全 文 ：浙 江 农 业 大 学 学 报 20 ( 5 ) : 4 5 1一 4 5 6 , 1 9 9 4
Jo u r o l o f Z h e ji a n g A g r i e u l t u r a l U n i
v e r s i t y
芜著花叶病毒杭州分离株外壳蛋白基因序列分析①
徐 平 许建平 辞朝阳
(浙江农业大学生物技术研究所 , 杭州
李德葆
3 10 0 2 9 )
摘 要 从杭州郊区分离出一个 T u M V 强毒株系 ,利用分子克隆和 S an g er 双 脱氧测序方法分
析了其外壳蛋白基因的 D N A 序列 . 该序列与已报道的其他 4 种 T u M V 分离物都具有较高的同源
性 , 最高达 97 . 6 % , 最低达 89 . 5 % ,其氨基酸序列的同源性更高 , 最高达 97 . 9 % , 最低达 94 . 5 % . 本
文分析了该序列 中 A T 和 G C 含量 ,计算了 4 种核昔酸在有意义链中和在密码子不同位置上 的出
现频率 , 同时还分析了该病毒外壳蛋白氨基酸遗传密码的使用频率 .
关 键 词
中图分类
芜著花叶病毒 ; 外壳蛋白 ; D N A 序列
Q 9 3 9 〔 · 4 6〕 ; Q 7 5 5
X u P i n g ; X u J i a nP i
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1 9 9 4
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2 0 ( 5 )
:
4 5 1一 4 5 6
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s a ie v i
r u s ; c o a t p r o t e i n ; D N A
s e q u e n e e
芜着花叶病毒 ( T u M V )属马铃薯 Y 病毒组 ,病毒为长 72 0 n m , 宽 12 n m 的杆状粒子 , 兵
基因组长约 10 k b ,编码一个约 36 0 k D 的多肤 〔 ’ 〕 . 它广泛分布于世界各地 , 主要侵染十字花科
植物 , 是十字花科植物的主要病毒病病源之一 目前除以农药防治蚜虫传播外 , 尚无其他有效
防治手段 ,从而严重地危害了农业生产 ,造成巨大的经济损失 .
近年来 , 随着生物工程的发展 , 人们利用病毒的编码基因进行植物基 因工程的研究 ,生产
出一系列新的抗病毒植物新品种 , 有效地提高 了植物的抗病性 . 本文在克隆到 T u M V 杭州株
系外壳蛋白基因的基础上 ,进行了亚克隆并测定了外壳蛋 白基因的全部序列 , 利用计算机对该
基因进行了分析 .
收稿 日期 : 一9 94一 0 1一 0 4
①浙江 省科委 “八五 ” 攻关课题
浙 江 农 业 大 学 学 报 2 0卷
1 材料和方法
1
.
1 材 料
T u M V 杭州株系外壳蛋 白基因由本实验室经 P C R 扩增后克隆获得 , 参见文献 [ 2〕. 实验
中采用的克隆载体为 p U C 18 和 p U C 1 9 ,大肠杆菌受体菌为 JM 1 09 .
所有限制酶和 T 4 D N A 连接酶均来 自 oB he ir n g M an n he im 公司 , 序列分析试剂盒来自
U S B i o e h e m i e a l 公 司 , [ a 一 3 5 5 ] d A T P 来 自 A m e r s h a m 公 司 , 丙 烯酞 胺 、 甲叉双 丙烯 酞胺和
T E M E D 来 自 L K B P h o m ac ia 公司 . 其他常用化学药品为国产分析纯试剂 .
L 2 D N A 的提取和克隆
微量提取 D N A 采用碱裂解法 3[] . 大量提取纯化 D N A 时 , 先将细菌培养过夜 , 再经 1 70
陀 /m L 氯霉素处理过夜使质粒扩增 ,然后用碱裂解法裂解细菌 , 并采用澳化乙淀一 sC CI 梯度平
衡离心法纯化获得超螺旋 D N A ,方法参见文献 [ 3〕.
