全 文 ：反相高效液相色谱法同时测定柿叶中齐墩果酸和熊果酸
邹盛勤 1 , 孙　伟2
(1.江西省天然药物活性成分研究重点实验室 , 宜春学院生物工程研究所 , 宜春 336000;
2.宜春职业技术学院 , 宜春 336000)
摘　要:建立反相高效液相色谱法同时测定柿(Diospyros kaki Linn.f.)叶中齐墩
果酸和熊果酸的含量 。采用Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm , 5 μm);流动
相:V(甲醇)∶V(0.2%磷酸水溶液)=87∶13;流速:0.8 mL min;检测波长:210
nm;柱温:30 ℃。齐墩果酸进样量在 0.0848 ～ 1.696μg 范围内线性关系良好 ,
r=0.9996 , 平均加样回收率为 101.3%;熊果酸进样量在 0.1408 ～ 2.816 μg 范
围内线性关系良好 , r=0.9995 , 平均加样回收率为 99.0%。3批样品测定结果
表明 , 本法可作为柿叶中齐墩果酸和熊果酸含量测定的方法 。
关键词:反相高效液相色谱;柿叶;齐墩果酸;熊果酸;光电二极管阵列检测
器;含量测定
中图分类号:O657.7　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-0720(2009)04-018-04
　　柿叶为柿科植物柿(Diospyros kaki Linn.f.)的
新鲜或干燥叶 , 其性味苦 、酸 、涩 、凉 , 具有清肺
止咳 、凉血止血 、活血化瘀 、降血压之功效[ 1] 。国
内外研究表明 , 以柿叶为原料制取的柿叶制剂 、
柿叶茶 、柿叶提取物具有清热解毒 、清血利尿 、抑
菌 、止血 、降血脂 、降低胆固醇 、抑制肿瘤生长等
多方面的生理功能[ 2, 3] 。柿叶化学成分较复杂 , 主
要含有黄酮类 、三萜类 、酚类等化合物[ 4 , 5] , 其中
三萜类成分齐墩果酸和熊果酸为同分异构体 , 极
性相似。柿叶中齐墩果酸的测定方法报道较多 ,
主要有高效液相色谱法和薄层扫描法[ 6 , 7] , 而熊果
酸仅见薄层扫描法[ 8] , 采用高效液相色谱法同时
测定柿叶中齐墩果酸和熊果酸含量的方法未见报
道。本文建立了柿叶中 2 种五环三萜酸的反相高
效液相色谱分离及定量测定方法 , 并对 3批柿叶
进行了测定。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
Waters 515高效液相色谱仪;2996光电二极管
阵列检测器(PAD);7725i 手动进样器;柱温箱;
Empower中文色谱工作站;SK-2510HP 超声清洗器
(上海汉克科学仪器公司);Sartorius CP225D 型电
子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司);
ROMB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂)。
柿叶于 2007年 7月采自江西宜春 , 经宜春学
院李开泉教授鉴定为柿科植物柿 Diospyros kaki
Linn.f.的新鲜叶;齐墩果酸和熊果酸对照品 , 购
自中国药品生物制品检定所(批号:110709-
200304 , 110742-200314 , 供含量测定用);甲醇(色
谱纯 , 上海陆忠试剂厂);水为高纯水;其余试剂
均为分析纯。
1.2　标准液的制备
准确称取齐墩果酸对照品 2.12 mg 和熊果酸
对照品 3.52mg , 置25 mL容量瓶中 , 加甲醇溶解 ,
并稀释至刻度 , 备用。
1.3　样品溶液的制备
柿叶样品干燥后粉碎 。精密称取约 1 g , 置于
具塞三角烧瓶中 , 加入 90%乙醇 30 mL , 超声提取
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第 28卷第 4 期
2009年 4 月 　　　　　　　　　　　　 分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory　　　　　　　　　　　　Vol.28.No.42009-4
收稿日期:2008-03-04;修订日期:2008-06-10
基金项目:国家“ 863”计划(2002AA2Z3217)项目资助
作者简介:邹盛勤(1970-), 男 , 副教授;E-mail:zsqycxy@163.com
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2009.0097
45 min , 过滤 , 滤渣用乙醇洗涤 2次 , 合并滤液至
50 mL容量瓶中 , 乙醇定容至刻度。滤液用微孔滤
膜(0.45μm)过滤 , 取续滤液作为样品溶液 , 备用 。
1.4　色谱条件及系统适用性试验
色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm ,
5 μm), 带预柱;2996光电二极管阵列检测器;流
动相:V(甲醇)∶V(0.2%磷酸水溶液)=87∶13 , 等
度洗脱;流速:0.8 mL min;检测波长:210 nm;柱
温30 ℃。依上述色谱条件 , 分别精密吸取齐墩果
酸和熊果酸对照品混合溶液和样品溶液各 10 μL
进样。在对照品溶液和样品溶液色谱图相应位置
上 , 有相同的保留时间(见图 1)。对照品混合溶液
色谱图中齐墩果酸和熊果酸色谱峰分离度为
1.96 , 对称因子均为 1.03 , 理论板数分别为 12587
和13362。
图 1　对照品(a)和柿叶供试品(b)的HPLC 色谱图
Fig.1　HPLC chromatograms of the standard and the sample
