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钩栗ISSR-PCR反应体系的建立与优化



全 文 :Vol. 35 No. 2
Feb. 2015
第 35卷 第 2期
2015年 2月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
Doi:10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.02.007 http: //qks.csuft.edu.cn
收稿日期:2014-04-21
基金项目:国家林业行业公益性项目“珍贵树种钩栗良种选育及栽培关键技术研究”(201204405)
作者简介:田艳伶,硕士研究生 通讯作者:李志辉,教授,博士生导师,博士;E-mail:lzh1957@126.com
引文格式:骆文华,代文娟,刘 建,等 . 广西火桐自然种群和迁地保护种群的遗传多样性比较 [J].中南林业科技大学学报 , 2015,
35(2):32-37.
钩栗 Castanopsis tibetana Hance又名钩锥,钩
栲,别名槠栗、大叶钩栗、大叶锥栗(浙江)、
大叶槠、巴栗、假板栗、野板栗(广西)、猴栗、
钩栲,为常绿阔叶高大乔木,高达 30 m,胸径可
达 1.5 m,树皮灰褐色,粗糙;其木材的心边材分明,
心材红褐色,边材色较淡,年轮分明,材质坚重,
耐水湿,适作坑木,梁,柱,建筑及家具材,属
红锥类,是长江以南常见的主要用材树种,也是
具有重要开发前景的珍贵用材树种,常生于海拔
1 500 m以下山地杂木林中较湿润地方或平地路旁
或寺庙周围,有时成小片纯林,主要分布在浙江、
安徽二省南部、湖北西南部、江西、福建、湖南、
广东、广西、贵州、云南东南部等 10省区,分
布广泛 [1-3]。目前,关于钩栗方面的研究还比较
少见,仅限于钩栗种群生态及生命表分析 [4-6]、
种子特性 [7]与播种育苗 [8-9]等方面。对钩栗种群
生态研究的结果表明,现存的钩栗常散生于常绿
阔叶林中,其天然更新长期停留在幼苗阶段 , 钩栗
在常绿阔叶林中有种群衰弱趋势 [4,6,9],一个物种的
生态适应性大小与其遗传度多样性水平的丰富度
密切相关,因此,研究不同钩栗种群遗传结构及
其遗传多样性,揭示钩栗种群的遗传结构特征,
钩栗 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化
田艳伶,李志辉,杨模华,张 斌
(中南林业科技大学 林学院,湖南 长沙 410004)
摘 要:本研究以钩栗叶片为实验材料,采用单因素和 L16(45)正交实验探讨了 DNA模板用量、Mg2+浓度、引
物用量、Taq DNA 聚合酶、dNTP用量以及不同退火温度对钩栗 ISSR-PCR扩增的影响,建立了钩栗 ISSR-PCR
反应体系。研究结果显示,优化后的最佳反应体系为,20 μL反应总体系中,含 30 ng模板 DNA,3 mmol/ L
Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,0.75 U Taq DNA聚合酶,0.3 μmol/L引物;对钩栗 DNA样品材料进行 ISSR-PCR扩
增体系的检测结果显示,该优化体系扩增的产物条带清晰,稳定性高,本研究为钩栗种质 ISSR分子标记遗传结
构分析提供技术基础。
关键词:钩栗;ISSR-PCR;正交设计;单因素试验;优化
中图分类号:S792.17 文献标志码:A 文章编号:1673-923X(2015)02-0032-06
Establishment and optimization of Castanopsis tibetana Hance ISSR-PCR
reaction system
TIAN Yan-ling, LI Zhi-hui, YANG Mo-hua, ZHANG Bin
(School of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)
Abstract: By taking the Castanopsis tibetana Hance leaves as the tested materials, and adopting single factor orthogonal test, the effects
of template DNA, Mg2+ concentration, primers amount, Taq DNA polymerase, dNTPs dosage and different annealing temperature on
ISSR-PCR amplification of C. tibetana were investigated, and further the C. tibetana ISSR-PCR reaction system was set up. The results
show that the optimized reaction system was consisted as follows: in the total reaction system with amount of 20 μL, there were 30 ng
template DNA, 3 mmol/L Mg2+, 0.4 mmol/L dNTPs, 0.75 U Taq DNA polymerase, 0.3 μmol/L primers, respectively. The obtained DNA
ISSR-PCR amplification system of C. tibetana the DNA sample materials were detected, and the findings suggested that the products’
bands were clear with high stability, thus laying a foundation for ISSR markers genetic diversity researches of C. tibetana germplasm.
