全 文 ：［收稿日期］ 20130514(020)
［基金项目］ 国家重大新药创制项目(2010ZX09102-211)
［第一作者］ 姜艳艳，博士，副教授，从事中药药效物质基础研究，Tel:010-84738628，E-mail:jyyjm1129@ 163. com
［通讯作者］ * 刘斌，博士，教授，博士生导师，从事中药药效物质基础与质量控制研究，Tel:010-84738629，E-mail:liubinyn67@ 163. com
香橼、佛手中黄酮类成分含量测定及 HPLC特征图谱研究
姜艳艳1，张乐1，刘娟1，孟祥娟1，周海燕2，刘斌1* ，李军祥3
( 1. 北京中医药大学中药学院，北京 100102; 2. 亚宝北中大( 北京) 制药有限公司，北京 101300;
3. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)
［摘要］ 目的:建立香橼、佛手药材中黄酮类成分的含量测定方法及 HPLC 特征图谱。方法:采用高效液相色谱法对特
征图谱进行研究，并对橙皮苷和柚皮苷进行含量测定，色谱柱为 Waters SunFireTM C18(4. 6 mm × 150 mm，5 μm) ，流动相乙腈-
0. 1%磷酸梯度洗脱，检测波长 284 nm，流速 1. 0 mL·min －1，柱温 30 ℃。结果:所建立的特征图谱可同时用于含量测定，香橼、
佛手黄酮类成分分离度良好，柚皮苷线性范围为 0. 190 4 ～ 1. 142 4 μg(r = 0. 999 5) ，平均加样回收率为 102. 98%(n = 6) ;橙皮
苷线性范围为 0. 173 6 ～ 1. 215 2 μg(r = 0. 999 5) ，枸橼中橙皮苷平均加样回收率为 101. 19%(n = 6) ，佛手中橙皮苷平均回收
率为 99. 11%(n = 6)。结论:所建立的特征图谱及含量测定方法快速、准确、可靠，为香橼、佛手药材的质量控制方法提供科学
依据，可用于香橼、佛手质量的科学评价。
［关键词］ 香橼;佛手;特征图谱;含量测定;橙皮苷;柚皮苷
［中图分类号］ Ｒ284． 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)20-0103-05
［doi］ 10． 11653 /syfj2013200103
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20130808． 1523． 005． html
［网络出版时间］ 2013-08-08 15:23
Determinnaiton of Flavonoids and Study on HPLC Characteristic Spectrum
of Citrus Fructus and Citrus Sarcodactylis Fructus
JIANG Yan-yan1，ZHANG Le1，LIU Juan1，MENG Xiang-juan1，ZHOU Hai-yan2，LIU Bin1* ，LI Jun-xiang3
(1. School of Chinese Pharmacy of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China;
2. Yabao Beizhongda (Beijing)Pharmaceutical Co． Ltd．，Beijing 101300，China;
3. Dongfang Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China)
［Abstract］ Objective:To establish an HPLC method for determination and characteristic spectrum of
flavonoids in Citrus Fructus and Citri Sarcodactylis Fructus． Method:Chromatographic analysis was carried on the
coloumn of Waters SunFireTM C18 (4. 6 mm × 150 mm，5 μm) ，the mobile phase was acetonitrile-0. 1%
phosphoric acid at the flow rate of 1. 0 mL·min －1;the detection wavelength was set at 284 nm and the coloumn
temperature was 30 ℃ ． Ｒesult:The flavonoids compounds were base-isolated in HPLC characteristic spectrum．