1-齐墩果酸;2-熊果酸
2　结果与讨论
2.1　样品超声提取次数的确定
在样品预处理时 , 保持其他提取条件不变 ,
考察了提取次数对柿叶样品溶液中齐墩果酸和熊
果酸提取率的影响 。经测定比较 , 第 2次提取液中
齐墩果酸的峰面积为第 1次提取液的 3.46%, 熊
果酸的峰面积为第 1次提取液的 3.11%, 可认为
提取 1次后 , 柿叶中的齐墩果酸和熊果酸已基本
提取完全 。
2.2　检测波长的选择
采用 PAD检测器在 190 ～ 600 nm 波长范围内
扫描 , 对照品和样品中齐墩果酸 、熊果酸在流动
相中的最大吸收波长均为 202.2 nm , 且紫外吸收
光谱一致(图2)。但由于流动相在低波长处有较强
的末端吸收 , 为减少干扰 , 提高信噪比 , 提取不同
波长的色谱进行比较 , 选择 210 nm 为检测波长 ,
其信噪比高 , 可在消除背景干扰时保证基线平稳
和检测的灵敏度。
图 2　对照品(a)和柿叶样品溶液(b)中齐墩果酸 、 熊果酸
的紫外光谱图
Fig.2 　UV spectra of oleanolic acid and ursolic acid in the
standard and the sample
2.3　色谱峰纯度的考察
峰纯度分析是将积分峰上每个数据点的光谱
与峰顶点光谱进行对照 , 分析色谱峰所有点的个
别光谱图之间的差异 , 计算出所有的光谱对照角 ,
求其加权平均值(纯度角);同时 , 选定一段基线
计算纯度噪音角与溶剂角之和(阈值)。进行峰纯
度分析时 , 纯度角和阈值角是平均所有测量到的
角度并加权吸收强度的结果 , 由 Empower 软件自
动计算 , 并绘制纯度曲线和自动阈值曲线 , 纯度
曲线表示整个色谱峰的每个数据点的光谱图与峰
顶点光谱图的差异 。当纯度角小于阈值时 , 在测
量的噪音内光谱是均匀的 , 为纯组分;当纯度角
大于阈值时 , 表示有共流出物存在。峰纯度分析
条件:检测波长 190 ～ 600 nm , 最小分辨率1.2 nm ,
峰宽 30 s , 基线噪音阈值 50μV·s , 噪音间隔起止
时间 0.25 ～ 0.75 min 。结果表明 , 色谱图中齐墩果
酸和熊果酸峰的纯度角均小于阈值 , 纯度线位于
自动阈值线下方(图3), 表明齐墩果酸和熊果酸色
谱峰均为单一组分吸收峰 , 无其它组分的干扰 。
2.4　线性关系考察
分别准确吸取齐墩果酸和熊果酸对照品混合
溶液(质量浓度分别为 0.0848 、 0.1408 g L)1 、 5 、
10 、15 、20 μL , 注入液相色谱仪 , 测定齐墩果酸和
熊果酸峰面积 。以对照品进样量(μg)为横坐标 , 色
谱峰峰面积(μV·s)为纵坐标绘制标准曲线 , 进行
一元线性拟合 , 得回归方程为:
齐墩果酸:Y =1.31×106ρ+1.78×103 , r =
0.9996;熊果酸:Y =1.42×106ρ+1.12×103 , r=
0.9995
表明当齐墩果酸和熊果酸分别在 0.0848 ～
1.696μg 、 0.1408 ～ 2.816 μg 之间时 , 进样量与峰
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面积线性关系良好 。检出限按噪声的 3倍(3σ)计
算 , 齐墩果酸的检出限为 0.42μg mL , 熊果酸的检
出限为 0.39 μg mL。
图 3　对照品中齐墩果酸(a)和熊果酸(b)峰纯度分析图(210 nm)
Fig.3　Peak purity analysis of oleanolic acid and ursolic acid in the standard
2.5　精密度试验
准确吸取齐墩果酸和熊果酸的对照品混合溶
液10 μL进样分析 , 重复5次 , 测得齐墩果酸峰面
积相对标准偏差(RSD)为 0.53%(n =5), 熊果酸
峰面积的 RSD为 0.76%。
2.6　重现性试验
准确称取同一批柿叶样品 5份 , 按“样品溶液
的制备”项下方法制备样品溶液 , 准确吸取 10 μL
进样分析 , 进行含量测定。计算齐墩果酸平均含
量的 RSD为 1.3%(n =5), 熊果酸平均含量的
RSD为 1.1%(n=5)。
2.7　加标回收率试验
准确称取齐墩果酸和熊果酸对照品 4.06 mg
和 16.02 mg , 分别置于 10mL 容量瓶中 , 加90%乙
醇溶解 , 并稀释至刻度 , 摇匀 , 备用。
准确准确称取已知齐墩果酸和熊果酸含量的
柿叶样品 6 份(齐墩果酸和熊果酸含量分别为
0.0766%和 0.345%), 每份约 0.5 g , 分别加入上
述对照品溶液(齐墩果酸和熊果酸对照品溶液浓度
分别为 0.406 、1.602 g L)1 mL , 按“样品溶液的制
备”项下方法制备加样样品溶液 , 分别准确吸取 10
μL , 注入液相色谱仪 , 测定各色谱峰峰面积 , 外标
法计算计算齐墩果酸和熊果酸的含量和回收率 。
结果见表 1。
表 1　齐墩果酸和熊果酸的回收率实验
Tab.1　Recoveries of oleanolic acid and ursolic acid
组分 样品称样量 mg 样品中含量 mg 对照品加入量 mg 测得总量 mg 回收率 % 平均回收率 % RSD %
齐墩果酸
502.54
502.32
499.68
501.30
501.04
498.20
0.3849
0.3847
0.3828
0.3840
0.3838
0.3816
0.406
0.406
0.406
0.406
0.406
0.406
0.7992
0.7903
0.8010
0.8011
0.7935
0.7855
102.04
99.90
103.00
102.73
100.91
99.48
101.34 1.3
熊果酸
