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栗叶蛋白闪式提取工艺优化
李雅松，蔺立杰，呼 娜，欧阳杰，王丰俊，王建中*
( 北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083)
摘 要:探讨了闪式提取栗叶蛋白的工艺。运用 Box－Behnken 实验设计方法，在单因素实验的基础上，以栗叶蛋白得
率为实验指标，研究料液比、pH、闪提温度以及闪提时间及其交互作用对栗叶蛋白得率的影响。实验结果表明，栗叶蛋
白的最佳提取工艺参数为: 料液比 1∶27( g /mL) ，pH11，闪提温度 50℃，闪提时间 3.6min。在本实验中 4 个因素对栗叶
蛋白提取得率作用的大小依次为: pH ＞闪提时间 ＞闪提温度 ＞料液比。在此条件下，栗叶蛋白提取得率达到 11.89%。
关键词:栗叶，蛋白质，闪式提取
Homogenate extraction process of leaf protein
from leaves of Castanea mollissima
LI Ya－song，LIN Li－jie，HU Na，OUYANG Jie，WANG Feng－jun，WANG Jian－zhong*
( College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)
Abstract: Homogenate extraction of leaf protein( LPC) from leaves of Castanea mollissima was studied.By the Box－
Behnken experimental design method，the effects of the solid / liquid，pH，temperature and extraction time and their
interactions on the LPC yield were studied on the base of the single－ factor test.The test results showed that the
optimum conditions of extraction for LPC were as following : the solid / liquid 1∶27( g /mL) ，pH11，temperature 50℃，
extraction time 3.6min.The influence order of factors to protein extracting rate is pH ＞ extraction time ＞ temperature
＞ solid / liquid.Under these conditions，the rate of LPC extraction reached 11.89%
Key words: leaves of Castanea mollissima; protein; homogenate extraction
中图分类号:TS219 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2013)11－0243－06
收稿日期:2012－12－07 * 通讯联系人
作者简介:李雅松( 1987－ ) ，男，硕士研究生，研究方向:农产品加工与
贮藏工程。
基金项目:林业公益性行业科研专项( 201204401) 。
板栗(Castanea mollissima)属壳斗科(Fagaceae)
栗属植物，是我国栽培最广的果树之一［1］，栽培面积
111 万 hm2，年产量 100 万 t［2］。栗叶为板栗的叶子，
除少量药用［3］外，多数被废弃，不仅浪费资源，还遗留
火灾隐患。目前对栗叶化学成分的研究主要是挥发
性物质、酚类以及多糖成分的研究［4－7］，对其蛋白成
分的研究，迄今未见报道。栗叶蛋白开发是值得重
视的课题，对于缓解我国饲料蛋白质短缺的矛盾，有
着十分积极的意义［8－9］。本研究以板栗叶为材料，采
用闪式提取技术［10］，在单因素实验研究基础上，利用
响应面分析法［11］优化栗叶蛋白碱溶酸沉工艺条件，
以期为栗叶蛋白的综合利用以及深度开发提供科学
依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
板栗叶 采于河北省唐山市迁西县，采集时间
为十月，板栗品种为燕山早丰，清水洗净后，自然风
干，由粉碎机粉碎过筛后，备用;标准牛血清白蛋白、
考马斯亮蓝 G－250 美国 AMRESCO 公司;氢氧化
钠、盐酸、乙醇、磷酸 分析纯。
JHBE－50S闪式提取控制器 郑州金星科技有
限公司;PHS－25pH 计 上海精密科学仪器有限公
司;LL1500 冷冻干燥机 赛默飞世尔科技公司;752
