全 文 ：·72· Chinese Journal of Information on TCM May 2015 Vol.22 No.5
桑根白皮素调控人结肠癌 HCT116 细胞周期阻滞
及其抑制细胞增殖的体外研究
周昱岐,叶敏,张映城,魏品康
解放军第二军医大学上海长征医院,上海 200003
摘要：目的 观察中药提取物桑根白皮素对结肠癌 HCT116细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响,探讨其
相关机制。方法 体外以不同浓度桑根白皮素作用于 HCT116细胞 72 h,CCK-8法检测细胞增殖,计算细胞生长
抑制率和 IC50,取 25.4 μmol/L 和 50.8 μmol/L 桑根白皮素作用于 HCT116 细胞 24、48、72 h,CCK-8 法检测细
胞增殖,镜下观测细胞形态并摄图；25.4 μmol/L 桑根白皮素作用于细胞 24 h 后,流式细胞仪检测细胞周期分
布,荧光显微镜下 TUNEL法原位检测细胞凋亡；Western blot检测药物干预后β-catenin通路蛋白和细胞周期
蛋白的表达变化。结果 桑根白皮素对HCT116细胞增殖的抑制作用呈浓度/时间依赖性,72 h IC50为25.4 μmol/L；
桑根白皮素阻滞 HCT116 细胞周期于 G0/G1 期和 G2/M 期,对细胞凋亡无明显诱导作用；桑根白皮素显著降低
β-catenin通路相关蛋白β-catenin、c-Myc及细胞周期调控蛋白 cyclinD1、cyclinB1的表达。结论 桑根
白皮素可阻滞 HCT116 细胞周期,抑制细胞增殖,其机制可能是通过下调β-catenin 通路活性,并抑制细胞周期
蛋白 cyclinD1、cyclinB1表达实现的。
关键词：桑根白皮素；结肠癌；细胞周期；细胞增殖；β-catenin通路
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.05.020
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2015)05-0072-04
In Vitro Study on Morusin Regulating Cell Cycle Arrest and Inhibiting Cell Proliferation of
HCT116 Cells in Colorectal Cancer ZHOU Yu-qi, YE Min, ZHANG Ying-cheng, WEI Pin-kang
(Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)
Abstract：Objective To investigate the effects of Morusin on cell line proliferation, cell cycle and
cell apoptosis of colorectal cancer HCT116 cell；To discuss its mechanism. Methods HCT116 cells
were treated with different concentrations of Morusin for 72 h. Cell proliferation was detected by
CCK-8 assay, and cell growth inhibition rate and IC50 value were calculated. HCT116 cells were
treated with 25.4, 50.8 μmol/L Morusin for 24 h, 48 h and 72 h. Cell morphology was observed
under the microscope, and cell proliferation was detected by CCK-8 assay. After HCT116 cell line
was treated with 25.4 μmol/L Morusin for 24 h, cell cycle phase distribution was detected by flow
cytometry and the cell apoptosis was detected by TUNEL assay under the fluorescence microscope.
Post-intervention protein expressions were detected by Western Blot. Results The inhibitory effects of
Morusin on the proliferation of HCT116 cell line was concentration/time dependent and IC50 value
at 72 h was 25.4 μmol/L；Morusin induced the cell cycle arrest at G0/G1 phase and G2/M phase,
but there was no induction of cell apoptosis；Morusin significantly decreased the expression of
β-catenin and its target c-Myc, and downregulated the expressions of cyclinD1 and cyclinB1,
which were involved in cell cycle regulation. Conclusion Morusin can inhibit HCT116 cell cycle and
the proliferation of colorectal cancer cells. Its mechanism might be realized by suppressing the
activity of β-catenin pathway and reducing the protein expressions of cyclinD1 and cyclinB1.