Key words: Castanopsis tibetana Hance; ISSR-PCR; orthogonal design; single factor tests; optimization
33第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
可为钩栗珍贵用材林的营建、应用和推广提供必
要的理论依据。
简单重复序列区间扩增多态 (inter-simple
sequence repeat,ISSR)分子标记简称 ISSR,基于
SSR 的特点,用于检测 2个 SSR之间一段 DNA 序
列上的多态性 [10-12]。与其他分子标记相比,ISSR
具有操作方便、模板用量少、稳定性高、成本低廉、
结果重复性高等优点,常被用于林木种质资源遗
传结构与遗传多样性分析。建立一个稳定的 ISSR-
PCR体系是进行 ISSR分子标记遗传结构分析的基
本前提,本研究针对钩栗种质资源 ISSR遗传结构
分析的要求,对影响 ISSR-PCR反应体系的各因素
进行试验,旨建立适合钩栗 ISSR-PCR扩增的最佳
反应体系和扩增程序,为利用 ISSR 分子标记技术
研究钩栗种质遗传多样性奠定技术基础。
1 材料和方法
1.1 供试材料与试剂
对收集到的分别来自湖南、湖北、福建等 3
省区的钩栗种质资源,于 2013年在湖南省汨罗市
玉池国有林场建立钩栗种质资源收集圃。对要用
于种质资源遗传结构分析的样本,野外采取集幼
嫩叶片,装于编号的锡箔纸中,再将锡箔纸包好
放于硅胶中干燥封存,运回实验室后放于 -70℃冰
箱保存,提取 DNA备用。
钩栗 DNA提取采用植物 DNA提取试剂盒
(TINGEN)提取,琼脂糖凝胶电泳法(4~ 5
V/cm,3 ~ 35 min)检测 DNA 提取质量和浓
度(Bio-Rad 紫外凝胶成像仪),PCR 扩增在
GeneAmp PCR System 9700扩增仪上进行;所用
试剂分别为 Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs (购
自 TINGEN),标准分子量Marker ,DS2000,琼
脂糖等(由东盛公司提供),液氮购自长沙化工厂,
其他分析试剂购自长沙隆和化玻有限公司,ISSR
引物参照加拿大哥伦比亚大学 UBC的 ISSR引物
序列,由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.2 方 法
1.2.1 基因组 DNA提取与检测
对试剂盒法提取的钩栗 DNA,采用琼脂糖凝
胶电泳法检测 DNA质量,取 DNA溶液 4 μL点
样于含少量溴化乙锭的 0.7%琼脂糖凝胶中,电泳
30~ 35 min(4~ 5 V/cm),Bio-Rad紫外凝胶
成像仪成像,比照电泳条带及标准Marker,检测
DNA提取质量和浓度。
1.2.2 ISSR-PCR反应体系优化及设计
参照锥栗 ISSR遗传分析的结果 [13-14],先以预
扩增较好的引物 UBC808作为钩栗基因组 DNA扩
增体系建立的初选引物。以本实验室基本 ISSR体
系为基础:30 ng的模板 DNA,1.2 μL的 Mg2+,
0.5 μL 引 物,0.6 μL 的 dNTPs,0.3 μL 的 Taq
DNA聚合酶,10×Buffer缓冲液 2.0 μL;分别对
影响 ISSR-PCR反应体系稳定性的 5个因素(Taq
酶、DNA模板、引物、Mg2+、dNTPs)进行先进
行单因素试验,各个因素浓度水平设计见表 1;以
单因素实验结果为基础,确定了一个可用于钩栗
ISSR分析的初选体系;然后再在该初选体系上,
对以上 5个因素采用正交设计 L16(45)方法,进行
5 因素 4 水平试验(表 2),取扩增后的产物 5 μL
在 1.4% 的琼脂糖凝胶上进行电泳,PCR重复 2次,
