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响应面法优化超声辅助提取金银木果实色素工艺



全 文 :48 2013, Vol.34, No.22 食品科学 ※工艺技术
响应面法优化超声辅助提取金银木果实色素工艺
王立志,唐克华*
(吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室,湖南 张家界 427000)
摘 要:对金银木破碎果实首先用溶剂恒温浸提,然后进行超声萃取处理以提取色素。采用响应面优化金银木果实
色素超声辅助提取工艺的料液比、超声时间和超声功率。结果表明:料液比、超声时间和超声功率对金银木果实色
素超声辅助提取均有显著影响;最优工艺条件为料液比1:15(g/mL)、超声时间30min和超声功率500W;在最优工艺
条件下超声提取的金银木果实色素样液稀释10倍后,在450nm波长处的吸光度理论预测值为0.836,而实际实验的吸
光度为0.827,二者数值仅相差1.08%。因此,运用响应面法优化的超声辅助提取工艺条件可行。
关键词:金银木;色素;超声提取;响应面法
Optimizing Ultrasonic-Assisted Extraction of Pigment from Lonicera maackii Fruit by
Response Surface Methodology
WANG Li-zhi,TANG Ke-hua*
(Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China)
Abstract:Following a period of spontaneous solvent extraction at a constant temperature, ultrasonication was applied to
enhance pigment extraction from crushed Lonicera maackii fruit. Three extraction parameters including material/solvent ra-
tio, ultrasonication time and power were optimized by using response surface methodology. All the operating parameters had
a signifi cant effect on extraction effi ciency and the optimal extraction conditions were determined as 1:15 (g/mL), 30 min
and 500 W for material/solvent ratio, ultrasonication time and power, respectively. The predicted absorbance at 450 nm of
the pigment extracted under the optimized conditions after 10-fold dilution was 0.836, showing a relative error of only 1.08%
in comparison to the experimental absorbance of 0.827. Thus the optimized process established using response surface meth-
odology is feasible for pigment extraction from Lonicera maackii fruit.
Key words:Lonicera maackii;pigment;ultrasonic wave extraction;response surface methodology
中图分类号:TS202.3 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2013)22-0048-06
doi:10.7506/spkx1002-6630-201322010
收稿日期:2013-04-16
基金项目:湖南省高校科技创新团队支持计划项目(湘教通(2010)212号);湖南省研究生科技创新基地项目(201203A)
作者简介:王立志(1985—),男,硕士研究生,研究方向为天然产物化学。E-mail:hncuwz@yeah.net