Key words：Morusin；colorectal cancer；cell cycle；cell proliferation；β-catenin pathway

基金项目：上海市卫生和计划生育委员会中医药科研基金(2014JP012A、20144Y0427)
通讯作者：魏品康,E-mail：xgfzyq@126.com
2015 年 5 月第 22 卷第 5期 中国中医药信息杂志 ·73·
结肠癌为常见的消化系统恶性肿瘤,临床现行治
疗方法的有效率仅为 50%左右,肿瘤细胞对化疗药物
的耐药是治疗失败的主因。桑根白皮素是从中药桑白
皮中分离出来的单体,被证实有抗肿瘤作用[1-2]。虽有
研究表明,其能够通过诱导细胞凋亡而抑制结肠癌
HT-29 细胞生长[3],但关于桑根白皮素抗结肠癌及相
关机制的研究依旧甚少。本实验用桑根白皮素体外干
预人结肠癌HCT116细胞,观察其对HCT116细胞增殖、
细胞周期及细胞凋亡的影响,初步探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞株及细胞培养
HCT116 人结肠癌细胞株购自中国科学院上海生
命科学研究院细胞库。培养条件为 37 ℃、5%CO2；培
养基为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL
链霉素的 McCoys 5A 培养基；用含 0.01%EDTA 的
0.25%胰酶进行消化传代,待细胞处于对数生长期后,
用于实验。
1.2 药物
桑根白皮素对照品(纯度 99%),购自上海中医药
标准化研究中心,溶于二甲基亚砜(DMSO)中制备保存
液,浓度为 4800 μmol/L,储存于-20 ℃备用。
1.3 主要试剂与仪器
胎牛血清(奥地利PAA Laboratories GmbH公司)；
CCK-8 试剂(日本 Dojindo 公司)；兔抗人β-catenin
一抗、兔抗人 GSK-3β一抗、兔抗人 c-Myc 一抗(美国
CST 公司)；McCoy’s 5A 培养基(GIBCO 公司)；鼠抗人
β-actin 一抗、HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠
IgG 二抗、HRP 标记的羊抗兔 IgG 二抗(美国
Proteintech 公司)；鼠抗人 cyclinD1 一抗、兔抗人
cyclinB1一抗(美国Signalway Antibody公司)；RIPA
裂解液、BCA 试剂盒(碧云天公司)；ECL 发光试剂盒、
CO2培养箱(美国 Thermo Scientific 公司)；TUNEL 细
胞凋亡原位检测试剂盒(南京凯基生物公司)；Steril
Gard 超净工作台(美国 Baker 公司)；Model 550 酶标
仪、Model Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统(美国
Bio-Rad 公司)；FACS Calibur 流式细胞仪(美国 BD
公司)。
1.4 细胞分组及干预
细胞分为空白组(不接种细胞)、对照组(接种细
胞不加药物)、实验组(桑根白皮素 10、20、30、40、
50 μmol/L 或者 12.7、25.4、50.8 μmol/L),每组设 6
个复孔,作用 24、48、72 h。
1.5 检测指标及方法
1.5.1 CCK-8 法检测细胞增殖 96 孔培养板中接种
细胞悬液(100 μL/孔,浓度为 5×104/mL),细胞分组、
给药,37 ℃、5%CO2条件下培养；药物作用结束后,每
孔吸尽培养液,更换 100 μL 新鲜培养基,并加入 10 μL
CCK-8 溶液,培养箱中孵育 3 h,在酶标仪 450 nm 处测
吸光度(OD 值),计算抑制率。抑制率(%)＝1－[(实
验孔 OD 值－空白孔 OD 值)÷(对照孔 OD 值－空白孔
OD 值)]×100%。
1.5.2 流式细胞仪检测细胞周期 25.4 μmol/L 桑
根白皮素作用于 HCT116 细胞 24 h 后,消化细胞并和
培养液一起制备细胞悬液,1200 r/min 离心 5 min,弃
上清；PBS 洗涤 2 次,离心后弃 PBS,沉淀细胞内加入
300 μL PBS,温柔吹打,移液于流式管内,流式管内加
700 μL、4 ℃预冷的无水乙醇,4 ℃固定过夜；细胞
1500 r/min离心5 min,弃上清,PBS洗 2次,1500 r/min
离心 5 min,弃上清,重悬细胞于 500 μL 含 100 U/mL
RNaseA 的 PBS 中 37 ℃温浴 30 min；加碘化丙啶(PI)
至终浓度为 50 μg/mL,室温孵育 30 min,用 200 目尼
龙网过滤后,上流式细胞仪作DNA细胞周期分布检测。
以 PI 荧光读数为横坐标,细胞数为纵坐标作图。
1.5.3 TUNEL 法检测 FITC 标记的凋亡细胞 培养板
中接种细胞悬液(100 μL/孔,1×105/mL),含终浓度为