根据 2次实验的扩增结果进行直观分析,最终确
定最佳 ISSR反应体系。
L16(45)正交设计扩增结果的直观分析,参
照何正文等 [15]的评分的方法,对 2次独立正交试
验的扩增条带,各自依据谱带的多少、强弱和杂
带的多少对 PCR 扩增结果进行评分,条带数量丰
富、清晰、稳定的最佳产物记 16 分,最差的计 1 分。
2次重复分别独立统计,最后得出相应的平均分数
以供实验分析。
表 1 影响ISSR-PCR扩增的因素水平
Table 1 Factors and levels influencing amplification of
ISSR-PCR
因素 试剂浓度
各因素水平梯度
1 2 3 4 5 6
DNA模板 /μL 50 ng/μL 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
引物 /μL 10 μmoL/L 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.5
Mg2+ /μL 50 mmol/L 0.8 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
dNTPs /μL 10 mmol/L 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.5
Taq酶 /μL 5 U/μL 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5
1.2.3 钩栗 ISSR-PCR多态性引物的筛选
采用 UBC808优化的 ISSR-PCR体系,对来自
3个不同省区钩栗的 3个 DNA模板,分别对 100
条 ISSR引物进行筛选,选择扩增条带清晰,多态
性丰富,稳定性高的引物,作为可用于遗传结构
分析的多态性引物。
1.2.4 ISSR-PCR多态性引物最适扩增程序的确定
基于 UBC808引物所建立的最佳 PCR反应体
系的基础上,对选择出来的 12个多态性 ISSR引
物,利用梯度 PCR仪对每条多态引物的理论 Tm
田艳伶,等:钩栗 ISSR-PCR反应体系的建立与优化34 第 2期
值(Tm - 5 ℃)~(Tm + 5 ℃)附近设置退火温
度 [16],进行最佳退火温度和循环次数的扩增程序
优化实验,选出条带数量多且清晰的退火温度作
为该特定引物 PCR扩增的最佳退火温度。
表 2 正交钩栗ISSR反应正交试验设计L16(45)
Table 2 ISSR reaction orthogonal design L16(45) for Castanopsis tibetana
处理号
影响因素(体积 μl)
扩增结果赋值
DNA模板 (50 ng/μL) Mg2+ (50 mmol/L) dNTPs (10 mmol/L) Taq酶 (5 U/μL) 引物 (10 μmoL/L)
1 0.4 0.5 0.2 0.15 0.4 1
2 0.4 1.0 0.4 0.2 0.6 14
3 0.4 1.2 0.6 0.3 0.8 13
4 0.4 1.4 0.8 0.4 1.2 9
5 0.6 0.5 0.4 0.3 1.2 8
6 0.6 1.0 0.2 0.4 0.8 6
7 0.6 1.2 0.8 0.15 0.6 16
8 0.6 1.4 0.6 0.2 0.4 15
9 0.8 0.5 0.6 0.4 0.6 4
10 0.8 1.0 0.8 0.3 0.4 11
11 0.8 1.2 0.2 0.2 1.2 3
12 0.8 1.4 0.4 0.15 0.8 5
13 1.0 0.5 0.8 0.2 0.8 12
14 1.0 1.0 0.6 0.15 1.2 7
15 1.0 1.2 0.4 0.4 0.4 10
16 1.0 1.4 0.2 0.3 0.6 2
