全 文 ：·方药研究·
佛手及其近源种香橼 rDNA ITS-RFLP 初步分析
高晓霞1 ,陈晓颖1 ,罗源生2 ,温占峰3
(1.广东药学院 药物分析教研室 ,广东 广州 510006;2.广东广弘药材有限公司 ,广东 广州 510893;
3.广东药学院 2001级本科生 ,广东 广州 510006)
　　摘　要:目的:建立快速的以 rDNA ITS序列作为分子标记对佛手及其近缘种香橼的基源植物进行分
子鉴定的技术 。方法:利用真核生物通用引物扩增 rDNA ITS序列并利用限制性内切酶对扩增产物进行限
制性片段长度多态性(RFLP)分析 。结果:ITS-RFLP 酶切图谱显示可以对佛手和香橼基源植物进行分子鉴
定 。结论:利用 ITS-RFLP方法可很好地快速区分佛手与香橼 。
　　关键词:佛手;香橼;rDNAITS序列;PCR-RFLP
　　中图分类号:R284.1　　　文献标识码:B　　　文章编号:1007-4813(2006)04-0077-02
作者简介:高晓霞(1972～ 　),女 ,医学博士 ,讲师。研究方向:中药制剂分析 、中药材指纹图谱研究。
　　佛手(Bergamot), 又称佛手柑 、异名佛手香橼 、五指柑 , 为
芸香科柑橘属植物佛手 Citrus medica L.var.sarcodactylis(Noot.)
Swingle的成熟果实[1] 。香橼为同属植物枸橼(C.medica L.)或
香圆(C.wilsonii Tanaka)的干燥成熟果实[ 2] 。佛手和香橼均为
我国传统中药 , 在临床运用上 , 佛手与香橼两者功用相近 , 均
可理气化痰 ,但前者治呕的作用大于后者 , 而后者化痰的作用
大于前者[ 3] 。佛手作为枸橼的一个变种 , 在外观 、性状方面虽
与枸橼有较大的区别 ,但二者多以饮片形式出现 , 有时只是部
分掺杂 ,较难鉴定真伪。
随着分子生物学技术的发展和应用 , DNA分子标记技术
被广泛应用于植物进化与亲缘关系 、植物分类 、中药材鉴定和
品质评价等研究工作中[ 4] 。本文在佛手和香橼 rDNA 内转录
间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列测定和限制性酶切
位点分析的基础上 ,对其 rDNA ITS 区 PCR 扩增产物进行限制
性片段长度多态性(rDNA ITS-RFLP)分析。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂　佛手和香橼新鲜植物材料由广东省中药
研究所华南中药种质资源库于 2005 年 4月 28 日提供。
ExTag DNA聚合酶(TaKaRa), 琼脂糖(Promega),限制性内
切酶AluI、MspI(TaKaRa)。 PE-480 PCR扩增仪(PE),台式高速
离心机(Sigma), 恒压恒流电泳仪(Life Technologies),凝胶成像
仪(Kodak EDAS120)。
1.2　总 DNA 的提取与PCR扩增 、序列测定　新鲜植物叶片各
0.1g ,采用改良的 CTAB 法提取总 DNA[ 5] 。
被子植物 rDNA ITS 区通用扩增引物 18Sp48 和 26Se37 由
上海生工生物工程有限公司合成。正向引物 18Sp48:5-AGA
AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG-3;逆向引物 26Se37:5-
TTC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3。 PCR 反应在 20 μL 体系中
含 10×Buffer 2μL, 10 mmol L dNTP 0.5μL , 25 mmol L Mg2+ 2.4
μL , 10(mol L正向和逆向引物各 1μL , DMSO 1μL, ExTaq(5 U
μL)0.1 μL , DNA 模板(适宜浓度)2 μL, 灭菌三蒸水(3dH2O)10
μL。PCR 扩增条件为 94℃变性 4min , 94℃ 1min , 50℃ 2min ,
72℃2min , 循环30 次;72℃延伸10min ,以 3dH2O 代替模板DNA
作空白对照。扩增产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
PCR产物经 QIAquick PCR纯化试剂盒纯化后 , 由英骏广
州测序实验室(英骏生物技术有限公司)测序。获得的序列已