D N A 的亚克隆是取 2 拌g 含 T u M V 外壳蛋白基因的 D N A ,经适当的限制酶切割后 , 70 ℃
加热使限制酶失活 , 加入乙醇沉淀 D N A 后再将 D N A 悬浮于水中 ,与经适当限制酶切割的质
粒载体混匀后 , 用 T 4 D N A 连接酶在 16 ℃ 下连接过夜 ,将连接产物转化 JM 1 09 感受态菌并
涂布在 X 一 ga l/ A p 平板上 . 从转化 出的菌落中挑取阳性克隆 , 分别微量抽提质粒进行分析 ,具
体方法参见文献 [习 .
L 3 D N A 序列分析
以纯化的质粒 D N A 为模板 , 经 N a O H 变性后分别加入 p U C / M 13 上 、 下游通用引物 , 按
aS gn
e r 双脱氧测序法 ,用 T 7 D N A 聚合酶进行 D N A 序列测定反应 ,反应产物经 6%聚丙烯酞
胺凝胶 于 2 o 0 V 下电泳分离 , 用 5 %甲醇 5%冰醋酸固定 ,将凝胶转移到滤纸上并经真空抽
干 ,于 K od ak X 一 O M A T X 光片上曝光 48 小时 ,显影后读出序列 ,参见文献 [ 4〕. 将获得的序列
输入计算机中 ,利用 G e n b a n k 和 N A S A 程序分析 比较所得序列和其它 已报道序列的差异 .
2 结果和分析
2
.
1 外壳蛋 白基因的亚克隆
外壳蛋 白基因的亚克隆按图 1 策略将含外
壳蛋白基因的片段经 cE o R l 酶切后亚克隆到
p U C 18 和 p U C 19 中 ,分别转化大肠杆菌并在
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ga l / A p 平板上挑取数十个 白色菌落 ,微量抽
提 质粒 , 经 限 制 酶 切分 析 后 获 含 0 . 5 k b 和
0
.
4 k b 片段的亚克隆 .
2
.
2 外壳蛋白基因的一级结构
利 用 p U C /M 13 上 , 下游通用引物 , 以碱
变性后的质粒 D N A 为模板 ,通过 T 7 D N A 聚
合酶进行 S a n ge r 法双脱氧测序 . 从 X 光片上
读出 D N A 序列 (见图 2 , 命名为 T u M V C P X ) .
P s t 1 E e o R 1 E e o R
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C l o n e l
C lo n e Z
C lo n e 3
图 1 外壳蛋白基因亚克隆策略
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5 期 徐 平等 芜普花叶病毒杭州分离株外壳蛋白基因序列分析 45 3
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T u M V C P N ; P
:
T u M V C P P
浙 江 农 业 大 学 学 报 2 0卷
该序列与 G ne ba n k 中存在的 4种 T u M V (其 中 2种尚未公开发表 )外壳蛋白基因的同源性都
比较高 , 这 4 种 T u M v 外壳蛋 白序列分别按作者命名为 T u M v c P K [5 ] 、 T u M v C P G ( G r e e n -
l a n d
,
A
.
J
. ,未发表 ) 、 T u M v C P N [` ]和 T u M v C P P ( P a r k , Y . 等人 ,未发表 ) ,它们与 T u M V C P X
的同源性分别为 89 . 5% , 97 . 6% , 96 . 7写和 91 . 7% , 相对而言 , 有差异的碱基大部分分布在基
因的 5 `端 . 其氨基酸 序列见图 3 , 与 已报道 4 种 T u M V 外壳蛋 白基因的同源性除一种为 9 .4
5%外 , 其余均为 97 . 9 % . 从 图 2 和 图 3 中可以看出由于遗传密码的兼并性 , 使氨基酸序列的
同源性明显大于 D N A 序列的同源性 .
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图 3 羌 茜花叶病毒外壳蛋白氦 荃酸序列
F i g
.
3 A m i n o a e id s e q u e n e e o f T u M V
e o a t p r o t e i n
X
:
T u M V C P X
,
K
:
T u M V C P K
,
G
:
T u M V C P G ; N
:
T u M V C P N
; P
:
T u M V C P P
2
.