502.54
502.32
499.68
501.30
501.04
498.20
1.7334
1.7330
1.7239
1.7295
1.7286
1.7188
1.602
1.602
1.602
1.602
1.602
1.602
3.3068
3.3112
3.3330
3.3128
3.3019
3.3312
98.21
98.51
100.44
97.73
98.21
100.65
98.96 1.1
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2.8　样品分析
准确吸取样品溶液 10 μL 注入高效液相色谱
仪 , 测定齐墩果酸和熊果酸峰面积 , 平行 3次 , 按
外标法计算柿叶样品中齐墩果酸和熊果酸的含量 ,
结果见表 2。
表 2　柿叶中齐墩果酸和熊果酸含量测定结果(n=3)
Tab.2　Contents of chlorogenic oleanolic acid and ursolic ac-
id in persimmon leaves
样品编号 齐墩果酸 RSD % 熊果酸 RSD %
1 0.173 1.2 0.588 1.6
2 0.0766 1.7 0.345 0.9
3 0.0497 1.5 0.242 1.1
2.9　讨论
(1)光电二极管阵列检测器可以采集时间-波
长-响应值三维数据 , 在设定波长区域内的各波长
下进行立体数据采集 , 既可以察看各波长下的色
谱图又可以察看各时间下的光谱图 , 在比对保留
时间的基础之上 , 加以光谱确认 , 因而可以克服
仅以保留时间一项指标定性的缺点 , 增强了定性
的确定性。二极管阵列检测器与 Empower色谱工
作站系统适应性软件联用 , 可分析组分色谱峰的
峰纯度 , 进一步增强了色谱方法的定性能力。实
验表明 , 对照品和 3批柿叶样品中齐墩果酸和熊
果酸色谱峰在色谱柱中的保留时间和紫外吸收光
谱一致 , 且为单一组分吸收峰。
(2)HPLC配合光电二极管阵列检测器 , 在优
化的色谱条件下 , 可直接对柿叶中的齐墩果酸和
熊果酸进行定性鉴别和定量分析 。在本文建立的
色谱条件下 , 柿叶样品中齐墩果酸 、熊果酸与其
他成分分离良好 , 方法简便快速 , 结果准确可靠 ,
可准确测定柿叶中齐墩果酸和熊果酸的含量。
参考文献
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[ 8] 　甑汉深 , 辛　宁 , 陈　勇等.中药材 , 2001 , 24(3):
182
Simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in persimmon leaves by RP-HPLC
ZOU Sheng-qin＊1 and SUN Wei2(1.Key Laboratory of Jiangxi Province for Research on Active Ingredients in Natural
Medicines , Bioengineering Research Institute of Yichun University , Yichun 336000;2.Yichun Vocational Technical
College , Yichun 336000), Fenxi Shiyanshi , 2009 , 28(4):18 ～ 21
Abstract:A RP-HPLC method for simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in persimmon leaves
was established.Kromasil C18 column (4.6 mm ×250 mm , 5 μm)was used as the chromatographic column , and
methanol-0.2% aqueous solution of phosphoric acid(87∶13)was used as the mobile phase running with a flow rate of
0.8 mL min.The detection wavelength was 210 nm and the temperature of the column was 30 ℃.The linear rangers
for oleanolic acid and ursolic acid were 0.0848 ～ 1.696μg (r=0.9996)and 0.1408 ～ 2.816μg (r=0.9995), re-
spectively .The average recoveries of the procedure were 101.3% for oleanolic acid and 99.0%for ursolic acid.The
determination results of the three batches of samples show that the method is easy and accurate , and it can be used for
the determination of oleanolic acid and ursolic acid in persimmon leaves.
Keywords:RP-HPLC;Persimmon leaves;Oleanolic acid;Ursolic acid;Photodiode array detector;Quantitative de-
termination
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