全 文 ：细叶桉 ISSR-PCR体系的建立与优化
田　华 ,张党权 ,谭晓风 ,黄青云 ,邓顺阳 ,樊绍刚 ,谷振军
(中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 ,湖南长沙 410004)
摘　要: 细叶桉是我国近年来成功引种的耐寒桉树种类之一 ,但其种源关系难以区分 ,不利于后续新品种
的培育。为给后续的分子水平上鉴定细叶桉种源关系打基础 ,以细叶桉叶片基因组 DN A为材料 ,分析了能够
影响细叶桉 IS SR-PCR的主要参数如模板 DN A、引物浓度、 dN TPs、 Mg2+ 浓度、 TaqDN A聚合酶用量、退火温
度等 6个因素对扩增结果的影响情况 ,建立了适用于细叶桉 ISSR-PCR的反应体系和扩增条件。
关键词: 细叶桉 ; IS SR-PCR;反应体系 ;扩增条件
中图分类号: S727. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1003- 8981( 2009) 01- 0013- 04
Establishment and Optimization of ISSR-PCR System
of Eucalyptus Teretticornis
TIAN Hua, ZHANG Dang-quan, TAN Xiao-f eng, HUANG Qing-yun, DENG shun-yang, FAN Shao-gang, GU Zhen- jun
( The Key Lab o f Non-w ood Fo rest Products o f Fo r estry Ministr y,
Central South Univ er sity o f Fo rest ry and Technolog y, Chang sha 410004, Hunan, China)
Abstract: Eucalyptus teretticornis is one co ld-resistant species o f Eucalyptus which had been
successfully int roduced into China in recent yea rs, but its provenance r elations were difficult to
distinguish, which was disadvanta geous to the br eeding o f follow -up new va riety . In o rder to
la y the founda tion for identifica tion o f Eucalyptus teretticornis provenance rela tions on molecular
lev el, effect o f six ISSR-PCR param eters o f Eucalyptus teretticornis on amplification r esults
w ere analy zed using genomic DN A o f Eucalyptus teretticornis leav es, such as do sage of templa te
DN A and TaqDN A polyme rase, concent ration o f primer , Mg2+ and dNTPs, and annealing
tempera ture. Suitable r ea ction system and amplification conditions o f Eucalyptus teretticornis
I SSR-PCR w ere fina lly established.
Key words: Eucalyptus teretticornis; ISSR-PCR; r eac tion system; amplification conditions
近年来 ,分子标记的研究与利用得到了迅速的发展 ,特别是以 PCR为主的分子标记技术的发展为植物的
遗传改良提供了新的途径 ,也为有关优良种质资源的鉴定、分类及起源进化等方面的研究提供了一种较为可靠
的研究方法。 ISSR正是基于 SSR而发展起来的 , SSR也被称为微卫星 ( Micro-satelli te) [1 ] ,是指由 2～ 6个碱基
组成的基本序列串联重复而组成的短片段 ,广泛存在于真核基因组中。 ISSR( Inter-simple sequence repea t,简
单重复序列区间 )标记技术的基本原理是 ,首先根据基因组内广泛存在的微卫星序列设计单一引物 ,对两侧具
有反向排列 SSR的一段 DNA序列进行 PCR扩增。 ISSR引物通常为 16～ 21个碱基 ,其主体是由 2～ 4个碱基组