*通信作者:唐克华(1965—),男,教授,硕士,研究方向为植物化学与林产资源产业化开发。E-mail:tkhthllh@126.com
金银木即金银忍冬(Lonicera macckii (Rupr.)Max-
im.),属忍冬科忍冬属,又名鸡骨头树、王八骨头等。金
银木为落叶灌木,常生于山地林中或林缘,分布广泛且
蕴藏量较大,我国东北、华北、西北地区为其主要分布
地,在湘西地区的桑植、永顺、凤凰等县有一定的资源
贮量[1]。金银木茎皮可制人造棉,其叶浸汁可杀棉花蚜
虫,其花可作为金银花代用品并可供制茶,其果实可供
提取天然红色素,其种子油可供肥皂制造。金银木全株
均可入药[2],能祛风解毒、消肿止痛、增强免疫力,抑
菌、杀菌、截疟。金银木可作为庭院和城市绿化、观赏
的树种[3-4]。野生金银木果实的营养成分丰富[5],含有17
种氨基酸,而且天冬氨酸、VB2及Ca含量较高,总糖含
量达38%。金银木的花中绿原酸含量与金银花(Lonicera
japonica Thunb.)的接近,高于《中国药典》中对金银花
的绿原酸含量标准[6]。
国内开展金银木果实化学成分的研究较多。王英臣[7]
测得金银木果实多糖含量为0.303g/g,发现超临界CO2萃
取的金银木果实多糖具有明显清除羟自由基、超氧阴离
子自由基和DPPH自由基的作用。青梅等[8]运用超声提取
结合高效液相色谱法,测得金银木果实绿原酸的含量为
0.38%。陈月开等[9]测定了金银木不同器官的芦丁含量,
发现其鲜果中芦丁含量为2.774g/100g,芦丁含量最高的
器官是鲜叶(2.998g/100g)。姬晓灵等[10]鉴定了金银木果实
提取物中的32种挥发性化合物。王广树等[11]从金银木果
实中分离得到裂马钱素、裂环马钱素和裂环马钱素酸等6
个化合物,其中有4个是在该植物中首次发现;以动物模
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.22 49
型研究了果实中的马钱素类衍生物活性,发现环烯醚萜
总苷具有很好的保肝、降糖活性[12]。王玉莉等[13]分离并
鉴定了金银木果实中的17个非环烯醚萜苷类化合物。柴
多武[14]研究表明,金银木的乙酸乙酯、石油醚和水的粗
提物都对人肝癌细胞株和白血病细胞株的增殖具有抗性
活性。王翔等[15]研究表明,栽培金银木果实的类胡萝卜
素含量高于胡萝卜的或橘子的;其VC含量则与红辣椒的相
近,但高于番茄、白萝卜、柑橘中的含量;其粗脂肪含量较
高,远高于毛樱桃、野葡萄和野山楂果实的。胡春霞[16]、王
立志[17]等对金银木果实的色素进行了提取和理化特性研
究。科研实践表明,合理使用优化方法,可获得事半功
倍的生物过程优化效果。响应面法优化方法,可以在更
广的范围内考察过程工作中涉及的因素对响应值的影响
程度,从而获得最优因素组合,因此近年来不断在植物
提取等生物过程工作研究中得到运用[18]。为了科学开发
湘西地区的金银木资源,本实验室开展了金银木果实色
素超声辅助提取工艺的响应面法优化研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
金银木果实及植物样本采自张家界永定区崇山,分
布海拔为700~1000m,样本经天门山国家森林公园高级
林业工程师黄宏全鉴定、分类并确认。
盐酸、95%乙醇、无水乙醚、正丁醇、乙酸乙酯、
氢氧化钠、醋酸铅、锌粉、氯化亚铁均为国产分析纯;
实验所用水为蒸馏水。
1.2 仪器与设备
JY92-ⅡDN超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技
股份有限公司;UV757 CRT紫外-可见分光光度计 上
海精密科学仪器有限公司;R215旋转蒸发仪 瑞士
Büchi公司;HH数显电热恒温水浴锅 江苏金坛金城国
胜实验仪器厂;AL 204电子天平 梅特勒-托利多仪器
(上海)有限公司;HM-35V pH计 日本Toa公司;LD5-
2A型离心机 北京医用离心机厂;HY-6A双层调速多用
振荡器 江苏金坛顺华仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 色素萃取溶剂优选与色素吸收光谱测定
称取 5 . 0 g金银木干燥果实 8份,分置 8个 (编号
1~8)50mL三角瓶内,参照文献[14-15]的研究结论并结
合经验,按序号分别加入50mL的蒸馏水、10%乙醇、
30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇、石油醚、三氯甲烷、
乙酸乙酯,然后置摇床在室温环境中振荡萃取12h,过