2 结果与分析
2.1 DNA提取质量检测
不同钩栗样品采用试剂盒法提取的钩栗 DNA
电泳检测结果见图 1,电泳检测结果显示,基因
组 DNA电泳呈一条整齐的带型,无拖带、弥散
现象,这说明本方法提取的钩栗 DNA 质量较高,
蛋白质、多糖和酚类等杂质基本去除,所提取的
DNA 质量均能够满足进行 ISSR分子标记分析的
质量要求,待对每个样品检测其原始DNA浓度后,
稀释至 50 ng /μL备用。
的用量(0.2~ 1.2 μL)进行 PCR扩增,结果如图
2。图 2的结果表明,反应体系中适量的模板浓度,
对 ISSR-PCR的体系建立非常关键,其中以 0.6 μL
左右的模板用量为钩栗 ISSR-PCR 反应体系的最佳
DNA用量;当模板DNA 用量为 0.2 μL 时,无条带;
在 0.4~ 1.2 μL时,扩增出的条带呈现出由模糊到
清晰再模糊的表现,以 0.6 μL时的清晰度最高;
超过 1.2 μL 时,非特异性条带数目增多,且清晰
图 1 钩栗叶片基因组 DNA电泳质量检测
Fig.1 Electrophoresis quality testing of genomic DNA of
C. tibetana leaves
M: Marker DS2000; 1~ 6DNA加入量分别为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μL.
图 2 不同水平模板 DNA用量对 ISSR扩增的影响
Fig.2 Effects of different DNA template levels on ISSR
amplifi cation
2.2 ISSR-PCR反应体系单因素试验结果分析
2.2.1 DNA模板不同用量对钩栗 ISSR-PCR的影响
在基本反应体系中,设定钩栗 DNA模板不同
35第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
度减弱。因此,选择 0.6μL左右的模板用量为钩栗
ISSR-PCR 反应体系的最佳用量,即反应体系中 30
ng的模板 DNA用量比较适宜。
2.2.2 Mg2+浓度对 ISSR-PCR的影响
Mg2+浓度影响引物与模板双链的解链。退火
温度、Taq DNA聚合酶的活性和产物的特异性也
都受Mg2+浓度的影响 [17-18]。在基本反应体系中,
设定了 Mg2+ 不同的用量(0.6 ~ 2.0 μL)进行
PCR扩增,结果如图 3。图 3的结果表明,最佳
的Mg2+用量为 1.2 μL。当Mg2+用量 0.6~ 0.8 μL
时条带量少且条带背景模糊;随着Mg2+用量升高
(1.0~ 1.4 μL)条带清晰,主次带分明,特异性
好;当Mg2+用量超过 2.0 μL 时,PCR扩增的特异
性降低,明显影响了 PCR扩增产量,甚至不能扩
增出条带。因用量为 1.2 μL时最清晰稳定,故用
作为钩栗 ISSR-PCR反应体系中Mg2+最适用量,
结合Mg2+的原初储备液浓度,得到每个反应体系
中Mg2+最适的摩尔浓度为 3 mmol/L。
研究结果表明,钩栗 ISSR反应体系中,以 0.8 μL
的 dNTPs用量为钩栗 ISSR-PCR 反应体系的最佳
DNA用量;当 dNTPs用量为 0.4 μL 时,条带数量
少;在 0.6~ 1.2 μL时,扩增出的条带呈现出由模
糊到清晰再模糊的表现,以0.8 μL时的清晰度最高;
超过 1.0 μL 时,条带明显减少且清晰度减弱。因此,
选择 0.8 μL的 dNTPs用量为钩栗 ISSR-PCR 反应
体系的最佳用量,合算其摩尔浓度为 0.4 mmol/L。
M: Marker DS2000;1~ 6 Mg2+加入量分别为 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、2.0 μL.