成的串联重复序列 ,然后在其 5′端和 3′端加上 1～ 4个锚定碱基 ,从而保证 ISSR引物能够对 SSR之间的 DNA序
列进行 PCR扩增 [ 2]。同时 , ISSR通常为显性标记 ,呈孟德尔式遗传 ,具有很好的稳定性和多态性、 DNA用量
少、成本低等特点 [3 ]。目前 , ISSR能够更加高效地检测出基因组的多样性 ,被认为是集 RAPD技术和 SSR技术
优点于一身的分子标记技术 ,主要应用于遗传作图、基因定位、种质资源研究、遗传多样性分析等方面。
桉树是桃金娘科桉属的总称 ,为原产于澳大利亚的高大乔木。 细叶桉 Eucalyptus terett icornis sm .以其生长
经济林研究　 2009, 27( 1): 13-16
Nonwood　 Forest　Research 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
收稿日期: 2008-06-04
基金项目: 湖南省长沙市科技计划重点项目“转基因抗寒桉树新品种的培育与应用” ( K069083— 22)。
作者简介: 田　华 ( 1980- ) ,女 ,辽宁锦州人。 硕士研究生 ,主要从事林业生物技术的研究。
通讯作者: 张党权 ( 1976— ) ,男 ,江西临川人。 副教授 ,硕士研究生导师 ,博士 ,主要从事植物分子生物学与基因工程的研究。
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1003 -8981. 2009. 01. 018
快、适应性强、用途广的特点而被世界上 120多个国家和地区广泛引种栽培 ,近年来跃居为世界人工造林的第二大
类造林树种 ,是目前世界上最重要的木浆纸原料树种之一 [4 ]。 桉树的引种栽培在我国已有一百多年的历史 ,已成
为我国南方热带、亚热带地区最为重要的速生丰产林造林树种 ,在我国以木浆造纸的生产中有着及其重要的地
位。 虽然我国引种的桉树种类达 300多种 ,但是用于生产性造林的只有 10余种 [ 5, 6 ]。细叶桉天然分布广泛 ,南纬
6～ 38°均有分布 ,属于较为耐寒的桉树品种 ,常作为耐寒桉树新品种杂交培育的亲本。自 1890年在广州引种以来 ,
我国广东、广西、云南、海南、浙江、福建、四川等十多个省区先后大面积栽培细叶桉 [7～ 9 ]。然而 ,在长期的引种栽培
推广中 ,细叶桉的种源关系渐渐难以查明 ,这对后续新品种的培育极为不利。为此 ,文中采用 ISSR分子标记技术 ,
建立了 ISSR-PCR反应体系并进行优化 ,以期为后续分子水平上鉴定细叶桉种源关系打下基础。
1　材料与方法
1. 1　材料与试剂
试验所用的细叶桉新鲜叶片采自湖南省株洲市中南林业科技大学校内 ,为原中南林学院于 1988年从澳大利
亚引种到湖南株洲且引种成功的 6个细叶桉种源的树种。将采集的叶片洗净后 ,于 - 70℃超低温冰箱中保存。
PCR所用主要试剂 Taq DN A聚合酶购自大连 TaKaRa公司和东盛生物公司 , GeneRuler 100 bp plus
DN A Ladder和 1kb DN A Ladder购自 Fermentas公司 ,所用引物参照了从哥伦比亚大学 ( UBC)设计的 100条
引物序列中随机筛选的合适的细叶桉扩增引物序列 ,由上海英骏生物技术有限公司合成 ,其它生化试剂和常规
试剂均为分子生物学纯或分析纯。
1. 2　方　法
1. 2. 1　基因组 DNA的提取
采用改良 CTAB法 [10 ]提取桉树叶片的基因组 DNA。
1. 2. 2　 ISSR-PCR反应体系的优化
分别对细叶桉 ISSR反应中的 DNA模板的浓度、 Taq酶的选择和含量、Mg2+ 、 dN TPs、引物浓度、退火温度
等 6个因素进行了条件优化实验。
在 20μL的总反应体系中 ,模板 DNA浓度梯度分别为 5、 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70 ng· μL- 1 ,共 8个浓度 ;
TaqDN A 聚合酶使用量的梯度分别为 0. 25、 0. 50、 0. 75、 1. 00 U; M g2+ 分别为 2. 25、 2. 5、 2. 75、 3. 0、
3. 25 mmo l· L- 1 ; dN T Ps分别为 60、 80、 100、 120μmol· L- 1;引物浓度设为 0. 5、 0. 6、 0. 7、 0. 8、 0. 9μmol· L- 1 ,
　 　 1～ 8条带是浓度分别为 5、 10、 20、 30、 40、 50、 60、
70 ng· μL- 1的模板 DNA的扩增结果。
No. 1～ 8 are th e p rod ucts amplied by 5, 10, 20, 30, 40,
50, 60, 70 ng· μL- 1of template DNA respect ively.