滤,滤液供光谱扫描测定,同时观察每个三角瓶过滤后
的果皮颜色褪变状况,综合筛选出最适提取色素的溶剂
种类。
取5.0g金银木干燥果实样本,按料液比1:10(g/mL)加
入最适提取溶剂,分置于50、60、70℃水浴中萃取2h,
取滤液以3500r/min离心10min,离心得到的上清液以最适
溶剂定容到50mL,为备测样液。备测样液均以定容溶剂
稀释5倍,再进行380~630nm的光谱扫描,得到色素样
液的可见光区吸收光谱和吸光度。
1.3.2 色素超声辅助提取的工艺流程
金银木果实色素超声提取的工艺流程:金银木鲜
果→洗净→烘干→粉碎过筛或研磨破碎→恒温水浴浸
提→超声辅助提取→过滤→滤液离心→定容(样液)→吸
光度测定。
操作要点:金银木鲜果水洗灰尘,于50℃条件下烘
干。供称量的干燥果实样本,无论是先粉碎过孔径1mm
土壤筛,还是仅研磨破碎,均参照“四分法取样”原
则,即先将全部样本分成4等份,再从4等份中取出相等
质量样本混匀,然后从混匀样本中精确称量,以尽可能
地减少各实验组取样的误差。精确称取所需果实样本,
置编号三角烧瓶内,按设定的料液比准确量取最适溶剂
加入,以PP薄膜封紧瓶口并置60℃水浴中浸提2h,然后
取出并按设定的因素水平值进行超声辅助萃取。各实验
组三角瓶经提取处理后,其滤液在3500r/min离心10min,
得到上清液,全部实验组的离心上清液均以最适提取溶
剂定容到相等体积。每个实验组均按平行实验要求提取
制备色素样液,备测。
1.3.3 超声辅助提取色素的单因素试验
1.3.3.1 提取料液比
四分法取粉碎的金银木果实样本,准确称取5.0g
共15份,分置于15个250mL三角瓶内,按料液比1:5、
1:10、1:15、1:20、1:25(g/mL)加入最适溶剂开展平行提
取实验,每个平行组均置60℃水浴中浸提2h,然后取
滤液离心,上清液定容至100mL(若上清液的体积大于
100mL,则旋转蒸发仪减压浓缩至小于100mL体积,再
定容),备测。
1.3.3.2 超声功率与超声时间
取样方法同前,精确称取5.0g金银木干燥果实若干
份,每份样本均置于研钵。根据色素研究经验,取料液
比1:10(g/mL),准确量取最适溶剂并从中取少许倒入研
钵,加入石英砂研磨分开果皮与种子,达到要求后用剩
余溶剂分次将研磨样本洗入置于编号的三角烧瓶,将
瓶口以薄膜封闭并置60℃水浴中浸提2h,然后取出各烧
瓶,按照设定的超声提取时间或超声输出功率进行单因
素试验。
1.3.4 色素超声辅助提取的响应面法优化
运用Box-Behnken试验设计[19]对金银木果实色素超
声辅助提取进行响应面法优化研究。以各试验组金银木
果实色素提取液的吸光度为响应值(Y),对各提取工艺组
50 2013, Vol.34, No.22 食品科学 ※工艺技术
试验结果用Design Expert 7.0软件进行回归分析,建立模
型方程并分析各设定因素及其交互作用的显著性,获得
最佳提取工艺的因素水平组合,预测并以实验验证该组
合是否最优。按照Box-Behnken响应面试验设计原理,结
合前述的研究结果,运用Design Expert 7.0软件,将料液
比、超声功率、超声时间3个影响因素设计为三因素三水
平的响应面法试验(备测样液均以定容溶剂稀释10倍),响
应面法试验的因素与水平值见表1。
表 1 响应面法优化超声辅助提取试验的因素与水平值
Table 1 Coded levels for independent variables used in
response surface analysis
水平值 因素
X1料液比(g/mL) X2超声时间/min X3超声功率/W
-1 1:5 10 100
0 1:10 20 300
1 1:15 30 500
2 结果与分析
2.1 色素萃取溶剂优选与色素吸收光谱测定
表 2 不同种类溶剂对金银木果实色素的溶解性
Table 2 Solubility of pigment from Lonicera maackii fruit in
different solvents
溶剂种类
萃取效果
溶液颜色 果皮颜色 溶解性
蒸馏水 浅橙黄色 红色 部分溶解
乙醇
10% 浅橙黄色 红色 部分溶解
30% 浅橙黄色 红色 部分溶解
50% 橙黄色 红色 溶解
95% 橙色 浅红色,泛白 溶解
石油醚 鹅黄色 红色 少部分溶解
三氯甲烷 鹅黄色 红色 少部分溶解
乙酸乙酯 鹅黄色 红色 少部分溶解
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
380 405 430 455 480 505 530 555 580 605
⊶䭓/nm

