全 文 ：收稿日期:2007-07-27;　修订日期:2007-11-23
基金项目:国家 “ 863”计划重点资助项目(No.2002AA2Z3217)
作者简介:易艳萍(1959-),女(汉族),湖南攸县人 ,现任宜春学院化学与生
物工程学院副教授,学士学位 ,主要从事生物无机化学教学与科研工作.
＊通讯作者简介:陈　武(1944-),男(汉族),江西奉新人 ,现任宜春学院化学
与生物工程学院教授 ,学士学位 ,主要从事天然药物与生物技术研究工作.
毛泡桐叶中乌索酸的提取分离
及反相高效液相色谱分析
易艳萍 1 ,邹盛勤 2 ,谢晚彬1 ,陈　武 1 , 2＊
(1.宜春学院化学与生物工程学院 ,江西 宜春　336000;
2.江西省天然药物活性成分研究重点实验室 ,江西 宜春　336000)
摘要:目的 提取鉴定毛泡桐叶中的乌索酸 , 并建立其含量测定方法。方法 采用 “醇提凝析法 ”新工艺分离制备乌索酸 ,
IR, MS, NMR鉴定其结构。建立反相高效液相色谱测定其含量的方法 , 色谱柱为 KromasilC18柱 , 流动相为乙腈 -甲醇 -
水 -磷酸(体积比 168∶682∶150∶1.68), 流速 0.8 ml/min, 检测波长 210 nm, 柱温 25℃。结果 乌索酸在 0.92 ～ 16.56
μg范围内线性关系良好(r=0.999 6)。样品乌索酸含量为 99.61%,得率为 30.5%。结论 “醇提凝析法”分离制备乌索
酸工艺先进 , 实用可行 ,为工业试验生产乌索酸提供了技术条件;RP-HPLC法测定乌索酸含量准确 、精密度高 、重复性
好 、线性范围宽 ,可作为控制乌索酸质量的方法。
关键词:毛泡桐叶;　乌索酸;　结构表征;　反相高效液相色谱
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)04-0799-02
PreparationandRP-HPLCAnalysisofUrsolicAcidfromPaulowniatomentosa(Thunb
.)SteudLeaves
YIYan-ping1 , ZOUSheng-qin2 , XIEWan-bin1 , CHENWu1, 2＊
(1.ColegeofChemistryandBioengineeringofYichunUniversity, Yichun, Jiangxi336000, China;2.KeyLa-
boratoryofJiangxiProvinceforResearchonActiveIngredientsinNaturalMedicines, Yichun, 336000 , China)
Abstract:Objective:ToextractandidentifyursolicacidfromPaulowniatomentosa(Thunb.)Steudleavesandtoestablishadeterminationmethodofursolicacid.Methods:UrsolicacidwasextractedfromPaulowniatomentosa(Thunb.)Steudleavesby
adoptinganewmethodofethanolextractionandagglutinationseparation, anditsstructurewasidentifiedbyIR, MSandNMR.A
determinationmethodofursolicacidinPaulowniatomentosa(Thunb.)Steudleavesbyreversed-phasehighperformanceliquid
chromtographwasestablished.Thechromatographiccolumn(KromasilC18, 4.6mm×250 mm, 5 μm), acetonitrile-methanol
-water-phosphoricacidmobilephase(168:682:150:1.68, V/V)with0.8 ml/minflowrate, thedetectedwavelength(210
nm)andthecolumntemperature(25℃)wereadopted.Results:Ursolicacidshowedgoodlinearrelationshipintherangeof0.
92 ～ 16.56 μg(r=0.999 6).Theaveragerecoveryratewas99.82% (RSDwas0.75%).Thecontentwas99.61% andthe
gainratewas3.05 ‰.Conclusion:Themethodofethanolextractionandagglutinationseparationtoextractursolicacidisad-
vanced, rational, practicalandfeasible, anditprovidestechnologyconditionforindustrialproductionofursolicacid.RP-HPLC
issimpleandaccurate, ithasgoodrepeatabilityandwiderlinearrange, anditcanbeusedtoevaluatethequalityofursolicacid.