上传至 EMBL(http:∥www.ebi.ac.uk embl Submission webin.h-
tml),序列号为 AM260543 和 AM260544。
1.3　rDNA ITS-RFLP 分析　Webcutter 2.0 程序(http:∥rna.-
lundberg.gu.se cutter2 )被用于佛手和香橼的 rDNA ITS 序列的
限制性内切酶酶切图谱分析 , 根据酶切图谱的差异选择合适
的限制性内切酶。本研究中所用的限制性内切酶为 AluI 和
MspI。 10μl反应体系 , 含 10×Buffer 1μl , 限制性内切酶 0.5μl ,
PCR纯化产物 5μl , BSA 1μl(如限制性内切酶 buffer 需要加 BSA
时), 3dH2O补足至 10μl , 37℃恒温水浴 3 ～ 6h。取 5 ～ 8μl用
2%琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果 , 人工比较分析 RFLP 带型
图谱。
2　结果
应用真核生物 rDNA ITS 区通用引物扩增佛手和香橼 rD-
NA ITS 序列 , 目的片段包括 ITS1 , 5.8S 和 ITS2 全长序列以及
18S , 26S 部分序列 , 长度为 676-695 bp。其中 5.8S 全长为 165
bp , 编码区序列相对保守 ,与香橼比较佛手有 1 个碱基的缺失
和3 个碱基的变异。两者 ITS1 的长度分别为227 bp 和257 bp ,
碱基差异百分率为 8.1%;ITS2 的长度分别为250 bp 和253 bp ,
碱基差异百分率为 1.2%。
Webcutter 2.0 程序对佛手和香橼的 rDNA ITS 序列的限制
性内切酶酶切图谱进行比较分析。结果表明 , 大部分的限制
性酶切图谱相同 , 但是有些具有 4 bp 识别位点的内切酶酶切
图谱是有差异的。 本研究中用 AluI 和 MspI 进行佛手和香橼
rDNA ITS-RFLP初步分析 , AluI 的识别位点为 ag ct ,MspI 的识
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第22卷第4期
2006 年 12月
长 春 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Changchun University of Traditional Chinese Medicine
Vo1.22
4 , 2006
DOI :10.13463/j.cnki.cczyy.2006.04.069
别位点为 c cgg。
3　讨论
虽然通过 PCR产物直接测序法的中药材鉴定具有科学性
和可靠性 , 但仍存在成本高 、鉴别程序复杂和耗时长等缺点。
本文研究了利用 ITS-RFLP 技术来鉴别佛手及其近源种香橼 ,
结合PCR和 RFLP 的优点 ,简化操作步骤 , 降低了成本 ,同时又
弥补了序列测定的不足。在方法建立过程中对同一份新鲜样
品 ,进行多次基因组总 DNA提取 , 不同模板浓度的 PCR扩增 ,
纯化的扩增产物经限制性内切酶切分析 , 其结果表明酶切图
谱稳定。此方法对外形上较易混淆种类的鉴定具有快速 , 重
现性好 ,且价廉省时等优点。
另外中药材采收过程中多经日晒烘干等加工 、储存等因
素 ,其中的 DNA 都会或多或少的降解 , 较难获得 PCR 产物。
张婷等[ 6]在药用植物石斛的 PCR-RFLP 鉴别研究中指出该方
法局限于新鲜或者半干燥石斛样品的鉴定 , 而干燥时间较长
或者商品石斛进行 PCR扩增时得到比植物 ITS 片断小的真菌
片断 ,给利用 RFLP 技术进行商品石斛的分子鉴定带来较大的
困难。本文将利用已建立的 ITS-RFLP技术对商品佛手和香橼
作进一步的鉴定研究。
参考文献:
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进展[ J].中草药 , 2000 , 31(8):561.
[ 5] 严寒静 ,高晓霞 ,陈晓颖.陈皮总 DNA 提取方法的研究[ J]
.广东药学院学报 , 2004 , 20(6):592～ 593.
[ 6] 张　婷 ,徐珞珊 , 王峥涛 , 等.药用植物束花石斛 、流苏石
斛及其形态相似种的 PCR-RFLP 鉴别研究[ J] .药学学报 ,
2005 , 40(8):728～ 733.