The linear range of hesperidin was 0. 173 6-1. 215 2 μg (r = 0. 999 5) ，the average recovery was 101. 19% (n =
6)in Citrus medica，and the average recovery was 99. 11% (n = 6)in Citri Sarcodactylis Fructus． The linear
range of naringin was 0. 190 4-1. 142 4 μg (r = 0. 999 5) ，the average recovery was 102. 98% (n = 6)．
Conclusion:The method is rapid，accurate and reliable，and can be applied to the quality control of Citrus
Fructus and Citri Sarcodactylis Fructus．
［Key words］ Citrus Fructus;Citrus Sarcodactylis Fructus; characteristic spectrum;determination;
hesperidin;naringin
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2013 年 10 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 20
Oct．，2013
香橼为芸香科植物枸橼或香圆的干燥成熟果
实，味辛、微苦、酸，温，归肝、脾、胃、肺经，具有疏肝
解郁、理气和中、燥湿化痰的功效［1］。佛手为芸香
科植物佛手的干燥果实，为枸橼的变种，味辛、苦，
温，归肝、脾、胃、肺经，具有疏肝理气、和胃止痛、燥
湿化痰的功效［2］。已有研究表明，香圆和枸橼虽同
称为香橼，但二者所含主要化学成分不同，香圆含有
柚皮苷而不含橙皮苷，枸橼含橙皮苷而不含柚皮
苷［3-6］，《中国药典》(2010 年版，一部)香橼药材含
量测定项下［1］，以香圆中柚皮苷作为指标成分，而
未提及其另一品种枸橼的质量控制指标。佛手中主
要化学成分与枸橼相同，含有橙皮苷而不含柚皮苷，
《中国药典》2010 年版佛手药材含量测定项下以橙
皮苷作为质量控制指标［1］。市场上香橼药材的主
要流通品种为香圆，枸橼较为少用。在临床应用方
面，广东一带临床上常以枸橼的变种佛手代替枸橼
用药［7-10］。鉴于香圆、枸橼、佛手 3 种药材在品种来
源、化学成分、市场流通及临床应用方面的异同，为规
范香橼的品种来源，完善质量标准，本文建立了三者
黄酮类化合物的 HPLC特征图谱，并采用特征图谱测
定方法，对主要指标成分橙皮苷和柚皮苷进行含量测
定［11］，为科学评价三者质量和临床正确使用提供科
学依据。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪，包括 1525 型二元高压
梯度泵系统，2998 型 PDA检测器，2414 型柱温控制
系统，2707 型自动进样系统(美国 Waters 公司)。
Sartorious BT 25S型 1 /10 万电子分析天平(北京赛
多利斯仪器有限公司) ，KQ-500DE 型超声波清洗器
(昆山超声仪器有限公司)。
柚皮苷、橙皮苷对照品均购自中国药品生物制
品检定所(批号 柚皮苷 110722-200309，橙皮苷
110721-200613) ，乙腈(Merck 公司，色谱纯) ;屈臣
氏重蒸水(液相用水) ;其他为分析纯，均购自北京
北化精细化学品有限责任公司。
香圆 Citrus wilsonii Tanaka、枸橼 Citrus medica
L．、佛手 Citrus medica L． var． sarcodactylis Swingle
药材购自各地药材市场及药店，由北京中医药大学
陈玉婷教授鉴定。
2 溶液制备
2. 1 对照品溶液
2. 1. 1 柚皮苷 精密称取柚皮苷对照品适量，用甲
醇配制成每 1 mL 含柚皮苷 0. 095 2 mg 的对照品
溶液。
2. 1. 2 橙皮苷 精密称取橙皮苷对照品适量，用甲醇
配制成每 1 mL含橙皮苷 0. 086 8 mg的对照品溶液。
2. 2 供试品溶液
2. 2. 1 香圆 取香圆粉末(过 80 目筛)约 30 mg，
精密称定，置锥形瓶中，加 50%甲醇 50 mL，称定质
量，加热回流提取 30 min，放冷，再称定质量，用
50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。
2. 2. 2 枸橼 取枸橼粉末(过 80 目筛)约 0. 5 g，精