型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公
司;FA10004A 电子天平 精天精密仪器厂;数控超
级恒温槽 宁波新芝生物科技股份有限公司;气引
式粉碎机 佑崎有限公司;台式离心机 上海安亭
科学仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 栗叶蛋白提取工艺
1.2.1.1 工艺流程 栗叶粉末→加水→预闪提→调碱→
闪提→离心→等电点沉淀→冷冻干燥→栗叶蛋白粉。
1.2.1.2 操作要点 取一定量栗叶粉末与一定温度
的蒸馏水按一定料液比混合，然后用闪式提取器预闪
提 30s使栗叶粉末与蒸馏水完全混溶，再用 5mol /L
NaOH调至一定 pH，闪提一定时间后，以 3000r /min
离心 10min。沉淀物再重复提取一次，合并 2 次上清
液，用 1mol /L HCl调 pH至等电点以沉淀蛋白质，经
3000r /min离心 10min，弃除上清，沉淀以蒸馏水洗涤
3 次后真空冷冻干燥，即得栗叶蛋白粉。
1.2.2 单因素实验
1.2.2.1 料液比的确定 分别设定料液比为 1 ∶15、
1∶20、1∶25、1∶30、1 ∶35(g /mL) ，pH 为 10.0，闪提温度
40℃，闪提时间 3min，研究料液比对蛋白质得率的影
244
响，确定最佳的料液比。
1.2.2.2 pH的确定 设定料液比为 1 ∶30，分别选择
pH为 8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，闪提温度 40℃，闪
提时间 3min，研究 pH对蛋白质得率的影响，确定最
佳 pH。
1.2.2.3 闪提温度的确定 设定料液比为 1 ∶ 30，
pH11.0，分别选择闪提温度为 30、40、50、60、70、
80℃，闪提时间 3min，研究闪提温度对蛋白质得率的
影响，确定最佳闪提温度。
1.2.2.4 闪提时间的确定 设定料液比为 1 ∶ 30，
pH11.0，闪提温度为 50℃，分别选择闪提时间为 2、
2.5、3、3.5、4min，研究闪提时间对蛋白质得率的影
响，确定最佳闪提时间。
1.2.3 响应面工艺优化实验 结合单因素实验结
果，采用 Box－ Behnken 进行实验设计，选取料液比
(g /mL)、pH、闪提温度(℃)及闪提时间(min)为影
响因素，采用四因素三水平的响应面法进行实验，利
用 Design－ Expert7.1.5 软件进行数据处理和回归分
析。分别用 A、B、C、D 来表示 4 个影响因素，并以
+ 1、0、－1 分别代表变量的水平，蛋白质得率为响应
值(即实验指标) ，实验设计方案［12－13］见表 1。
表 1 Box－Behnken方案设计的
中心组合实验因素和水平编码表
Table 1 Analytical factors and levels for Box－Behnken
因素
编码水平
－ 1 0 + 1
A料液比(g /mL) 1∶25 1∶30 1∶35
B pH 10.5 11.0 11.5
C闪提温度(℃) 40 50 60
D闪提时间(min) 3.0 3.5 4.0
1.3 分析方法
1.3.1 栗叶蛋白等电点的测定 取 100g 栗叶粉末，
按料液比 1 ∶20 加入 2000mL 40℃的蒸馏水，闪式提
取器提取 30s后，用 5mol /L的氢氧化钠溶液调节 pH
为 10.0，闪提 3min后，以 3000r /min离心 10min，收集
上清液，去掉沉淀。将上清液 pH 分别调至 2.3、2.6、
2.9、3.2、3.5、3.8、4.1、4.4、4.7、5.0，以 3000r /min 离心
10min，称取沉淀重量，确定栗叶蛋白的等电点［14］。
1.3.2 栗叶蛋白纯度测定 采用考马斯亮蓝法［15］。
称取标准牛血清白蛋白制成蛋白标准品溶液，同时
称取考马斯亮蓝 G－250 配制成考马斯亮蓝染色液，
通过比色测定，以标准蛋白质含量(μg /mL)为横坐
标 X，吸光度为纵坐标 Y，绘出标准曲线。
1.3.3 栗叶蛋白提取得率计算 根据公式计算蛋白
质提取得率:
栗叶蛋白提取得率(%)=干燥后栗叶蛋白的质
量 /栗叶粉末的质量 × 100
2 结果与分析
2.1 考马斯亮蓝标准曲线
考马斯亮蓝标准曲线如图 1 所示。
2.2 栗叶蛋白等电点测定结果
按照 1.3.1 方法进行实验，栗叶蛋白等电点测定
结果如图 2 所示。
图 1 考马斯亮蓝标准曲线
Fig.1 Coomassie brilliant blue standard curve
图 2 栗叶蛋白等电点的测定结果
Fig.2 Isoelectric point of chestnut leaf protein
由图 2 可知，在 pH2.3～2.6 范围内，栗叶蛋白的