ܝ

图 1 金银木果实色素样液的吸收光谱
Fig.1 Absorption spectrum of pigments extracted from
Lonicera maackii fruit
由表2可知,8种溶剂对金银木果实色素振荡萃取的
实验结果中,金银木果皮色素的大部分为体积分数95%
的乙醇所溶出,是色素提取最适溶剂。
金银木干果以体积分数95%乙醇研磨破碎,然后在
60℃水浴中萃取2h,其色素样液的380~630nm范围光
谱吸收图见图1。果实样本在50℃和70℃水浴中萃取2h
的色素样液的扫描图均与图1曲线相似,都显示450nm是
色素样液在可见光区的最大光吸收波长。精确称取若干
份金银木干果,分别在50、60、70℃条件下各萃取1、
2、3h。其中,3个温度条件下各萃取2h的精制果实色素
样液,经稀释5倍后在450nm波长处的吸光度分别是:
0.708、0.720和0.967。该结果说明以体积分数95%乙醇在
70℃恒温水浴2h的色素萃取率为最大。虽然以70℃条件
下的干果色素浸提效率最好,但考虑该温度值已接近乙
醇的沸点温度,色素浸提的最适溶剂是体积分数95%乙
醇,在接近该溶剂沸点下进行长时间浸提的挥发损耗较
大,故后续优化试验中浸提温度均采用60℃。
2.2 色素超声辅助提取的单因素试验
2.2.1 料液比对溶剂萃取金银木果实色素的影响
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1:5 1:10 1:15 1:20 1:25
ᯉ⏢∄(g/mL)

ݹ

图 2 不同料液比条件下提取制备的金银木果实色素样液的吸光度
Fig.2 Effect of material/solvent ratio on the absorbance of
pigment extract of Lonicera maackii fruit
由图2可知,金银木干燥果实粉碎样本以体积分数
95%乙醇在60℃水浴中浸提2h,在料液比1:15时的色素萃
取率达最高值为1.139。
2.2.2 超声输出功率对金银木果实色素提取的影响
1.00
1.05
1.10
1.15
1.20
1.25
1.30
100 200 300 400 500 600 700
䍙ໄࡳ⥛/W

ܝ

图 3 不同超声输出功率条件下提取制备的金银木果实色素样液的吸光度
Fig.3 Effect of ultrasonic output power on the absorbance of
pigment extract of Lonicera maackii fruit
由图3可知,随着超声输出功率从100W逐渐增大,
提取的金银木果实色素样液吸光度呈上升趋势,至超声
输出功率为500W时,样液的吸光度达到最大,为1.239;
再继续增大超声输出功率,提取果实色素的样液吸光度
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.22 51
则显著下降。超声辅助提取中,超声的空化作用、机械
作用、热学作用汇集到含水样本的组织内部,通常随着
超声输出功率增大和超声处理时间延长而致样液温度快速
上升,对金银木果实色素提取的这种影响,推测是大于
500W的超声输出功率在作用30min之后,样液因超声而上
升的温度达到能引起色素吸光度发生改变的水平值[15],从
而使色素样液的吸光度降低。
2.2.3 超声提取时间对金银木果实色素提取的影响
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
0 10 20 30 40 50 60
䍙ໄᯊ䯈/min