密称定，置锥形瓶中，加 50%甲醇 25 mL，称定质量，
加热回流提取 30 min，放冷，再称定质量，用 50%甲
醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液 15 mL，蒸
干，残渣加 50%甲醇溶解并转溶至 10 mL 量瓶中，
即得。临用前滤过。
2. 2. 3 佛手 取佛手粉末(过 80 目筛)约 1. 0 g，精
密称定，置锥形瓶中，加 50%甲醇 25 mL，称定质量，
加热回流提取 30 min，放冷，再称定质量，用 50%甲
醇补足减失的质量，摇匀，即得。临用前滤过。
3 色谱条件与系统适应性试验
Waters SunFireTM C18色谱柱(4. 6 mm ×150 mm，
5 μm) ，流动相乙腈-0. 1%磷酸梯度洗脱(表 1) ，检
测波长 284 nm，流速 1. 0 mL·min －1，柱温30 ℃，进
样量 2 ～ 20 μL。在上述色谱条件下，橙皮苷和柚皮
苷与其他成分达到基线分离，各色谱峰分离良好。
对照品及样品色谱图见图 1。
表 1 流动相梯度洗脱条件
t /min 乙腈 /% 0. 1%磷酸 /%
0 1 99
20 17 83
25 17 83
45 18 82
70 70 30
4 橙皮苷和柚皮苷的含量测定
4. 1 线性关系考察
4. 1. 1 柚皮苷 精密吸取柚皮苷对照品溶液
(0. 095 2 g·L －1)2. 0，4. 0，6. 0，8. 0，10. 0，12. 0 μL，
注入液相色谱仪，测定柚皮苷色谱峰峰面积。以对
照品进样量为横坐标，以色谱峰峰面积为纵坐标，进
行线性回归分析，得回归方程 Y = 200 821X － 40 139
(r = 0. 999 5)。结果表明，柚皮苷在 0. 190 4 ～
1. 142 4 μg与色谱峰面积呈良好线性关系。
4. 1. 2 橙皮苷 精密吸取橙皮苷对照品溶液
(0. 086 8 g·L －1)2. 0，4. 0，6. 0，80，10. 0，14. 0 μL，注
入液相色谱仪，测定橙皮苷色谱峰峰面积。以对照
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1. 柚皮苷;2. 橙皮苷;A．柚皮苷对照品溶液;
B．橙皮苷对照品溶液;C． 香圆供试品溶液;
D． 枸橼供试品溶液;E． 佛手供试品溶液
图 1 对照品及药材 HPLC色谱
品进样量为横坐标，以色谱峰峰面积为纵坐标，进行
线性回归分析，得回归方程为 Y = 162 579X － 37 540
(r = 0. 999 5)。结果表明，橙皮苷在 0. 173 6 ～
1. 215 2 μg与色谱峰面积呈良好线性关系。
4. 2 精密度试验
4. 2. 1 柚皮苷 精密吸取香圆同一供试品溶液 20
μL，注入液相色谱仪，连续测定 6 次，测定柚皮苷色
谱峰峰面积，计算得柚皮苷峰面积 ＲSD为 0. 80%。
4. 2. 2 橙皮苷 精密吸取枸橼同一供试品溶液
20 μL，注入液相色谱仪，连续测定 6 次，测定橙皮苷
色谱 峰 峰 面 积，计 算 得 橙 皮 苷 峰 面 积 ＲSD
为 1. 10%。
4. 3 稳定性试验
4. 3. 1 柚皮苷 精密吸取香圆同一供试品溶液，分
别于制备后 0，2，4，8，12 h后进样，每次 20 μL，测定
柚皮苷色谱峰峰面积，计算柚皮苷色谱峰峰面积
ＲSD为 0. 66%。结果表明供试品溶液在 12 h 内
稳定。
4. 3. 2 橙皮苷 精密吸取枸橼同一供试品溶液，分
别于制备后 0，2，4，8，12 h后进样，每次 20 μL，测定
橙皮苷色谱峰峰面积，计算橙皮苷色谱峰峰面积
ＲSD为 0. 91%。结果表明供试品溶液在 12 h 内
稳定。
4. 4 重复性试验
4. 4. 1 柚皮苷 精密称取香圆同一批样品 6 份，每
份 30 mg，按照 2. 2. 1 项下方法，分别制成供试品溶
液。精密吸取各供试品溶液 20 μL，注入液相色谱
仪，测定柚皮苷色谱峰面积，计算含量，ＲSD
为 1. 35%。
4. 4. 2 橙皮苷 精密称取枸橼同一批样品 6 份，每
份约 0. 5 g，按照 2. 2. 2项下方法，分别制成供试品溶
液。精密吸取各供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，
测定橙皮苷色谱峰面积，计算含量，ＲSD为 1. 90%。
4. 5 加样回收率试验
4. 5. 1 香圆 精密称取香圆同一批样品 6 份，每份
约 15 mg，置 50 mL锥形瓶中，各精密加入柚皮苷对
照品溶液 8. 2 mL，按照 2. 2. 1 项下方法，制备样品
溶液。精密吸取精密吸取各供试品溶液 20 μL，注
入液相色谱仪，测定柚皮苷色谱峰面积，计算回收率
