全 文 ：收稿日期:2005-12-01;　修订日期:2006-05-16
作者简介:程　华(1978-),男(汉族),湖北应城人 ,现在读华中科技大学
博士研究生 ,主要从事植物分子生物学研究工作.
*通讯作者简介:周蓬蓬 (1963-), 女(汉族),安徽合肥人 , 现任华中科技
大学生命科学与技术学院副教授 ,主要从事生物技术研究工作.
濒危植物岩黄连叶片中基因组 DNA的提取及分析
程　华 , 周蓬蓬* , 余龙江 , 胡琼月 , 朱　路 , 刘　智 , 敖明章
(华中科技大学生命科学与技术学院 ,湖北 武汉　430074)
摘要:目的 获取高质量的岩黄连基因组 DNA。方法 用改进的 SDS -CTAB法从岩黄连叶片中提取基因组 DNA, 通过琼
脂糖凝胶电泳 、紫外分光光度法 、 PCR检测其质量 , 并与传统的 CTAB法比较。结果 通过改进的 SDS-CTAB法提取的
DNA优于 CTAB法提取的 DNA,电泳条带清晰 , 纯度高 ,能较好的进行 PCR。结论 改进的 SDS-CTAB法适合岩黄连基因
组 DNA的提取。
关键词:岩黄连;　基因组 DNA;　SDS-CTAB法
中图分类号:Q946. 2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2006)09-1699-02
Isolation and Analys is ofGenom ic DNA from Leaves ofCorydalis saxico la Bunting
CHENG H ua, ZHOU Peng-peng* , YU Long-jiang, HU Q iong-yue, ZHU Lu, L IU Zhi, AO M ing-zhang
(College of L ifeS cience＆Technology, HuazhongUniversity ofScience＆ Technology, Wuhan 430074, Ch ina)
Abstract:Objective In orde r to obta in high qua lity genom ic DNA o fCoryda lis saxicola Bunting, an e ffective m ethod was e stab-
lished. Methods Two differen tm e thods, CTAB m ethod and im proved SDS-CTAB m ethod, w ere app lied to iso la te genom ic DNA
from leaves ofC. saxicola. The DNA obta ined w as ana ly zed by them eans o f aga rose ge l e lec trophoresis, spectropho tom e te rmeas-
urem en t and PCR. R esu lts H ighe r purity DNA w as obtained by im proved SDS-CTAB m e thod and it showed good response to
PCR. C onclusion The improved SDS-CTAB m ethod w as favorab le for the ex traction of genom ic DNA from C. sax icola.
Key words:Coryda lis sax icola Bunting;　Genom ic DNA;　 the SDS-CTAB m ethod
　　岩黄连(Coryda lis saxicola Bun ting), 紫堇科紫堇属植物 ,多年
生草本 [ 1～ 3] 。全草含脱氢卡维丁(岩黄连碱 )等活性成分 [ 4] ;具
有显著的抗菌 、消炎 、镇痛和强安定作用 , 是常用于消炎止痛 、排
毒 , 治疗急慢性肝炎和肝硬化等疾病的一种中草药 [ 4 , 5] 。岩黄连
分布局限于石灰岩山区 , 属石山特有种 , 现在资源极少 ,被列为中
国南部石灰岩稀有濒危植物 [ 3] 。为了研究岩黄连的致濒机制 ,
有必要对其遗传多样性进行分析 , 而岩黄连基因组 DNA 提取是
在分子水平上对其进行系统分析与研究的基础性工作 ,获得高质
量的 DNA是进行这些工作的必备前提。目前这方面的研究未见
报导。由于植物细胞通常含有大量多糖 、多酚及次生代谢产物 ,
严重干扰 DNA的抽提 , 提取完整性好 、纯度高的 DNA并非易事。
本文用改进的 SDS-CTAB 法从岩黄连叶片成功抽提出基因组
DNA,与传统 CTAB法比较 , 提取的 DNA 纯度高 , 能较好的进行
PCR,为在分子水平研究岩黄连遗传多样性的开展奠定良好
基础。
1　材料与方法
1. 1　材料 岩黄连植株采自广西马山县 , 以新鲜叶片作为实验
材料。
CTAB、SDS、EDTA、T ris-C l购于 Am re sco公司 , 其他试剂均为