3 DN A 序列的一些特性
利用计算机分析 T u M V 杭州株系外壳蛋 白基因的结果表明 , 双链 D N A 的 A T 出现频率
为 52 . 13 % , C G 出现频 率为 47 . 87 % . 在该基 因的 D N A 序列中存 在下列限制 酶酶切位点 :
A l u l ( 5 63
,
64 5
,
6 5 0 )
,
cB l l ( 4 7 8 )
,
D d e l ( 6 4 6 )
,
E e o R I ( 4 8 8 )
,
H a e 皿 ( 3 5 9 , 5 4 5 ) ,
:)
6 7 8 5
96127
H i n f l ( 2 0 8 )
,
M b
o l ( 2 6 5
,
2 9 8
,
4 7 8
,
4 9 5 )
,
M b o l ( 7 0
,
1 5 2
,
6 1 1 )
,
M l u l ( 6 5 7 )
,
T a q l
( 2 6 4
,
65 2 )( 数字为酶切位点位置 ) . 在有意义
单链 D N A 中各种核昔酸的 出现 频率为 A
3 3
.
1 0 %
,
C 2 0
.
9 9%
,
G 2 6
.
8 7%
,
T 1 9
.
0 3 %
,
A 的出现频率明显高于 T . 各种核昔酸在密
码不同位置的出现频率见表 1 , 由表 1 可知
A 在密码中第二个位置的出现频率较高 , T
表 1 阅读框中 4 种核普酸在不 同
位置 的 出现频率
T a b l e 1 P o
s
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in o p e n r e a d in g f r a m e
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::
::
在第一个位置的出现频率较低 . 表 2 为外壳蛋白基因遗传密码的使用频率 , 与植物和动物遗传
5期 徐 平等 芜蔷花叶病毒杭州分离株外壳蛋白基因序列分析 4 55
密码的使用频率 比较 , T u M V
表 2
T
a
b l
e
Z
外壳蛋白基因与双子叶植物较为相近 , 而与人差异较大 .
外壳蛋 白的氛基酸遗传密码使用频率
C o d o n u
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.
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3 讨 论
经分析表明 T u M V 杭州株系外壳蛋 白基因与其他 4 种 已经报道的外壳蛋 白基 因都具有
较高的同源性 , 从而确证了该基因可编码 T u M V 的外壳蛋白 , 为下一步转基 因植物工作打下
基础 . 但同时在核酸水平上杭州株系又与其他分离物具有一定的区别 , 在 D N A 中这些区别大
多分布在 5`端 ,在氨基酸序列中则大多出现在 N 端 . 由于氨基酸密码子 的兼并性 , 使氨基酸序
列之 间的同源性 比 D N A 之间的更高 . 比较 D N A 和氨基酸序列表明 , 在分子水平上 , 不 同的
农 报4 56 浙 让 衣 业 人 子 子 j仪 ` U甘
T u M V 株系之间可能具有一定的差异 , 因此利用这种差异 , 通过分子生物学手段可迅速准确
地划分出不同的株系 , 从而减少人们利用生物学鉴定划分株系所花费的大量人力和时间 . 目前
人们 已通过生物学 鉴定方法和单克隆抗体分离划分出许多种 T u M V 株 系 .s[ ’ 〕 , 这些不同的
T u M V 株系在致病力上存在着较大的差异 , 而这种差异都会反映在 D N A 水平上 ,通过 比较不
同株系之间致病力和 D N A 序列的差别 ,就可能推断出与致病有关的基因 ,从而为认识抗病机
制提供理论依据 .
利用分子生物学手段进行基因工程具广阔的应用前景 ,它为人们改造植物 、 产生新的优良
品种提供了新的途径 . 但我们也应意识到 , 由于 目前许多分子生物学方面的基本理论 问题 尚未
彻底解决 ,产生新的优 良品种并非一墩而就 ,仍需要进行大量艰苦的工作 .
参考文献
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