Keywords:Paulowniatomentosa(Thunb.)Steudleaf;　Ursolicacid;　Structuralcharacteristics;　RP-HPLC
　　毛泡桐叶为玄参科泡桐属植物毛泡桐 Paulowniatomentosa
(Thunb.)Steud的叶子 [ 1] 。泡桐的药用价值我国古代就有记载 ,
《本草纲目》(1578年)记有 “桐叶主恶蚀疮著阴皮主五痔 、杀三
虫 , 花主傅猪疮 , 消肿 、生发。”泡桐的花 、叶 、果 、木 、皮 、根均可入
药 [ 2] 。泡桐叶含桃叶珊瑚苷 、泡桐苷 、毛蕊花苷 、异毛蕊花苷 、糖
苷 、多酚类 [ 2]及熊果酸 、乙酰熊果酸 α, β [ 3]等 , 其中三萜酸类 ,特
别是乌索酸和齐墩果酸 ,具有抗菌 、抗肝炎 、抗肿瘤 、降血糖血脂 、
增强免疫功能等多种药理作用 ,已引起人们广泛的关注 [ 5, 6] 。为
此 , 我们以毛泡桐叶为原料 , 采用 “醇提凝析法”提取分离乌索
酸 [ 5, 6] , 并建立 RP-HPLC测定分析乌索酸含量的方法 , 为开发
利用丰富的毛泡桐药用植物资源提供科学依据。
1　器材与方法
1.1　材料 毛泡桐叶采自江西宜春市宜春学院北校区 , 经江西省
天然药物活性成分研究重点实验室鉴定为紫花毛泡桐P.tomentosa
(Thunb)Steud的叶子。 95 %乙醇(食用级 , 南昌利康药械实业有
限公司);“YCXY-1号”除杂剂(自制);复合酶制剂(哈尔滨神农
有限公司);活性炭(分析纯 , 上海豪申化学试剂有限公司);甲醇
(色谱纯 , 天津市大茂化学试剂厂);水为超纯水;乌索酸对照品
(中国药品生物制品检定所提供, 批号 110742 -200314)。
1.2　仪器 Waters系列高效液相色谱仪(515双泵 , 2996光电二
极管阵列检测器 , Empower中文色谱数据工作站 , 美国);Perkin-
Elmer傅立叶变换红外光谱仪(美国);Autospec-UltimaETOF
EL型质谱仪(美国);INOVA -600型 、BruckerACF-400型核
磁共振仪(美国);Boetius显微熔点测定仪(北京);WZZ-1S数字
式自动旋光仪(上海);RO-MB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分
离设备厂), CP225D电子分析天平(德国 Sartourius公司), FW100
型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司), 202-26A型数
显电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。
1.3 　乌索酸的提取分离
1.3.1　工艺流程 见图 1。
图 1　提取乌索酸的工艺流程
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.4 时珍国医国药 2008年第 19卷第 4期
1.3.2　操作步骤 采用 “醇提凝析法”提取分离。将干燥后的毛
泡桐叶 10 kg粉碎成粗粉(20目), 用温水湿润 , 加入原料干重
1%的复合酶制剂 , 38℃酶解处理 24 h,滤干 , 加入 8倍重量 90%
乙醇 , 85℃回流提取 2次 , 1h/次 , 合并提取液 ,过滤 , 减压回收乙
醇得浸膏 , 以纯水沉降洗涤后加 “YCXY-1号”除杂剂除杂处理
2次 ,过滤 , 用 95 %乙醇溶解 , 调 pH值碱化 ,加活性炭脱色 ,过
滤除杂 , 再用 95% 乙醇溶解 , 调 pH值酸化 , 凝析分离 、纯化精
制 , 80℃干燥 24 h, 得无色针状结晶 30.5g, 得率为 3.05‰。
2　结果
2.1 　样品结构鉴定 样品 IRKBrmaxυcm-1:3 434(-OH)、 2 968、
2 927、2 871(C-H)、1 694(C=O)、1 456、1 384(CH3)、1 031(C-O);EI-MS(m/z):456(M+)、441(M-CH3)、 438(M-H2 0)、 423(M-CH3 -H20)、 411(M -COOH)、410(M-H-COOH);D、E环
离子 a(C环经 RDA裂解):248(a-100)、203(a-COOH)、189(a-
CH2 -COOH)、133;A、B环离子b(C环经 RDA裂解):208(b)、207(b-H)、190(b-H2O)和 189(b-H2O-H);1H-NMR(DMSO-d6)示 5个季碳甲基:(δ0.68、0.75、 0.87、0.89、1.04, 各 3H, s);2
个叔碳甲基(δ0.81, J=6.2Hz;0.91, J=6.0Hz, 各 3H, d);C
18(δ2.01, J=11.4Hz, d);C
3
α-H(δ3.00, J=11.0, 5.2, 5.2Hz, 1H,
td, );C
12
-H(δ5.13, J=3.5Hz, 1H, t);C
15
-H(δ1.00, J=13.6,
1H, brd);C
16
-H(δ1.93, J=13.2, 4.0, 1H, td);C
29
-H(δ0.81, J=
6.2Hz, 3H, d);C
30
-H(δ0.91, J=6 Hz, 3H, d);13C-NMR(DMSO