国产分析纯。 裂解缓冲液 (1. 0 mo l /L NaC l, 50 mm o l /L T ris, 50
mm o l /L EDTA, pH 8. 0);5×CTAB (5% CTAB , 1. 0 m o l /L NaC l,
50 mm o l /L EDTA, 250 mm o l /L T ris, pH 8. 0);TE(1 mmo l /L ED-
TA, 10 mm o l /L T ris-C l, pH 8. 0)。
1. 2　方法
1. 2. 1　改进的 SDS-CTAB 法 对 SDS -CTAB法 [ 6, 7]进行改进。
称取适量经 75%乙醇表面消毒的样品于预冷的研钵 ,加入 1%聚
乙烯吡咯烷酮(PVP),液氮研磨 , 然后收集于离心管;加等体积的
65℃预热的裂解缓冲液和 4% SDS(W /V), 冻融两次 , 充分溶解
后 65℃恒温 30 ～ 40 m in;10 000 r /m in离心 5 m in去沉淀 ,量上清
液体积 , 加 1 /5倍体积的 5×CTAB, 65 ℃继续恒温 10 m in;加入
等体积 5 m o l /L的 KAc, 冰浴 20 m in, 4℃ 12 000 r /m in 离心 10
m in,转移上清至另一干净的离心管中;加等体积的氯仿 /异戊醇
(v /v, 24∶1) , 缓慢倒转离心管使溶液成为乳状并保持几分钟 ,
12 000 r /m in离心 10 m in, 上清液再转至另一离心管 , 重复用氯
仿 /异戊醇抽提两次并离心;上清液转至另一离心管后 ,加等体积
预冷的异丙醇 , 充分振荡后 , 于-20℃放置 2 h, 离心沉淀 DNA,
75%乙醇冲洗 3次 ,晾干后加适量的 TE溶解 , -20℃保存待用。
1. 2. 2　常规 CTAB法 参考文献方法 [ 8] 。
1. 2. 3　DNA 质量鉴定 参考顾红雅等 [ 8]的方法。取 5 μl DNA
样品稀释 100倍后在紫外分光光度计(日本岛津 UV 240)上测定
230, 260 nm 和 280 nm 时的吸光度值 , 并计算其比值和产量 。另
取 5 μl DNA样品在 0. 8%的琼脂糖凝胶 (含有溴化乙锭)上电
泳 , 胶块经凝胶成像系统 (Bio-Rad gel-doc 2000 system)扫描
存档。
1. 2. 4　PCR检测 以两种方法提取的基因组 DNA 为模板 ,植物
18S通用引物 (上海申友公司合成 ):P1, 5-CAA CCT GGT TGA
TCC TGC CAG T-3;P2, 5-CTG ATCCTT CTG CAG GTT CAC CTA
C-3。在 PCR仪(B iom e tra T1 Therm ocycler)上进行 PCR反应 , 采
用 TaKaRa的 PCR试剂盒 ,其中 TaKaRa Taq聚合酶 0. 5 μl, 10×
PCR buffe r 5μl, dNTPM ix tu re (10 mmo l /L each) 2 μl, 25 mm o l /L
上下游引物各 1 μl,模板 DNA 2 μl, 总体积 50 μl。反应条件为:
95℃ 5 m in;94℃ 1 m in, 48 ～ 56℃ 1 m in, 72℃ 2 m in, 30个循环;
72℃ 10 m in。然后取 PCR产物 10 μl在 0. 8%琼脂糖凝胶上电
泳 , 胶块经凝胶成像系统扫描存档。
2　结果
2. 1　 DNA 提取结果 采用改进的 SDS-CTAB法提取的 DNA 外
观上为白色沉淀 , 而 CTAB 法提取的 DNA 带少许褐色 , 表明
CTAB法提取的 DNA中有少许酚类物质被氧化。从表 1可以看
出 , 由改进的 SDS-CTAB 法得到的的岩黄连叶片基因组 DNA 提
取液的 OD 260 /OD 280均在 1. 8 ～ 2. 0之间 , 说明提纯效果较好 , 没
有蛋白质等大分子的污染;260 nm 和 230 nm 下的吸光度值之比
在 2. 0 ～ 2. 1之间 , 表明 DNA提取液中基本上没有残存的小分子
杂质;图 1的结果也显示 SDS-CTAB 法提取的 DNA条带清晰单
一 , 大小 20kb左右 , 没有发生断裂 , 也没有 RNA、多糖等杂质污
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LISH IZHEN M EDIC INE AND MATER IA MED ICA RESEARCH 2006 VOL. 17 NO. 9 时珍国医国药 2006年第 17卷第 9期
染。而 CTAB法提取的 DNA样品 OD
260
/OD
280
值在 2. 0以上 ,电
泳照片显示 3条带(图 1), 上面一条为 DNA, 下面 2条为杂带 ,表
明有 RNA污染;OD
260
/OD
230
值在 2. 0以下 ,说明还存在小分子或
盐类杂质。改进的 SDS-CTAB法提取 DNA 的产量为(222. 5 ±
2. 9)μg /g (鲜叶片), CTAB法提取的 DNA产量由于污染无法精