25.4 μmol/L 桑根白皮素的培养液作用 24 h 后,吸除
培养液,PBS 洗 3 次。按产品说明,4%多聚甲醛室温固
定30 min,1%Triton X-100通透液室温促渗5 min,PBS
洗3次；每孔加含1000 U脱氧核糖核酸酶I(RNase Ⅰ)
反应液室温处理 30 min,PBS 洗 3 次；配制含生物素
标志的dUTP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶的工作液,
每孔加 50 μL,37 ℃避光反应 60 min,PBS 洗 3 次；每
孔加Streptavidin-FITC标记工作液,37 ℃避光反应
30 min,PBS 洗 3 次；Hoechst 核染液室温避光复染细
胞核 15 min,PBS 洗 3 次。封片后荧光显微镜观测,激
发波长 450～500 nm,每个样品取 5 个视野,摄图；
Image J 软件计数阳性细胞,计算细胞凋亡率。细胞凋
亡率(%)＝凋亡细胞数÷细胞总数×100%。
1.5.4 Western blot 检测蛋白表达 12.7、25.4、
50.8 μmol/L 桑根白皮素作用于 HCT116 细胞 24 h 后,
吸除培养液,裂解细胞,BCA 法测定蛋白浓度,等量的
蛋白样品(40 μg)经 10%SDS-PAGE 电泳分离后,转印至
PVDF 膜上,5%脱脂奶粉封闭液室温封闭 2 h,β-actin
按 1∶5000 稀释,GSK-3β、β-catenin、c-Myc、
cyclinD1、cyclinB1 一抗按 1∶1000 稀释,4 ℃孵育
过夜；TBST 洗膜 3 次后,加入 1∶2000 稀释的 HRP 标
记羊抗鼠或羊抗兔二抗,室温孵育 1 h,TBST 再次洗涤
3 次,加入 ECL 发光底物,在 WB 凝胶成像系统中成像、
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摄图。应用 GraphPad Prism 5.0 软件对细胞吸光度
值和细胞生长抑制率作回归分析,计算 IC50。
1.6 统计学方法
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析。计量资料以
—x±s表示,Levene法检验方差齐性,方差齐单因素多水
平多个均数比较采用 Dunnett-t 检验,方差不齐采用
多样本非参数 Kruskal-Wsllis H 检验,各药物浓度组
在不同时点的细胞吸光度值采取重复测量的两因素
多水平方差分析。检验水准为α＝0.05。
2 结果
2.1 桑根白皮素对 HCT116 细胞增殖的影响
各浓度桑根白皮素作用72 h,检测细胞OD值,20、
30、40、50 μmol/L 药物浓度组 OD 值与对照组比较,
差异有统计学意义(P＜0.01),随药物浓度增高,抑制
率也相应增高,桑根白皮素干预 HCT116 细胞 72 h 的
IC50为 25.4 μmol/L。结果见表 1。进一步取桑根白皮
素25.4 μmol/L(低浓度组)和50.8 μmol/L(高浓度组)
作用于细胞 24、48、72 h,各时间点桑根白皮素对细
胞增殖均有抑制作用,实验组OD值与对照组比较差异
有统计学意义(P＜0.01),组内各时点比较差异亦有
统计学意义(P＜0.01)。结果见表 2。
表 1 各组药物作用 72 h HCT116细胞增殖比较(—x±s)
组别 n OD 值 抑制率(%)
对照组 6 1.80±0.11
10 μmol/L 组 6 1.75±0.15 2.83
20 μmol/L 组 6 1.44±0.13** 19.91
30 μmol/L 组 6 0.52±0.11** 71.19
40 μmol/L 组 6 0.01±0.02** 99.53
50 μmol/L 组 6 0.00±0.02** 99.89
注：与对照组比较,**P＜0.01(下同)
表 2 各组药物作用不同时点 HCT116 细胞增殖比较(—x±s)
组别 n
24 h 48 h 72 h
OD 值 抑制率(%) OD 值 抑制率(%) OD 值 抑制率(%)
对照组 6 0.90±0.08 1.67±0.09 2.15±0.03
低浓度组 6 0.62±0.05** 30.99 1.03±0.17**△△ 38.41 1.19±0.22**△△ 44.51
高浓度组 6 0.29±0.01** 67.25 0.19±0.01**△△ 88.78 0.01±0.01**△△ 99.31
注：与本组 24 h 比较,△△P＜0.01
2.2 桑根白皮素对 HCT116 细胞形态的影响
HCT116 细胞经低浓度(25.4 μmol/L)、高浓度
(50.8 μmol/L)的桑根白皮素作用 72 h 后,表现出不
同程度细胞体积缩小、细胞皱缩、边缘毛糙、伪足消
失,高浓度组作用最显著,见图 1。


图 1 药物作用 HCT116细胞 72 h各组细胞形态学(×100)