-d6)示 7个伯碳:δ28.3(C23)、16.1(C24)、15.2(C25)、17.0(C26)、
23.3(C27)、 16.9(C29)、 21.1(C30);9个仲碳:δ38.2(C1)、 27.0(C2)、18.0(C6)、 32.7(C7)、22.8(C11)、27.5(C15)、 23.8(C16)、
31.2(C21)、36.3(C22);7个叔碳:δ76.8(C3)、54.8(C5)、47.9(C9)、
124.6(C12)、 52.3(C18)、 39.4(C19)、 38.5(C20);6个季碳:δ38.4(C4)、39.8(C8)、36.5(C10)、138.2(C13)、41.6(C14)、48.8(C17);1
个羧基碳:178.3(C28)。
以上光谱数据与文献值一致 [ 7, 8] ,根据光谱数据确证样品为
乌索酸。
2.2　 乌索酸样品含量测定
2.2.1　对照品溶液配制 精密称定乌索酸对照品 9.20 mg,置于
10ml量瓶中 , 加流动相溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 制成对照品
溶液。
2.2.2　样品溶液配制 精密称定乌索酸样品 8.12 mg, 置于 10
ml量瓶中 , 加流动相溶解并稀释至刻度 , 摇匀 ,作为样品溶液。
2.2.3　检测波长的选择 取乌索酸对照品和样品溶液进样 ,在
190 ～ 500 nm波长范围进行光谱扫描 ,乌索酸在流动相中的最大
紫外吸收波长均为 204.5nm(见图 2), 但由于流动相在短波长
处有末端吸收 , 为了消除背景 ,提高信噪比 ,提取不同波长的色谱
图进行比较 ,选择 210nm为检测波长信噪比高 ,峰形好 , 干扰小 ,
最大限度地保证分析结果的准确。
图 2　对照品和样品的乌索酸紫外吸收光谱
2.2.4　色谱条件 色谱柱为 KromasilC18柱(4.6mm×250 mm, 5
μm);流动相为乙腈 -甲醇 -水 -磷酸(体积比 168∶682∶150
∶1.68);流速 0.8 ml· min-1;检测波长 210 nm;柱温为 25℃ 。
以乌索酸计 , 理论塔板数分别为 16 675 ,分离度为 1.924,对称因
子分别为 0.998, 外标法定量分析。
2.2.5　线性关系实验 用微量注射器精密吸取乌索酸对照品溶液
1, 2, 6, 10, 14, 18μl进样分析, 平行 3次 ,按色谱条件测定峰面积 ,以
对照品的进样量为横坐标 ,峰面积为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,得乌索
酸回归方程为:Y=6.38×105X+1.84×104(r=0.999 6)。表明当乌
索酸进样量在 0.92 ～ 16.56 μg之间时 ,线性关系良好。
2.2.6　精密度实验 精密吸取乌索酸对照品溶液 10μl进样 , 重
复 5次 ,测得乌索酸峰面积 RSD为 0.80 %(n= 5), 本方法精
密度良好。
2.2.7　 重复性实验 精密称取同一批乌索酸样品 5份 , 配制样
品溶液 ,吸取 10 μl进样分析 ,测得乌索酸峰面积 RSD为 1.12 %
(n=5), 本方法重复性好。
2.2.8　乌索酸含量测定 吸取样品溶液 10μl进样分析 , 重复进
样 5次 ,样品中乌索酸的含量为 99.61%。
3 　讨论
泡桐是玄参科(Scrophulariaceae)落叶乔木 , 原产于我国 , 现
有 9个种 , 4个变种 [ 1] , 国内分布广泛 ,资源丰富。毛泡桐叶中不
仅乌索酸含量较高 ,而且其同分异构体齐墩果酸含量极低 , 经研
究测定其叶中乌索酸含量高达 7.5‰[ 9 , 10] , 为乌索酸的开发开辟
了新的原料路线。
采用 “醇提凝析法”新工艺 , 从毛泡桐中提取分离乌索酸 , 仅
以乙醇为溶剂 ,未加其它有机溶剂 , 采用自制的 “YCXY- 1号”
除杂剂 ,有效去除脂类 、类脂类 、酚类及叶绿素等杂质 , 不仅提高
了产品的安全性 ,而且简化了工艺流程 , 降低了生产成本 ,有利于
乌索酸的富集和纯化 ,其含量达 99.61%, 得率达 30.5%,具有制
备量大 ,质量稳定 , 易于实现工业化生产等特点。
本研究选用乙腈-甲醇 -水(体积比 168:682:150)体系为流动
相 ,发现当流动相洗脱速度达 0.8ml· min-1时 ,乌索酸与其同分异
构体齐墩果酸达到了基线分离,但峰形拖尾,这是由于结构中的羧基
存在解离现象 ,加入适量磷酸能有效抑制其解离,使拖尾现象得以改
善 ,峰形尖锐对称。经多次预实验选定流动相为乙腈 -甲醇 -水 -
磷酸(体积比 168∶682∶150∶1.68),流速为 0.8 ml· min-1。
乌索酸在流动相中的紫外吸收光谱显示其最大吸收波长为
202.2nm, 但溶剂甲醇在短波长处亦有吸收 ,为减少干扰 ,且不至
于降低检测的灵敏度 ,故确定 210nm为检测波长。
采用该实验建立的 RP-HPLC法测定毛泡桐中乌索酸的含
量 , 样品处理简单 ,无其它杂质的干扰 ,方法简便 、快速 ,分离效果
好 , 数据准确可靠 , 为相关植物中乌索酸含量的测定提供了科学
的分析手段。
致谢:乌索酸的质谱 、核磁共振谱由中国海洋大学药物研究
所李英霞教授代测。
参考文献:
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