确计算。
表 1　两种不同方法提取的岩黄连基因组 DNA
样品编号 提取方法 OD260 /OD280 OD 260 /OD230 DNA 产量
C /μg g-1
1 改进的 SDS-CTAB法 1. 87 2. 07 225. 3
2 改进的 SDS-CTAB法 1. 81 2. 03 219. 6
3 CTAB法 　　　　 2. 52 1. 73 -
4 CTAB法　　　　 2. 55 1. 62 -
1, 2:改进的 SDS-CTAB法提取的岩黄连基因组 DNA;　
3, 4:CTAB法提取的岩黄连基因组 DNA
图 1　岩黄连 DNA的电泳图
2. 2　PCR检测 如图 2所示 , 1, 2, 3是以 CTAB法提取的 DNA为
模板 , 退火温度为 48℃, PCR扩增的结果 , 未见明显条带 , 表明
DNA模板的纯度不够 , 影响 PCR反应的进行。 4 ～ 12是以 SDS-
CTAB法提取的 DNA为模板 ,不同退火温度下的 PCR扩增结果 ,
其中 4, 5, 6的退火温度为 48℃, 7, 8, 9的退火温度为 52℃,
10, 11, 12的退火温度为 56℃;48℃扩增时 , 出现明显的非特异
性扩增 , 呈现 3条带;52℃时 , 扩增效果好 , 扩增出来的条带单一
而且亮度高 , 说明退火温度的提高有助于减少了非特异性扩增;
56℃时 , 扩增效果较好 ,但条带亮度减弱 , 可能是由于退火温度的
进一步升高 , 导致引物与模板退火不完全 , 导致产物减少所致。
结果表明改进 SDS-CTAB法提取的 DNA 模板质量高 , 能较好的
进行 PCR反应 , 在合适的退火温度下 , 可扩增出理想条带;而
CTAB法提取的 DNA模板没有扩增出明显条带 ,说明 DNA质量
不高 , 不能进行有效扩增。
图 2　岩黄连基因组 DNA的 PCR产物图
3　讨论
随着分子生物学技术的不断发展 , 提取植物的基因组 DNA
进行 PCR扩增 、基因克隆 、RAPD、AFLP、SSR及 ISSR分析显得越
来越重要 , 而获得高质量的 DNA是必备的前提。基因组 DNA的
提取过程 , 可以简单分为 3个连续的步骤:(1)细胞破壁 , 植物细
胞具有坚韧的细胞壁 ,这是提取过程中必须克服的障碍 , 适当的
前期处理会对后面结果造成明显影响;(2)去除杂质 , 包括蛋白
质 、多糖 、RNA等 , 这一步直接关系到提取的质量;(3)沉淀 DNA,
通常用预冷的乙醇或异丙醇沉淀 DNA, 得到纯化的产物。在植
物组织提取 DNA过程中 ,多酚 、多糖及其他次生代谢产物 , 能和
核酸发生不可逆的结合 ,如果处理不当 , 就会严重抑制内切酶和
DNA聚合酶的作用 , 从而影响后续的研究工作 [ 9] 。由于不同植
物及同一植物不同组织的结构及生化成分各不相同 ,而这些结构
和成分上的差异对 DNA的不同提取方法往往会造成不同程度的
影响 , 导致了不同方法所得的 DNA 在纯度和质量上的明显差
异 [ 10] 。因此 ,在实际工作中 , 应根据实验材料的特点 , 建立适当
的提取方法。
针对岩黄连叶片中含有大量的蛋白 、酚类物质 、多糖以及丰
富的次生代谢物质 , 对 SDS-CTAB法进行了改进 , 主要体现在以
下几个方面:在研磨时加入 PVP, 防止酚类物质和其他次生代谢
物质的干扰 , PVP不但可有效吸附色素类物质 , 而且还可以起到
石英砂的作用 ,有助于样品的粉碎 [ 11] ;可溶性 PVP进入缓冲液
之后可以以氢键方式与多酚 、萜烯和单宁类物质结合 , 阻止这些
物质与核酸作用 ,对抑制多酚氧化酶和细胞色素氧化酶也能起到
很好的效果 , 从而防止 DNA褐变 [ 12] ;采取两次冻溶步骤 ,利用热
胀冷缩的原理使绝大部分细胞破壁 ,以弥补液氮研磨之不足 [ 11] ,
提高 DNA 的提取量;中期去除杂质时 , 加入高浓度的 KAc
(5 m ol /L)在低温的情况下可以达到去除多糖类物质的效果;增
加用氯仿 /异戊醇的抽提次数来达到完全去除蛋白质的目的 , 经
过连续 3次抽提后 ,两相界面中间已没有由蛋白质等物质形成的
白色层;后期 DNA沉淀时 , 没有使用无水乙醇 , 改用沉降效果较
好的异丙醇 ,并延长静置时间 , 使得 DNA 能够完全沉淀出来。电
泳条带清晰明亮(图 1), 无拖尾杂带现象 , 得到的 DNA质量好 、
纯度高 。 PCR检测也说明在合适的退火温度下 , 改进的 SDS-
CTAB法提取的 DNA 可以扩增出理想的条带 (图 2)。而采用
CTAB法提取的 DNA存在 RNA污染 , PCR扩增不出明显条带 ,
表明所提 DNA质量不高。此外 , 改进的 SDS-CTAB法耗时短 , 操
作简便 , 易于推广使用。同时 ,我们发现只要使样品充分裂解 , 无
论是成熟的老叶还是幼嫩的新叶或者茎 , 都可以得到较好的
DNA提取物 , 说明该法对岩黄连不同组织有较好的通用性。
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