及 ＲSD，结果见表 2。
表 2 香圆中柚皮苷加样回收考察(n = 6)
取样量
/mg
样品中
含量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
ＲSD
/%
15. 02 0. 787 0 0. 794 5 100. 42 102. 98 1. 28
15. 04 0. 788 1 0. 802 0 102. 75
14. 99 0. 785 5 0. 809 4 103. 6 9
15. 01 0. 785 6 0. 809 7 103. 73
15. 02 0. 787 0 0. 811 3 103. 94
15. 04 0. 788 1 0. 806 7 103. 35
注:加入量均为0. 780 6 mg。
4. 5. 2 枸橼 精密称取枸橼同一批样品 6 份，每份
约 0. 25 g，置于 50 mL锥形瓶中，各精密加入橙皮苷
对照品溶液 3. 5 mL，按照 2. 2. 2 项下方法制备样品
溶液。精密吸取各供试品溶液 20 μL，注入液相色
谱仪，测定橙皮苷色谱峰面积，计算回收率及 ＲSD，
结果见表 3。
4. 5. 3 佛手 精密称取佛手同一批样品 6 份，每份
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姜艳艳，等:香橼、佛手中黄酮类成分含量测定及 HPLC特征图谱研究
表 3 枸橼中橙皮苷加样回收考察(n = 6)
取样量
/ g
样品中
含量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
ＲSD
/%
0. 250 1 0. 325 1 0. 312 4 102. 83 101. 19 1. 71
0. 249 9 0. 324 9 0. 308 6 101. 58
0. 250 2 0. 325 3 0. 301 4 99. 21
0. 250 0 0. 325 0 0. 314 3 103. 46
0. 250 1 0. 325 1 0. 305 2 100. 46
0. 249 8 0. 324 7 0. 302 6 99. 61
注:加入量均为 0. 303 8 mg。
约 0. 5 g，置于 50 mL 锥形瓶中，各精密加入橙皮苷
对照品溶液 2. 5 mL。按照 2. 2. 3 项下方法，制备供
试品溶液。精密吸取各供试品溶液 20 μL，注入液
相色谱仪，测定橙皮苷色谱峰面积，计算回收率及
ＲSD，结果见表 4。
表 4 佛手中橙皮苷加样回收考察(n = 6)
取样量
/ g
样品中
含量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
ＲSD
/%
0. 500 2 0. 235 1 0. 210 4 96. 96 99. 11 1. 33
0. 500 0 0. 235 0 0. 215 1 99. 13
0. 499 8 0. 234 9 0. 217 6 100. 29
0. 499 9 0. 235 0 0. 216 1 99. 57
0. 500 1 0. 235 0 0. 217 9 100. 43
0. 499 8 0. 234 9 0. 213 2 98. 27
注:加入量均为 0. 217 0 mg。
4. 6 样品含量测定 将 10 份不同购买地的香圆、
枸橼和佛手样品，按照 2. 2 项下方法制备供试品溶
液，分别精密吸取对照品溶液 20 μL，香圆供试品溶
液 20 μL，枸橼供试品溶液 2 ～ 20 μL，佛手供试品溶
液 2 ～ 20 μL，分别注入液相色谱仪测定，计算含量，
结果见表 5。
5 HPLC特征图谱
5. 1 精密度试验 精密吸取 2. 2. 1 项下香圆供试
品溶液 20 μL，连续进样 6 次，测定特征图谱。结果
表明，各特征色谱峰的相对保留时间和相对峰面积
基本一致，ＲSD均 ＜ 3%，表明仪器精密度良好。
5. 2 稳定性试验 精密吸取 2. 2. 1 项下香圆供试
品溶液 20 μL，分别于制备后 0，2，4，6，8，12 h进样。
结果表明，各特征色谱峰的相对保留时间和相对峰
面积基本一致，ＲSD均 ＜ 3%，表明供试品溶液在 12
h内稳定。
表 5 10 批药材中柚皮苷、橙皮苷含量测定
No．
香圆 枸橼 佛手
样品
来源
柚皮苷
/%
样品
来源
橙皮苷
/%
样品
来源
橙皮苷
/%
1 北京 4. 64 郑州 0. 083 北京 0. 079
2 北京 3. 68 河北 0. 130 北京 0. 047
3 北京 3. 93 北京 0. 163 成都 1. 16
4 武汉 4. 90 运城 0. 116 北京 1. 16
5 北京 4. 20 昆明 0. 095 成都 0. 072
6 北京 2. 98 安国 0. 109 北京 0. 030