沉淀量随着 pH的升高而增加，在 pH2.6 时达到最高
点，然后随着 pH 的继续升高，栗叶蛋白的沉淀量会
逐渐缓慢下降，直到 pH为 4.7 时，此后升高 pH 会导
致栗叶蛋白沉淀量的急剧下降，由此可推断栗叶蛋
白属于酸性蛋白质，在 pH为 2.6 时，得到的栗叶蛋白
质量最大，因此确定栗叶蛋白质的等电点 pI为 2.6。
2.3 栗叶蛋白质提取单因素实验结果
2.3.1 料液比对栗叶蛋白提取得率的影响 按照
1.2.2.1 方法进行实验，料液比对蛋白质提取得率的
影响实验结果如图 3 所示。
图 3 料液比对栗叶蛋白提取得率的影响
Fig.3 Effect of ratio liquid to material on extraction
由图 3 可知，在料液比小于 1∶30(g /mL)的范围
内，随着料液比的增大，栗叶蛋白的提取得率随之升
高;当料液比大于 1∶30(g /mL)时，栗叶蛋白的提取得
率会缓慢下降。当料液小于 1∶30(g /mL)时，栗叶蛋白
提取得率较低，可能由于栗叶中含有大量的植物纤维，
具有较强的吸水膨胀能力，使物料流动性差，导致蛋白
提取得率降低［16］。当料液比大于 1∶30(g /mL)时，栗
245
叶蛋白提取得率会有所下降，但下降范围很小，因此
考虑节约能源等综合因素，选择料液比取 1 ∶ 30
(g /mL)较佳。
2.3.2 pH对栗叶蛋白提取得率的影响 按照 1.2.2.2
方法进行实验，pH对栗叶蛋白提取得率的影响实验
结果如图 4 所示。
图 4 pH对栗叶蛋白提取得率的影响
Fig.4 Effect of pH on extraction
由图 4 可知，随着 pH 的升高，栗叶蛋白提取得
率增加，且在 pH 为 11.0 时达最大值;当 pH ＞ 11.0
时，栗叶蛋白提取得率下降，可能是由于 pH 太高引
起蛋白质变性，使提取得率有所降低，所以最佳提取
pH为 11.0。
2.3.3 闪提温度对栗叶蛋白提取得率的影响 按照
1.2.2.3 方法进行实验，闪提温度对栗叶蛋白提取得
率的影响实验结果如图 5 所示。
图 5 闪提温度对栗叶蛋白提取得率的影响
Fig.5 Effect of temperature on extraction
由图 5 可知，温度的高低对栗叶蛋白质的提取
有较大的影响。随着温度的升高，栗叶蛋白提取得
率增大;当温度达到 50℃时提取得率达到最大，之后
明显下降，原因可能是蛋白质在 50～70℃易受热变
性，使蛋白提取得率下降，所以最佳提取温度
为 50℃。
2.3.4 闪提时间对栗叶蛋白提取得率的影响 按照
1.2.2.4 方法进行实验，闪提时间对栗叶蛋白提取得
率的影响实验结果如图 6 所示。
由图 6 可知，随着闪提时间的延长，机械剪切力
作用产生大量的新生表面，加速了蛋白质的溶解与
扩散，提取得率逐渐提高［17］;当时间大于 3.5min 时，
栗叶蛋白提取得率的增长速度开始下降，说明此时
已达到提取平衡，此后再延长时间，提取得率不会再
明显升高，所以最佳闪提时间为 3.5min。
2.4 栗叶蛋白提取工艺优化
图 6 闪提时间对栗叶蛋白提取得率的影响
Fig.6 Effect of time on extraction
2.4.1 实验结果 按照 1.3.3 方法进行实验，结果见
表 2。
表 2 Box－Behnken方案设计及响应面法实验结果
Table 2 Program and experimental results of Box－Behnken
实验号 A B C D
得率
(g /100g)
1 － 1 － 1 0 0 7.49
2 1 － 1 0 0 7.81
3 － 1 1 0 0 9.48
4 1 1 0 0 9.80
5 0 0 － 1 － 1 10.20
6 0 0 1 － 1 9.25
7 0 0 － 1 1 11.04
8 0 0 1 1 11.09
9 － 1 0 0 － 1 11.74
10 1 0 0 － 1 11.73
11 － 1 0 0 1 11.97
12 1 0 0 1 12.02
13 0 － 1 － 1 0 7.73
14 0 1 － 1 0 9.80
15 0 － 1 － 1 0 7.34
16 0 1 1 0 9.27
17 － 1 0 1 0 11.93
18 1 0 － 1 0 11.25
19 － 1 0 － 1 0 11.87
20 1 0 1 0 10.65
21 0 － 1 1 － 1 7.33
22 0 1 0 － 1 8.63
23 0 － 1 0 1 7.44
24 0 1 0 1 9.73
25 0 0 0 0 12.12
26 0 0 0 0 12.74
27 0 0 0 0 12.44
28 0 0 0 0 12.67
29 0 0 0 0 12.01
2.4.2 模型的建立及其显著性检验 利用 Design－
Expert7.1.5 软件对表 2 实验数据进行多元回归拟合，