(收稿:2006-06-26;修回:2006-09-26)
小便不禁之虚证治验举隅
王晓立
(辉南县中医院 ,吉林 辉南 135100)
　　关键词:小便不禁 中医药疗法;健脾;补肺;补肾
(中医);医案
　　中图分类号:R726.9　　　文献标识码:B　
　　文章编号:1007-4813(2006)04-0078-01
1　病案举例
例1　万某 ,女 , 51 岁 ,农民。2006 年 7月 1日初诊。患者
近2 年来 , 经常性不能控制排尿 , 而尿液自行排出 , 尤其在白
天出现这种情况为多 , 自觉羞涩难当。每当劳累 、快步快行 、
大笑时出现小便不禁。 兼见:乏力 、心烦 、厌食 , 睡眠如常 , 舌
淡红 ,脉虚软无力。查体:营养一般 ,面色淡黄 ,双侧肾区叩击
痛 ,全腹软无压痛 , 未触及肿块。彩超:左肾 9.9cm×5.5cm×
4.8cm ,右肾 10cm×5.6cm×5.1cm , 双肾形态未见异常 , 肾包膜
完整 ,肾皮髓质分界清晰 , 肾下报实质厚度1.5cm ,实质与肾窦
未见异常 , 肾盂肾盏未见扩张 , 膀胱内壁光滑。 CDFI:血流信
号未见异常。诊为:小便不禁 , 证属肺脾肾气虚。 治宜:益肺
健脾 、温肾固脬。处方:黄芪50g ,白术 25g , 陈皮15g ,升麻 10g ,
柴胡10g ,炙甘草 5g , 当归 10g , 益智仁 15g , 肉桂 10g , 菟丝子
15g ,补骨脂 15g ,白芍 20g , 枸杞子15g ,山茱肉 20g , 覆盆子 20g ,
桑螵蛸20g ,熟地 20g ,党参30g , 牡蛎30g ,五味子 15g。水煎服 ,
3 剂 ,每日 1 剂。7 月 4 日复诊 , 自诉药后 , 小便失禁减轻 , 尿
自遗明显好转 ,效不更方 ,守原方再服 6 剂 , 7 月 10 日来院告
知病已愈。
例2　闫某 ,男 , 78岁 , 退休干部。2005年 8 月31 日初诊。
患者 3 个月前感冒自愈后 , 继则出现小便不禁 , 尿自遗 , 兼见
气短 、乏力 、心烦 、小腹时有坠胀 ,每当咳嗽或劳累时即出现尿
自遗 , 舌淡 、苔薄白 、脉虚缓无力。查体:精神尚可 , 面色萎黄 ,
体瘦 , 腹软 ,全腹无痛 , 双侧肾区无叩击痛 , 双肾及膀胱彩超:
正常。诊断:小便失禁 ,证属肺脾肾气虚 , 治以补益脾肺 , 温肾
固脬。处方:黄芪 50g , 白术 25g , 陈皮 15g , 升麻 10g , 柴胡 10g ,
炙甘草 5g ,当归 10g , 益智仁 15g , 肉桂 10g , 菟丝子 20g , 补骨脂
15g , 白芍 20g , 枸杞子 15g ,山萸肉 20g , 覆盆子 20g , 桑螵蛸20g ,
熟地 20g ,党参 30g , 牡蛎 30g ,五味子 15g 。水煎服 , 3剂 , 每日 1
剂。 9 月3 日复诊:服药后气短 、乏力 、心烦 、小腹坠胀感诸症
好转 , 小腹已无畏凉之感 , 尿自遗明显好转 , 3d 中仅出现 1 次
尿自遗 , 嘱效不更方 ,继进原方 6剂 , 9 月 1日来院告知已愈。
2　讨论
小便不禁属中医肾系病症之常见病。以上所举临床病
案 , 均为小便不禁之虚症。《类证治裁·闭症遗溺》说:“夫膀胱
仅主藏溺 , 主出溺者 , 三焦气化耳” 。 肺主气 ,通调水道 , 下输
膀胱 , 肺虚治节失司 ,膀胱失约 , 可致小便不禁。脾主运化 , 转
输水液 , 脾气虚 , 水液无制可使尿自遗 , 小便不禁。肾主水。
其气下通于阴 , 下元虚寒 ,水液失于温化 ,可致小便不禁。《金
匮翼·小便不禁》说:“脾肺气虚不能约束水道 , 而病为不禁者。
《金匮》所谓上虚不能制下者也。 足厥阴肝经及肾脉循阴器 ,
系廷口(尿道口)若督脉虚衰 , 肝气失调 , 也可致小便不禁。故
小便不禁与肺 、脾 、肾三脏功能正常及肝气畅达关系密切。劳
伤忧思过度 , 损伤脾肺 ,年老体弱 ,脏器虚损 , 不能约束水液故
小便不禁 , 进一步发展可致下元虚冷 , 肾虚膀胱失约加重小便
不禁。而如咳嗽 、大笑 、劳累等均耗伤元气 ,加重肺脾气虚 , 而
致气无约束之力造成小便不禁。而患此病患者又多心情抑
郁 , 羞涩难以启齿 ,而致肝气失调加重小便不禁。当以益气健
脾 、温肾固脬 、佐以调肝疏肝之法 ,常收满意疗效。
(收稿:2006-08-20;修回:2006-11-01)
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第22卷第4期
2006 年 12月
长 春 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Changchun University of Traditional Chinese Medicine
Vo1.22
4 , 2006