ܝ

图 4 不同超声时间条件下提取制备的金银木果实色素样液的吸光度
Fig.4 Effect of ultrasonication time on the absorbance of
pigment extract of Lonicera maackii fruit
由图4可知,随着超声提取时间延长,样液的吸光度
逐渐增大。超声提取时间在0~10min时,样液的吸光度
呈直线式快速递增趋势;超声时间在10~40min时,样液
的吸光度呈较缓慢递增趋势;当超声时间在40min以上
时,样液吸光度呈很缓慢递增趋势。本研究中,为保持
种子呈较完整状态,对金银木果实是采用研磨破碎,果
皮通过研磨仅仅只是稍微地被破碎,而且超声处理是在
果实样本经过溶剂恒温浸提2h之后。因此,超声处理初
期,浸提中尚未提出的部分果实色素,很容易在超声的
空化作用、机械作用和热效应下被溶剂快速地提出。但
随着超声时间延长,色素向果皮组织细胞外的扩散速度
减缓,溶液的热效应积累使提取温度上升到接近或达到
能改变色素吸光度的温度水平值,导致样液吸光度随着
超声时间延长而呈缓慢递增变化。
2.3 响应面法优化色素超声辅助提取试验
2.3.1 响应面试验的结果
依据表1中的因素与水平值,按照Box-Behnken响应
曲面法设置17个提取工艺组,其中12个为析因点、5个为
零点,每个试验组均进行平行试验以减少操作误差,其
试验结果见表3。
根据表3数据,运用Design Expert 7.0软件进行多元
回归拟合分析,得到超声辅助提取金银木果实色素的
样液吸光度的预测值(Y)对自变量X1、X2和X3的二次多
项回归方程模型:Y = 0.7+0.14X1+0.043X2+0.041X3-
6×10-3X1X2+0.01X1X3+0.015X2X3-0.049X12-0.021X22-0.03X32。
依据表3试验结果的回归模型方程系数、方差分析,以及
因素的显著性检验的结果见表4。
表 3 响应面法的试验设计与结果
Table 3 The experimental design and results for response surface analysis
试验号 X1 X2 X3 A450nm
1 1 0 -1 0.713
2 1 -1 0 0.735
3 0 0 0 0.689
4 0 -1 -1 0.556
5 0 0 0 0.678
6 0 1 -1 0.654
7 1 0 1 0.818
8 -1 1 0 0.530
9 -1 0 -1 0.439
10 0 1 1 0.764
11 1 1 0 0.768
12 -1 0 1 0.503
13 0 0 0 0.692
14 0 -1 1 0.608
15 0 0 0 0.708
16 0 0 0 0.716
17 -1 -1 0 0.473
表 4 响应面法试验结果的方差分析
Table 4 Analysis of variance for the experimental results of
response surface design
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性
模型 0.20 9 0.022 28.72 0.0001 **
X1 0.15 1 0.15 196.18 <0.0001 **
X2 0.015 1 0.015 19.58 0.0031 **
X3 0.014 1 0.014 18.12 0.0038 **
X1X2 1.44×10
-4 1 1.44×10-4 0.19 0.6756
X1X3 4.202×10
-4 1 4.202×10-4 0.56 0.4801
X2X3 8.41×10
-4 1 8.41×10-4 1.11 0.3265
X1
2 9.976×10-3 1 9.976×10-3 13.2 0.0084 *
X2
2 1.933×10-3 1 1.983×10-3 2.56 0.1538
X3
2 3.708×10-3 1 3.708×10-3 4.91 0.0623
残差 5.289×10-3 7 7.556×10-3
失拟项 4.358×10-3 3 1.453×10-3 6.24 0.0546 不显著
纯误差 9.321×10-3 4 2.328×10-3
总离差 0.20 16
注:**.差异极显著,P<0.01;*.差异显著,P< 0.05。
据表4结果,该回归模型方程的拟合达极显著水平
(P=0.0001<0.01),回归模型方程的决定系数R2= 0.9736,
失拟项P=0.0546>0.05,因此其失拟性检验结果为不显
著。这表明该模型方程与试验数据的拟合程度高,试验
组的误差小,模型方程完全可用于金银木果实色素超声
辅助提取结果的分析和预测指导。表4的分析结果还表
明:料液比、超声提取时间和超声功率,都是影响金银
木果实色素超声辅助提取效果的显著因素。
2.3.2 响应面法试验因素的交互作用分析
响应面法试验中各因素交互作用对果实色素提取的
影响,经Design Expert 7.0软件分析的结果见图5。
52 2013, Vol.34, No.22 食品科学 ※工艺技术
0.8100
0.7175
0.6250
0.5325
0.4400
30
25
20
15
101:5.0
1:7.5
1:10.0
1:12.5
1:15.0