图 3 不同水平Mg2+对 ISSR扩增的影响
Fig.3 Effects of different Mg2+ levels on ISSR amplifi cation
2.2.3 不同引物浓度对钩栗 ISSR-PCR体系建立的
影响
从图 4可以看出,在基本反应体系中设定的
引物不同用量(0.2~ 1.5 μL)进行 PCR扩增的结
果表明,引物用量为 0.6 μL时条带反应稳定且清
晰。当引物用量为 0.2 μL时,无条带产生;随着
引物用量的升高(0.4~ 1.5 μL),条带清晰度由
弱到强;当引物用量为 1. μL时条带背景开始弥漫
且条带模糊。因此,选用引物用量 0.6 μL作为钩
栗 ISSR-PCR 反应体系的最佳用量,合算每个反应
体系中引物的摩尔浓度为 0.3 μmol/L。
2.2.4 dNTPs浓度对 ISSR-PCR的影响
dNTPs 浓度太高容易产生错误掺入,浓度太
低又会降低产率 [19]。因此,合适的 dNTPs 浓度是
建立 ISSR-PCR 稳定体系的必要条件,本研究的
M: Marker DS2000;1~ 6 dNTPs加入量分别为 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 μL.
图 5 不同水平 dNTPs对 ISSR扩增的影响
Fig.5 Effects of different dNTPs levels on ISSR amplifi cation
M: Marker DS2000;1~ 6 引物加入量分别为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 μL.
图 4 不同水平引物对 ISSR扩增的影响
Fig.4 Effects of different primer levels on ISSR amplifi cation
2.2.5 Taq DNA聚合酶用量对 ISSR-PCR的影响
在 ISSR-PCR反应中,Taq DNA聚合酶的活性
与浓度对扩增反应有着重要的影响,浓度过低会导
致扩增产物不足或者不能扩增,浓度过高会产生弥
散现象,非特异性扩增产物增多 [20-21]。1~ 5 泳道
代表不同Taq 酶用量(0. 5~ 2.5 U)的扩增产物(图
6)。 图 6的结果显示,当加入 0.75 U的 Taq 酶
时,扩增条带最清晰且主次带分明。Taq DNA聚
合酶加入量为 0. 5 U时,条带弥散背景模糊且条
带少;随着 Taq DNA聚合酶加入量的增加,扩增
出的条带呈现出由清晰再模糊的表现。因此,选
用 0. 75U的 Taq DNA聚合酶用量作为钩栗 ISSR-
田艳伶,等:钩栗 ISSR-PCR反应体系的建立与优化36 第 2期
PCR 反应体系的最佳用量。
2.3 钩栗 ISSR-PCR正交设计试验结果分析
从正交试验设计 ISSR-PCR扩增结果(图 7)
可以直观看出 [22],处理 7和处理 8扩增效果最好,
不仅条带的多态性好、谱带清晰,而且扩增效果
稳定。根据评分赋值可计算出每个因素同一水平
下的试验值之和 Ki以及每一因素各水平下的数据
平均值 ki,并求出同一因素不同水平间平均值的极
差 R(表 3)。某影响因子极差 R的高低反映了该
影响因素水平的变化对反应体系的影响程度,R越
大,影响越显著。由表 3可知各因素对钩栗 PCR
反应的影响从大到小依次为:dNTPs>模板 DNA
>Mg2+> Taq 酶>引物。每一因素各水平下的数
据平均值 ki反映了该影响因素水平下反应体系的
状况,ki值越大,该因素水平表现越好。由表 3可
知钩栗 ISSR-PCR 反应中 5 个影响因素的最佳反应
水平组合可以推断为(20 ng模板 DNA,3 mmoL/L
Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,1 U Taq DNA聚合酶,
0.2 μmoL/L引物),该最佳组合,与分值最高的
7号处理接近。综合考虑单因素对比实验结果,
选择处理 7为最佳反应体系,即:优化后的最佳
反应体系为 20 μL反应总体系中,含 30 ng模板
DNA,3 mmoL/L Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,0.75
U Taq DNA聚合酶,0.3 μmoL/L引物。
表 3 正交试验数据分析
Table 3 Data analysis of orthogonal tests
结果
影响因素
模板 DNA Mg2+ dNTPs Taq酶 引物
K1 47 25 12 29 37
K2 45 38 37 44 36