图 1　不同模板 DN A浓度对 ISSR扩增的影响
Fig. 1　 Ef fect of diff erent template DNA concentrations
on ISSR amplif ication
共 5个梯度。
ISSR-PCR扩增程序为: 94℃ , 3 min; 94℃ , 30 sec;
52℃ , 45 sec; 72℃ , 1 min, 40个循环 ; 72℃ , 10 min。退火
温度设为 50、 52、 53、 54、 56℃ ,共 5个梯度。于 1. 5%的琼
脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
2　结果与分析
2. 1　模板 DNA浓度对 ISSR反应的影响
模板 DNA的浓度是影响 ISSR-PCR扩增的一个重
要因素。 在每个 PCR反应体系中 , 5～ 500 ng范围的
DNA用量通常都能提供好的扩增结果 ,其中 10～ 100 ng
的 DNA用量可使扩增结果比较理想 [ 11]。不同模板浓度
对桉树 ISSR的影响结果如图 1所示。图 1表明 ,模板浓度
在 5～ 70 ng时均可以成功扩增 ,而以模板浓度为 40 ng
时的扩增最为稳定 ;当模板浓度低于 10 ng时 ,扩增产物
条带不清晰 ;当模板浓度在 40 ng以下时 ,一些较大的条
带不能很好地得以扩增 ,很多条带不能得到扩增。本研究
选择的最佳模板浓度为 40 ng。
14 经　　济　　林　　研　　究 第 27卷　
　　 1～ 4条带为大连 Ta KaRa公司生产的 TaqDN A聚合酶扩增的 ISSR产
物 ; 5～ 8条带为东盛生物公司生产的 TaqDN A酶扩增的 ISSR产物。
No. 1～ 4 ISSR result s using TaqDN A are th e p roducts b y TaKaRa
Company; No. 5～ 8 ISSR resul ts using TaqDN A are the p rod ucts by
Dongsheng Company.
图 2　不同公司生产的不同浓度的 TaqDN A聚合酶对
ISSR扩增的影响 (引物 826)
Fig. 2　 Effect of dif f erent TaqDNA polymerase concentrations
on ISSR amplif ication ( primer 826)
2. 2　 Taq酶的选择和用量对 ISS R反应的影
响
在 ISSR-PCR反应体系中 , Taq DN A聚
合酶的生产厂家和用量直接影响着扩增反应
的成功与否。试验采用大连 TaKaRa公司和东
盛生物公司生产的 Taq DN A聚合酶 (分别为
2. 5、 5 U· μL- 1 )进行 PCR扩增。从图中 2可
以见到 0. 25～ 1. 00 U都可以得到扩增谱带
(其中1～ 4条带为 TaKaRa公司酶 , 5～ 8条带
为东盛公司酶 )。当酶的用量为 0. 25 U时 ,扩
增条带较为清晰 ;当酶的用量在 0. 75 U时 ,条
带弥散严重。因此 , 0. 25 U和 0. 5 U为理想的
Taq酶用量 ,考虑到节省 ,本试验选用了
0. 25 U的 Taq酶量。 与大连 TaKaRa公司生
产的 Taq DN A聚合酶相比较 ,东盛生物公司
生产的 TaqDN A酶 ,在同等用量 (即 0. 25 U和
1. 00 U )时 ,其扩增产物条带相连 ,模糊难以辨认。因此 ,试验中全部选用了大连 TaKaRa公司生产的酶。
2. 3　 Mg2+ 和 dN TPs的浓度对 ISSR反应的影响
Mg
2+的浓度是 ISSR-PCR的一个主要变化因素。作为 Taq酶的辅助因子 , Mg2+ 浓度不仅影响着 Taq酶的
活性 ,还能与反应液中的 dN TPs、模板 DNA及引物相结合 ,从而影响引物与模板的结合效率、模板与 PCR产物
的解链温度和产物的特异性及引物二聚体的形成。 在其它反应条件一定的情况下 ,以不同浓度的 Mg2+进行