得到栗叶蛋白提取得率对料液比(A)、pH(B)、闪提
温度(C)及闪提时间(D)的二次多项回归模型为:
Y = 12.40 － 0.10A + 0.96B － 0.21C + 0.37D +
0.000AB－ 0.13AC + 0.015AD － 0.035BC + 0.25BD +
246
表 3 回归模型的方差分析结果
Table 3 ANOVA for response surface quadratic model
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性
模型 88.70 14 6.34 23.36 ＜ 0.0001 显著
残差 3.80 14 0.27 － － －
失拟项 3.38 10 0.34 3.21 0.1360 不显著
纯误差 0.42 4 0.11 － － －
总和 92.49 28 － － － －
表 4 回归模型系数的显著性检验结果
Table 4 Significance testing for response surface quadratic model
因素 回归系数 自由度 标准差 95%置信下限 95%置信上限 F值 p值
常数 12.40 1 0.23 11.90 12.90 － －
A － 0.10 1 0.15 － 0.42 0.22 0.46 0.5099
B 0.96 1 0.15 0.64 1.29 41.13 ＜ 0.0001
C － 0.21 1 0.15 － 0.53 0.12 1.89 0.1909
D 0.37 1 0.15 0.045 0.69 5.98 0.0283
AB 0.000 1 0.26 － 0.56 0.56 0.000 1.0000
AC － 0.13 1 0.26 － 0.69 0.42 0.27 0.6123
AD 0.015 1 0.26 － 0.54 0.57 3.318E－003 0.9549
BC － 0.035 1 0.26 － 0.59 0.52 0.018 0.8950
BD 0.25 1 0.26 － 0.31 0.81 0.90 0.3580
CD 0.25 1 0.26 － 0.31 0.81 0.92 0.3533
A2 － 0.088 1 0.20 － 0.53 0.35 0.19 0.6721
B2 － 3.32 1 0.20 － 3.76 － 2.89 264.34 ＜ 0.0001
C2 － 0.88 1 0.20 － 1.32 － 0.44 18.45 0.0007
D2 － 0.78 1 0.20 － 1.22 － 0.35 14.72 0.0018
0.25CD－0.088A2－3.32B2－0.88C2－0.78D2
对该模型进行显著性检验，结果见表 3，回归模
型系数显著性结果见表 4。
由表 3 方差分析结果可以看出，模型(Model)p
＜ 0.0001，模型达到显著。失拟项(Lack of Fit)p =
0.1360 ＞ 0.05 不显著，因此二次模型成立，应用此模
型可以分析和预测栗叶蛋白质碱溶酸沉提取工艺的
优化。
由表 4 回归模型系数显著性检验结果可知，模
型的一次项 B、D显著，A、C 不显著;二次项中，A2 不
显著，其他均显著;交互项均不显著。影响蛋白质提
取率的因素依次为 B ＞ D ＞ C ＞ A，即 pH ＞闪提时间
＞闪提温度 ＞料液比。
剔除不显著项后的数学模型为:
Y = 12.40 + 0.96B + 0.37D － 3.32B2 － 0.88C2
－0.78D2
2.4.3 栗叶蛋白质碱溶酸沉提取工艺的响应面分析
与优化 根据回归模型做出相应的响应曲面图见图
7～图 12。
根据回归方程，图 7～图 12 为各因素交互作用的
响应面图和等高线图，考察了响应曲面的形状，分析
了各个因素对蛋白提取率的影响。可以得出结论:
pH 对栗叶蛋白提取得率的影响最为显著，闪提时
间、闪提温度、料液比次之。
2.4.4 提取条件的优化 通过专业软件分析［18－19］，碱
溶酸沉提取栗叶蛋白质的最佳工艺条件如表 5
图 7 料液比与 pH的交互作用影响的响应曲面和等高线
Fig.7 Responsive surfaces and contours
of ratio liquid to material and pH
所示。
表 5 栗叶蛋白提取得率最佳的各个因素组合
Table 5 The optimization results
A B C D Ymax(%)
－ 0.520 0.155 － 0.045 0.246 12.55
由表 5 可知，栗叶蛋白的最佳提取工艺参数为:
料液比 1∶27.40(g /mL) ，pH11.08，闪提温度 49.55℃，
闪提时间 3.62min。在此条件下，栗叶蛋白提取得率
理论值为 12.55%。为检验响应面法所得结果的可靠
性，采用上述优化提取条件进行栗叶蛋白质提取，考
虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为:料液
比 1 ∶ 27(g /mL) ，pH11，闪提温度 50℃，闪提时间
3.6min。在此条件下提取，实际测得的平均得率为
247
图 8 料液比与闪提温度的交互作用影响的
响应曲面和等高线
Fig.8 Responsive surfaces and contours
of ratio liquid to material and temperature
图 9 料液比与闪提时间的交互作用影响的
响应曲面和等高线
Fig.9 Responsive surfaces and contours
of ratio liquid to material and time
图 10 闪提温度与 pH的交互作用影响的
响应曲面和等高线
Fig.10 Responsive surfaces and contours
of temperature and pH
11.89%，与理论值较接近，采用考马斯亮蓝法测得栗
叶蛋白的纯度为 64.89%，因此，基于响应面法所得
的优化提取工艺参数准确可靠，进一步验证了数学
回归模型的合适性。
3 结论
3.1 响应面法优化碱溶酸沉提取栗叶蛋白的最佳工
艺条件为:料液比 1 ∶ 27(g /mL) ，pH11，闪提温度
50℃，闪提时间 3.6min，在此条件下，栗叶蛋白提取得
率可达 11.89%，纯度为 64.89%。
3.2 在本实验范围内，各影响因素对蛋白质提取得
率作用的大小依次为:pH ＞闪提时间 ＞闪提温度 ＞
料液比。
图 11 闪提时间与 pH的交互作用影响的
响应曲面和等高线
Fig.11 Responsive surfaces and
contours of time and pH
图 12 闪提温度与闪提时间的交互作用影响的
响应曲面和等高线
Fig.12 Responsive surfaces and contours
of temperature and time
3.3 将闪式提取法应用到叶蛋白的提取工艺中，结
果表明闪式提取法不仅能大大缩短提取时间，降低
提取温度，简化生产工艺，提高提取效率，而且操作
简单易行，是一种高效快速提取蛋白质的方法［20］。
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( 下转第 250 页)
250
之后多糖提取率增加变缓;当无水乙醇加入量为浓
缩液体积的 5 倍时，猫棒束孢真菌多糖提取率最高，
为 16.21%，因此选择乙醇加入量为浓缩液体积的 4
倍。这是由于较高的乙醇比能提高多糖提取率，但
乙醇比过高会导致部分多糖分子与醇溶蛋白结合，
从而溶于乙醇中不被沉淀。
图 3 乙醇加入倍数对提取率的影响
Fig.3 Effect of absolute ethyl alcohol addiction
on yield of polysaccharides
2.4 正交实验结果
正交实验结果见表 2。由表 2 可见，根据极差分
析结果可知:RA ＞ RC ＞ RB，即影响多糖提取的主次顺
序为:水料比(A)＞无水乙醇比(C)＞浓缩比(B) ，
最佳工艺提取条件为 A3B1C3，即水料比为 6 ∶1，提取
液浓缩至原料重量的 2 倍，并加入浓缩液 4 倍无水乙
醇。
为了验证上述结果的准确性，重复最佳组合
A3B1C3 实验，多糖得率为 16.24%，与正交实验结果
基本吻合，因此可以证明优化实验具有合理性。
3 结论
本实验采用硫酸－苯酚法对猫棒束孢真菌多糖
的含量进行了测定，由单因素实验及正交实验结果
可知，猫棒束孢真菌多糖最佳提取工艺条件为:水料
比为 6∶1，提取液浓缩至原料重量的 2 倍，并加入浓
缩液 4 倍无水乙醇，其提取率最高。该条件下多糖
得率达 16.24%。猫棒束孢真菌多糖提取工艺条件
的优化为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
表 2 L9(3
3)正交实验实验结果
Table 2 The result of the orthogonal test
实验号 A B C 提取率(%)
1 1 1 1 12.88
2 1 2 2 13.69
3 1 3 3 13.58
4 2 1 3 15.79
5 2 2 2 15.84
6 2 3 1 13.21
7 3 1 3 16.24
8 3 2 1 14.27
9 3 3 2 14.96
K1 40.15 44.91 40.36
K2 44.48 43.80 44.44
K3 45.47 41.75 45.66
k1 13.38 14.97 13.45
k2 14.95 14.60 14.81
k3 15.16 13.92 15.22
R 1.78 1.05 1.77
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