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基于 AFLP分析用吴茱萸叶高质量 DNA的提取
冉贵萍 ,黄海＊ ,刘杨 ,谭杰峰(贵阳医学院检验系临床生化教研室 , 贵州 贵阳 550004)
摘要:目的:研究吴茱萸叶基因组 DNA 的提取方法 ,以用于扩增片段长度多态性(AFLP)分析。方法:设计了一种改良 CTAB
法:以石英砂代替液氮研磨;抽提前用不溶性 PVP结合酚形成络合物 ,然后用缓冲液除去;抽提中加入 Vc。将改良 CTAB 法所提
吴茱萸叶 DNA 与传统的 SDS 法 、CTAB 法所提 DNA进行比较。利用植物的核糖体 DNA(rDNA)保守序列设计引物行 PCR扩增鉴
定吴茱萸 DNA 及其质量。并确定提取方法中最佳样本含量和 β -巯基乙醇浓度。结果:改良 CTAB 法提取石虎 、疏毛吴茱萸总
DNA呈白色 , A260 A280为 1.721～ 1.886 , DNA分子完整 ,约 20kb 左右 , PCR扩增条带清晰 、明亮 ,无杂带和脱尾。并确定 0.10g为最佳样本量 , 2.0%为最佳 β-ME 浓度。结论:石英砂研磨简便 、迅速 、均匀 , 该实验所建立的改良 CTAB 法可有效避免次生代谢物
的氧化褐变 ,是一种小量 、快速提取吴茱萸叶 DNA优化方法。
关键词:吴茱萸;基因组 DNA;提取;改良CTAB法;PCR扩增
中图分类号:R282.7　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)05-0038-03
High Quality Genomic DNA Extraction of Fructus Evodiae for AFLP Analysis
RAN Gui-ping ,HUANG Hai＊ , LIU Yang ,TAN Jie-feng(Department of Clinical Biochemistry , Guiyang Medical College ,Guiyang 550004 ,China)
Abstract:Objective:To study the genomic DNA extraction method from Fructus Evodiae , so as to get high quality DNA for amplified fragment
length polymorphism analysis.Methods:An improved CTAB method was established:Replace liquid nitrogen with silica , Eliminate most of the
hydroxybenzene with solid PVP and buffer before extraction , Add the solid Vc during the extraction process.The quality of DNA extracted by the
improved CTAB method was compared with the DNA extracted by the SDS method and CTAB method.A pair of primer was designed according to
a length of conservative sequence of plant gene , which was applied to do PCR amplification and to authenticate the quality of DNA.Set the most
appropriate content of leaves sample and the most appropriate concentration of β -mercaptoethanol.Results:With the improved CTABmethod , all
the total DNA extracted from fructus evodia were pure and A260 A280 were 1.721 ～ 1.886.Most of the DNA extractions were integrate and were
about 20kb.There was no zone tailing and other non-specific bands.The most appropriate content of leaves sample and β-mercaptoethanol were
0.10g and 2.0%.Conclusions:Triturating leaves with silica is more handy and rapid.The improved CTABmethod can avoid the oxidation effec-
tively and is an optimized method to extract genomic DNA of fructus evodiae.
Key words:Fructus Evodiae;Genomic DNA;Extract;Improved CTABMethod;PCR
收稿日期:2007-06-16;修回日期:2007-08-30
基金项目:贵州省中药现代化专项项目资助(“基因芯片技术用于吴茱
萸 DNA指纹图谱研究” ,黔科合农字[ 2005] 5047号)
作者简介:冉贵萍(1973-),女 ,硕士 ,讲师 ,从事肿瘤分子遗传学及分