7 北京 5. 24 宜昌 0. 184 北京 0. 032
8 唐山 3. 02 安国 0. 116 北京 0. 034
9 临沂 2. 52 沈阳 0. 081 北京 0. 031
10 承德 2. 88 杭州 0. 148 北京 0. 043
5. 3 重复性试验 精密吸取 2. 2. 1 项下香圆供试
品溶液 20 μL，重复进样 6 次。结果表明，各特征色
谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，ＲSD
均 ＜ 2%，说明该方法重复性良好。
5. 4 特征图谱的建立及相似度评价 取 10 批香
圆、枸橼、佛手药材粉末(80 目) ，精密称定，按供试
品溶液的制备方法，制备成供试品溶液，精密吸取各
供试品溶液 20 μL，注入液相色谱仪，测定特征图
谱。其中香圆选择柚皮苷峰作为参照峰、枸橼和佛
手选择橙皮苷峰作为参照峰。选择图谱中稳定性
好、特征明显的色谱峰作为共有峰，其中香圆和枸橼
共标定了 4 个共有特征色谱峰，佛手共标定了 5 个
共有特征色谱峰。分别计算其他各特征色谱峰的相
对保留时间和相对峰面积比值。将 10 批香橼、佛手
药材 HPLC特征图谱数据文件导入国家药典委员会
开发的《中药指纹图谱相似度评价系统研究版
(2004A)》，计算相似度，生成特征图谱(图 2)。对
10 批药材图谱进行匹配，相似度范围分别在 0. 9 ～
1. 0，0. 8 ～ 1. 0，0. 8 ～ 1. 0。结果表明，因所购香圆、
枸橼、佛手 10 批药材来源于不同产地，同一药材不
同产地、不同市场来源之间存在一定差异，但药材整
体相似度较高。
6 讨论
6. 1 供试品溶液制备方法考察 对提取溶剂、提取
方式、提取时间等因素进行了考察。提取溶剂是对
实验结果影响较大的因素之一，试验中分别考察了
50%甲醇、75%甲醇、甲醇 3 种溶剂。分析比较所得
图谱，香圆、枸橼、佛手 3 种药材均采用 50%甲醇为
提取溶剂时，成分提取最完全，图谱提供的信息量
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Vol． 19，No． 20
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A．香圆;B．枸橼;C．佛手
图 2 香橼、佛手药材 HPLC特征图谱
最大。
提取方式也是对结果影响较大的因素。考察了
加热回流提取和超声波振荡提取，分析比较所得的
香圆、枸橼和佛手药材图谱，加热回流提取和超声波
振荡提取所的图谱信息量基本一致，因为加热回流
对柚皮苷和橙皮苷的提取更完全，故采用加热回流。
6. 2 检测波长选择 在 210 ～ 300 nm 对由二极管
阵列检测器所得的色谱图中每 10 nm波长的图谱进
行分析比较，以色谱峰所代表的化学成分的信息量
多少为指标，考虑香圆、枸橼、佛手中黄酮类成分的
最大吸收波长，最终确定 284 nm作为特征图谱和含
量测定的检测波长。
6. 3 流动相及梯度洗脱程度各溶剂比例选择 曾
选择甲醇、乙腈、水、0. 05%磷酸和 0. 1%磷酸进行
洗脱，结果发现用乙腈和 0. 1%磷酸洗脱时，各色谱
峰分离度及峰形均较好。
7 结果分析
7. 1 特征图谱分析 在 10 批药材的特征图谱分析
测定中，香圆和枸橼中分别生成了 4 个峰面积相对
较大的共有特征色谱峰，佛手中生成了 5 个共有特
征色谱峰。其中枸橼的 4 个共有特征色谱峰与佛手
相吻合，且均以橙皮苷为参照峰，二者与香圆并无共
同共有特征峰。
7. 2 含量测定结果分析 香圆以柚皮苷为含量测
定指标成分，枸橼和佛手则以橙皮苷作为指标成分。
从 10 批药材的含量测定结果可知，不同市场来源的
药材含量差别较大。推测药材的质量受到产地、运
输、储存等因素影响较大。
本实验结果表明，从所含化学成分物质基础及
其含量角度分析，《中国药典》将香圆和枸橼作为香
橼项下品种来源，以及将枸橼的变种佛手与枸橼分
列有待商榷。本文的研究结果为 3 种药材的规范应
用及质量标准的完善提供科学依据。
［参考文献］
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京:中国医药科技出版社，2010:242，167．
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苷的含量［J］． 中国中药杂志，2007，32(3) :265.
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［责任编辑 邹晓翠］
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姜艳艳，等:香橼、佛手中黄酮类成分含量测定及 HPLC特征图谱研究