ݹ

䎵༠ᰦ䰤/min
ᯉ⏢
∄(g
/mL)
5
30
25
20
15
10
1:5 1:7 1:9 1:11 1:13 1:15
੨ݹᓖ




/ m
in
ᯉ⏢∄(g/mL)
0.6
0.5
0.7
A.超声时间与料液比
0.8200
0.7225
0.6250
0.5275
0.4300
500
400
300
200
100 1:5.0
1:7.5
1:10.0
1:12.5
1:15.0

ݹ

䎵༠࣏⦷/W ᯉ⏢
∄(g
/mL)
5
500
420
340
260
180
100
1:5 1:7 1:9 1:11 1:13 1:15
੨ݹᓖ




/ W
ᯉ⏢∄(g/mL)
0.6
0.5
0.7
0.8
B.超声功率与料液比
0.770
0.715
0.660
0.605
0.550
500
400
300
200
100 10
15
20
25
30

ܝ

䍙ໄࡳ⥛/W 䍙ໄ
ᯊ䯈
/min
5
500
420
340
260
180
100
10 15 20 25 30
਌ܝᑺ




/ W
䍙ໄᯊ䯈/min
0.65
0.6
0.7
C.超声功率与超声时间
图 5 各因素及其交互作用对超声辅助提取影响的响应面图
Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of
independent variables on the absorbance of pigment extract of
Lonicera maackii fruit
根据响应面试验设计原理及分析[20],结合图5形状及
表4结果,料液比、超声时间和超声输出功率对金银木果
实色素提取都呈显著影响,影响程度的大小顺序是:料
液比>超声时间>超声功率。同时,图5和表4还反映,
实验中所设置的3个因素各水平之间交互作用对色素提取
的影响不显著。
2.3.3 响应面法优化的工艺条件验证
依据金银木果实色素超声辅助提取的响应面法试验
结果及其回归方程模型,得到超声辅助提取金银木果实
色素的优化工艺条件为料液比1:15(g/mL)、超声萃取时
间30min、超声输出功率499.98W,运用该工艺条件提取
色素的吸光度预测值为0.836。考虑到仪器操作的便利,
将优化工艺条件中的超声输出功率修正为500W,然后开
展平行提取实验,得出此修正条件下提取的色素液的平
均吸光度为0.827,该实验值与模型方程的预测值仅相差
1.08%,表明经响应面法优化的果实色素超声辅助提取工
艺组合条件准确可靠,该模型方程具有实用价值。
3 结 论
对金银木果实首先用最适溶剂进行恒温浸提,然
后进行超声辅助提取,对该提取工艺的料液比、超声输
出功率和超声提取时间进行三因素三水平的响应面法试
验。结果表明:料液比、超声输出功率和超声提取时间
对色素提取均有显著影响作用。运用Design Expert 7.0
软件对试验结果进行多元回归方程拟合及方差统计分
析,得到金银木超声辅助提取的优化工艺条件为料液比
1:15(g/mL)、超声时间30min、超声功率499.98W。在该
优化工艺条件下提取金银木果实色素样液的吸光度与回
归模型方程的预测值仅相差1.08%,为0.836,表明经响
应面法试验优化的工艺条件具有实用价值。
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.22 53
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