PCR扩增 ,当 Mg2+ 的浓度为 2. 25 mmol· L- 1时 ,能扩增出清晰条带 ;当 Mg2+ 的浓度为 2. 5mmo l· L- 1时 ,能扩
增出较多清晰可辨的条带 ;当Mg2+的浓度达到 2. 75 mmo l· L- 1后 ,条带出现弥散现象 ,特异性明显下降。因此 ,
我们认为 , 2. 5 mmo l· L- 1为最佳 Mg2+ 浓度。
dN TPs是 ISSR-PCR反应的原料 ,若其浓度过高则易产生错配 ,而浓度太低则产率不高。为了确定最适宜
的 dN TPs加入量 ,本试验对比设置了 60、 80、 100和 120μmo l· L- 1共 4个浓度梯度进行筛选。不同浓度的
dN TPs对桉树 ISSR扩增的影响结果如图 4所示。从图 4中可以看出 ,当 dN TPs的浓度为 80μmol· L- 1时 ,条
带多且清晰 ,所以最终确定 dN TPs的浓度为 80μmo l· L- 1。
　　 1～ 4条带是浓度分别为 2. 25、 2. 50、 2. 75、 3. 00、
3. 25 mmol· L- 1的 M g2+的扩增结果。
No. 1～ 4 are the p roducts amplied by 2. 25, 2. 50,
2. 75, 3. 00, 3. 25 mmol· L- 1 Mg2+ respectiv ely.
图 3　不同浓度的 Mg2+ 对 I SSR扩增的影响
Fig. 3　 Ef fect of diff erent Mg2+ concentrat ions
on ISSR amplif ication
　　 1～ 4条带是浓度分别为 60、 80、 100、 120μm ol· L- 1的
dN TPs的扩增结果。
NO. 1～ 4 are th e products amplied by 60, 80, 100,
120μmol· L- 1 dN TPs respectively.
图 4　不同浓度的 dNTPs对 ISSR扩增的影响
Fig. 4　 Ef fect of dif ferent dNTPs concentrations
on ISSR amplif ication
15第 1期 田　华等:细叶桉 ISSR-PCR体系的建立与优化
　　 1～ 5条带是浓度分别为 0. 5、 0. 6、 0. 7、 0. 8、 0. 9μmol· L- 1
的引物的扩增结果。
NO. 1～ 5 are the products ampli fied by 0. 5, 0. 6, 0. 7,
0. 8, 0. 9μm ol· L- 1 prim ers , respectiv ely.
图 5　不同引物浓度对 I SS R扩增的影响
Fig. 5　 Ef fect of diff erent primer concentrations
on ISSR amplif ication
2. 4　引物浓度对 ISSR反应的影响
引物浓度直接影响着 PCR扩增的结果: 引物浓度过
低则会出现目的条带少且不清晰 ,甚至出现不能扩增的
现象 ;引物浓度太高却又会出现非特异条带及拖带 [12 ]现
象。为了寻找合适的引物浓度 ,本试验设置了 0. 5、 0. 6、
0. 7、 0. 8、 0. 9μmol· L- 1共 5个引物浓度的梯度进行优
化 ,扩增结果见图 5。当引物浓度为 0. 5μmol· L- 1时 ,仅
产 生少 数条 带 ,扩 增 效率 较低 ; 当 引物 浓 度为
0. 8μmol· L- 1时 ,条带多但模糊。 因此 ,本实验确定的
引物浓度为 0. 6～ 0. 7μmol· L- 1。
2. 5　退火温度对 ISSR反应的影响
用于 ISSR-PCR标记的引物长度一般为 15～ 21 bp,
且 GC含量各不相同 ,因此各个引物的 Tm值均有所不
同。所以 ,参照引物的 Tm值来选择合适的引物退火温度
是非常必要的。根据上述 5个因子对 ISSR影响的试验结