2.3 桑根白皮素对 HCT116 细胞周期和凋亡的影响
25.4 μmol/L 桑根白皮素作用 HCT116 细胞 24 h,
与对照组比较,G0/G1 期和 G2/M 期细胞比例显著增
高,S 期细胞比例显著降低(P＜0.01)。结果见图 2、
表 3。提示桑根白皮素阻滞细胞周期在 G1 期和 G2/M
期,但其对细胞凋亡无明显诱导作用。
2.4 桑根白皮素对β-catenin 通路蛋白和细胞周期
蛋白表达的影响
12.7、25.4、50.8 μmol/L 桑根白皮素作用于
HCT116 细胞 24 h 后,糖原合成酶 3β(GSK-3β)表达
增高,通路核心蛋白β-catenin 和下游靶基因 c-Myc
蛋白表达均明显降低,下调作用呈浓度依赖性；细胞周
期调控相关的细胞周期蛋白cyclinD1和 cyclinB1蛋
白表达亦有下调,50.8 μmol/L 组下调最明显,见图 3。


图 2 药物作用 HCT116细胞 24 h后 2 组细胞周期流式图
表 3 2 组 HCT116细胞周期分布和细胞凋亡率比较(—x±s,%)
组别 n
细胞周期
细胞凋亡率
G0/G1 S G2/M
对照组 3 36.78±1.86 48.46±1.55 14.76±2.40 0.53±0.18
桑根白皮素组 3 61.27±2.55** 14.35±1.38** 24.38±2.18** 1.92±0.17*
对照组 桑根白皮素组
对照组 低浓度组 高浓度组
0 30 60 90 120 150 0 30 60 90 120 150
800
600
400
200
0
Dip G1
Dip G2
Dip S
Dip G1
Dip G2
Dip S280
210
140
70
0
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图 3 药物作用 HCT116细胞 24 h各组β-catenin通路蛋白
和细胞周期调控相关蛋白的表达
3 讨论
本研究中,我们观察到桑根白皮素在体外抑制
HCT116 细胞增殖,并且作用呈浓度/时间依赖。我们同
时检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响,结果显示,
桑根白皮素显著降低 S期细胞比例、提高 G0/G1 期和
G2/M 期细胞比例,提示桑根白皮素阻滞细胞周期在
G0/G1 期和 G2/M 期；而对细胞凋亡却无明显诱导作
用,这与此前的报道并不一致[3]。
细胞周期蛋白(cyclins)参与调控细胞周期进
程。其中 cyclinD1 促进细胞由 G1 期进入 S 期,能够
促进细胞增殖；cyclinB1 则促进细胞由 G2 期进入 M
期,基因敲除 cyclinB1 使其完全失表达后,细胞即阻
滞在 G2 期,二者的下调均能阻滞细胞周期。本实验结
果显示,桑根白皮素作用后,cyclinD1 和 cyclinB1 的
表达均下调,高浓度组尤为显著,这与细胞周期阻滞
在 G0/G1 期和 G2/M 期的结果是相符的。
cyclinD1 是 Wnt/β-catenin 通路下游靶基因,
经典 Wnt/β-catenin 通路是结肠癌发生发展中的重
要通路,几乎所有结肠癌中都存在经典β-catenin 通
路的异常激活[4],激活的β-catenin 通路不仅促进结
肠癌的形成,还对维持肿瘤生长起到重要作用[5-6]。此
通路的核心蛋白为β-catenin,正常状态下,GSK-3β
参与组成的降解复合物使β-catenin 磷酸化被降解,
维持β-catenin 在细胞质中的低浓度稳态；当 Wnt/
β-catenin通路中的任一环节发生突变时,β-catenin
不能被降解,在胞质中累积并移至细胞核内,启动下
游靶基因的表达,这就是 Wnt/β-catenin 通路的激
活。GSK-3β活性如受抑制则β-catenin 表达增高,
通路下游相关靶基因转录亦增强；GSK-3β表达增高
则β-cateni 表达降低,下游靶基因转录减弱[7]。研究
结果显示,桑根白皮素能上调 GSK-3β表达,从而下调
β-catenin 表达,其对二者的调控作用均呈浓度依赖
性,且量效趋势是一致的。β-catenin 通路激活后,
激动下游靶基因转录,除上文提到的 cyclinD1
外,c-Myc 也是重要靶基因之一,是公认的促细胞增殖
因子[8],研究中,我们同样观察到桑根白皮素对 c-Myc
的抑制作用呈浓度依赖性,这可能也是其抑制 HCT116
细胞增殖的机制之一。
综上所述,桑根白皮素通过阻滞细胞周期在
G0/G1期和G2/M期,从而抑制人结肠癌HCT116细胞增
殖,其机制可能与下调β-catenin 信号,抑制其靶基
因 c-Myc 转录,并抑制细胞周期蛋白 cyclinD1、
cyclinB1 表达相关。
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(收稿日期：2015-01-03；编辑：华强)