意事项：
（1）来稿要求论点明确、数据可靠、逻辑严密、文字精炼。在文稿首页用脚注说明论文属何项目、何基金（编号）资助，本刊将优先
报道国家级、省部级及国际合作项目的科研成果；第一作者及通讯作者（一般为导师）简介（包括姓名、出生年月、性别、职称、学位、
研究方向或目前主要从事的工作、邮箱、联系电话）。（2）稿件要求8000字以内，须有中图分类号，文献标志码，中英文标题、单位、作
者，并有200～300字的中英文摘要和5～8个关键词，标题、摘要、表题、图题请用中英文对照。摘要内容应包括研究目的、方法、结果
和结论；综述文章可写指示性摘要。（3）来稿内容涉及配方时，应写明配料的名称和配比，勿用代号；工艺过程要完整，不要省略；插
图、表格需放在正文相应地方，不要集中；引用的图表要有出处，计量要用法定单位。（4）文稿参考文献一般研究论文约25篇参考文
献，不可少于20篇，综述论文不少于35篇。研究性论文和综述性论文中近5年文献不少于参考文献总数的一半，外文文献不少于5篇，
期格式请参照GT/T 7714—2005《文后参考文献著录规则》。（5）来稿必须是最新的、作者自身创造性的科研成果，且是在中外文正式
刊物上未发表的论文。本刊严禁一稿多投、重复内容多次投稿、不同文种重复投稿。（6）我刊以实现对所有来稿的文字复制比对工
作，若文字复制比超过30%的稿件我刊不予采用。（7）稿件一经录用，即被认为同意收录于《中国学术期刊（光盘版）》、万方数据库等，
同意入编数据库及上网发布，与此有关的作者著作权使用费与稿酬一次性给付。作者如有异议，请在投稿时声明。
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