果 ,确定了 PCR反应中各成分的基本含量 ,为了确定反
应的退火温度 ,本试验设置了 50、 52、 53、 54、 56℃共 5个
退火温度进行对比扩增。一般而言 ,退火温度偏低 , 背景
模糊 ,弱带较多 ;而退火温度偏高 ,则片段少 ,而且不利于
长片段的扩增 [13, 14 ]。 试验中 ,当 52℃时 ,目的条带较清
晰 ,无非特异扩增带。 因此 ,确定 ISSR-PCR的反应退火
温度为 52℃ ,当然 ,在筛选引物时 ,可根据某些引物的不
同特点再作适当的调整。
2. 6　 ISSR最佳反应体系与反应程序的确立
根据以上分析结果 ,获得的优化了的细叶桉 ISSR-PCR的反应体系为: 2μl的 10× buf fer,镁离子浓度为
2. 5μmol· L- 1 , Taq酶为 0. 5 U, ISSR引物浓度为 0. 6μmol· L- 1 ,模板浓度为 40 ng· μL- 1 , dN TP浓度为
80μmo l· L- 1 ;加双蒸水至总体积为 20μL。循环条件为:预变性 94℃ , 3 min;变性 94℃ , 45 s;退火温度为 52℃ ,
1 min;延伸 72℃ , 2 min; 40个循环 ;延伸 72℃ , 6 min。
图 6　引物 UBC 827在 6个细叶桉种源中的 ISSR图谱
Fig. 6　 Electrophoresis diagram of ISSR analysis on six
Eucalyptus teretticornis by primer UBC 827
2. 7　 ISSR扩增产物的多态性
利用试验建立的优化体系和反应条件对细叶桉 6个
种源进行 ISSR扩增 ,从 100个引物中筛选出 10个条带清
晰、分辨率高、特异性好的引物 ,其扩增片段大小为
240～ 3000 bp,多态性平均为 86. 1% 。这表明 ISSR标记
具有高水平的遗传多态性 ,可适用于细叶桉种质鉴定或
遗传分析。引物 UBC 827在 6个细叶桉种源中的 ISSR图
谱如图 6所示。
3　结论与讨论
应用相同引物对细叶桉不同种源进行 ISS R-PCR扩
增分析 ,结果表明其谱带基本一致 ,可见 ISSR分析结果
稳定。试验结果表明 ,影响 ISSR-PCR反应的主要因子是反应体系中的 Mg2+浓度、 dN T Ps浓度、 Taq酶、引物浓
度和模板浓度。
试验结果还表明 ,细叶桉 ISSR-PCR反应最优化的条件如下:①反应体系为 2μL的 10× buf fer ,镁离子的浓
度为2. 5 mmo l· L- 1 , Taq酶为 0. 5 U, ISSR引物浓度为 0. 6μmol· L- 1 ,模板浓度为 40 ng· μL- 1 , dN TP浓度为
80μmo l· L- 1 ,加双蒸水至总体积为 20μL; (下转至第 79页 )
16 经　　济　　林　　研　　究 第 27卷　
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[本文编校:闻　丽 ]
(上接第 16页 )
②反应程序为预变性 94℃ , 3min;变性为 94℃ , 45 s;退火温度为 52℃ , 1 min;延伸 72℃ , 2 min; 40个循环 ;延伸
72℃ , 6min。结合分析结果 ,此试验结果还可应用于其它主要桉树品种的 ISSR-PCR分析 [15, 16 ] ,对以后桉树种质
资源分类、遗传图谱构建和基因定位的分析与研究奠定了技术基础。
试验结果表明 ,在 100个引物中筛选出 10个引物 ,在桉树个体间都表现出明显的多态性 ,这说明 ISSR标记
适用于桉树的群体遗传分析。应用该优化的反应体系 ,对桉树不同种源的育种群体遗传结构变化的相关研究正
在进行。
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[本文编校:伍敏涛 ]
79第 1期 杨晓玲等 :层积和激素处理对山楂种子生理生化的影响