K3 23 42 39 34 36
K4 31 31 48 29 25
k1 11.75 6.25 3.00 7.25 9.25
k2 11.25 9.50 9.25 11.00 9.00
k3 5.75 10.50 9.75 8.50 9.00
k4 7.75 7.75 12.00 7.25 6.25
R 6.00 4.25 9.00 3.75 3.00
2.4 ISSR-PCR扩增多态性引物稳定扩增程序的
筛选
从 UBC100条 ISSR引物里共筛选出了 12条
条带清晰多态性好且可用于遗传结构分析的多态
性引物,根据不同的引物确定了最佳的 ISSR-PCR
退火温度,如表 4。
表 4 引物及其退火温度
Table 4 Primers and annealing temperature
引物 碱基序列(5′~ 3′) 最佳退火温度
UBC-807 AGAGAGAGAGAGAGAGT 50.7℃
UBC-808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 59.3℃
UBC-817 CACACACACACACACAA 50.4℃
UBC-819 GTGTGTGTGTGTGTGTA 50.0℃
UBC-821 GTGTGTGTGTGTGTGTT 55.0℃
UBC-824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 50.3℃
UBC-830 TGTGTGTGTGTGTGTGG 54.2℃
UBC-836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA 52.3℃
UBC-842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 58.6℃
UBC-846 CACACACACACACACART 53.8℃
UBC-880 GGAGAGGAGAGGAGA 50.0℃
UBC-888 BDBCACACACACACACA 57.4℃
2.5 不同钩栗样品 ISSR-PCR反应体系稳定性及
适用性的验证
随机选取 821引物对优化后的体系及扩增程
序进行稳定性验证。 验证结果如图 8和图 9所示。
所选引物对其中 20份钩栗材料进行扩增,扩出的
条带多且清晰,无特异性条带,说明该体系稳定,
适合钩栗基因组 DNA 的 ISSR-PCR 扩增。
M: Marker DS2000;1~ 6Taq酶加入量分别为 0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5 μL.
图 6 不同水平 Taq酶对 ISSR扩增的影响
Fig.6 Effects of different Taq DNA polymerase levels on
ISSR amplifi cation
图 7 正交试验 PCR产物电泳结果
Fig. 7 Electrophoresis of orthogonal design PCR products
37第 35卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
3 讨 论
单因素实验只考虑了各因素不同水平对试验
结果的影响,忽略了因素之间的交互作用,而正
交设计试验,其结果的评价带有一定的主观性,
降低了最佳反应水平的的可靠程度。本实验采用
单因素和正交设计相结合的方法,在一定程度上
避免了各自的局限性,获得了钩栗 ISSR-PCR的最
佳反应体系,用于不同样品的遗传多样性检测。
本试验得出 dNTP浓度和模板 DNA浓度是影
响 PCR 扩增的主要因素,其次是Mg2+浓度和 Taq
DNA聚合酶用量;而在已研究的单因素试验中却
发现Mg2+对 PCR 扩增均有显著影响,而引物浓度
对扩增影响不显著。本实验中发现,dNTP浓度是
影响本体系建立的最为重要的影响因子,这可能
与 dNTP购买时较高的初始储存浓度有关(达到了
10 mmol/L),即使实验过程中 dNTP用量的小幅
度变化也能造成显著地影响。
本研究中所建立的 ISSR 稳定反应体系可为钩
栗 ISSR 种质遗传分析及遗传多样性鉴定奠定重要
的技术基础和技术依据。
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[本文编校:吴 彬 ]
图 8 821号引物在优化后的体系下扩增 20个样品的 PCR
结果
Fig.8 PCR results of 20 specimens with peimer-821 and
after optimized reaction system