子生物技术应用研究 , E-mail:ranguiping@yahoo.com.cn;＊通讯作者:
黄海 ,博士 ,副教授 , E-mail:huanghai828@gmc.edu.cn。
　　吴茱萸是我省重要道地药材之一 ,临床应用非常广泛 , 是
主要的出口中药材之一 ,尤其是石虎和疏毛吴茱萸 , 药用价值
极高 ,但传统的分类学方法不易将其鉴别。本课题组拟建立
吴茱萸的分子生物学分类方法 , 促进吴茱萸种质资源的研究 ,
帮助当地农民进行品系选择的优化。
扩增片段长度多态性(AFLP)基础是基于高质量 DNA 的
提取 , 因此能否成功快速提取高纯度 、高质量的植物组织
DNA , 将决定后续实验的成败。目前关于吴茱萸叶 DNA 提取
方法在国内外未曾报道 ,我们针对吴茱萸叶富含多糖 、酚类的
特性在传统的 CTAB法基础了作了改进 , 建立了一种小量 、快
速提取吴茱萸叶 DNA的优化方法 , 适用于条件一般的普通实
验室。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料:吴茱萸 Evodia rutaecarpa(Juss)Benth.采集贵
州铜仁 、石阡 、松桃地区的小花吴茱萸包括疏毛和石虎两个亚
种共40份。取新鲜幼嫩叶片 , 冻于-80℃超低温冰箱保存 , 于
1w 内完成 DNA抽提。
1.1.2　试剂:石英砂购自天津市科密欧化学试剂开发中心 ,聚
乙烯吡咯烷酮(PVP)、CTAB 、Tris碱 、β-巯基乙醇 、Taq 酶 、琼脂
糖购自上海Sangon 公司 ,常规化学试剂购自广州化学试剂厂 ,
分析纯级别。
1.1.3　仪器:PCR扩增仪(美国 ABI公司 2400 型), TGL-16 高
速离心机(江苏华欧仪器厂), DYY-3A型电泳仪(北京六一仪
器厂),凝胶成像系统(美国ABI 公司 BIO-RAD型)。
1.2　方法
1.2.1　SDS 法[ 1] :0.10g 吴茱萸幼嫩叶片 ,加入 0.20g的石英
砂迅速研磨后 , 加入 600μl 65℃预热的 SDS 提取缓冲液及 80μl
10%的 SDS , 混匀 , 于 65℃保温 20min 后 , 加入 200μl 5mol L 的
KAc ,混匀 , 保温 30min ,离心取上清。氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提
1次 , 异丙醇沉淀 DNA。
1.2.2　CTAB 法[ 2] :0.10g 幼嫩叶片 , 加入 0.20g 的石英砂迅速
研磨后 , 加入 700μl预热的 2×CTAB 液 , 再加入 100μl 2%V V
的 β-ME充分混匀 , 65℃水浴 1h , 离心收集上清液 , 氯仿∶异戊
醇(24∶1)抽提 2～ 3次 , 异丙醇沉淀 DNA。
1.2.3　改良 CTAB 法:0.10g 幼嫩叶片 , 在石英砂中研磨时加
入叶片重量 10%的 PVP粉末 , 然后装入 1.5ml离心管 , 加入冷
藏的提取缓冲液(0.25mol L NaCl , 0.25mol L Tris-HCl , 50mmol
L Na2-EDTA)1200μl ,冰上放置 10min , 离心 , 弃去上清液 ,再加
入 700μl的 2×CTAB 液和 100μl的 2%的 β -ME , 按 1.5mgVc
mg 叶片加入 Vc(pH=6.0 ～ 6.5),以下步骤同 CTAB法。
1.3　DNA样品的检测方法
对于所提取的 DNA样品 ,采用紫外分光光度法和琼脂糖
凝胶电泳法来检测其纯度及含量 , 采用一段植物基因保守序
列进行 PCR扩增来鉴定所提取的 DNA质量。
1.3.1　DNA纯度检测
取 DNA 样品20μl ,加入 1.98ml的双蒸水稀释 ,在 260nm 和
280nm 处测定吸光度 ,计算:DNA 浓度=50ng μl×A260×稀释倍
数 ,纯度=A260 A280 , DNA得率(ng·mg-1)=A260×50×稀释倍数
样品鲜重。
1.3.2　DNA电泳鉴定
0.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定:取 10μl所提 DNA样品 , 加
第 17卷第 5 期:38
2007 年 10 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.5:38
Oct.2007
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2007.05.017
入 2μl上样缓冲液 , 混匀注入胶孔内 ,电压 100V ,电泳 1h , 于凝
胶成像系统中紫外灯照射观察。
1.3.3　DNA质量检测
根据文献[ 3]和 genbank数据库设计一对引物 , 扩增核糖体
DNA(rDNA)中 18S 与 26S 间的一段序列 , 引物由上海 Sangon 公
司合成。引物 1:5 -AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3
引物 2:5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 。
PCR扩增体系:5μl的 10×buffer(含 25mmol L MgCl2);4μl
的2.5mmol L dNTP;1μl的 50μmol L 引物 1;1μl的 50μmol L 的
引物 2;模板 DNA400ng μl;Taq DNA 聚合酶 2U;ddH2O 加至
50μl。94℃预变性 2min , 94℃变性 1min , 54℃退火 1min , 72℃延
伸 1min , 循环 30次 , 72℃最后一次延伸 10min。
扩增产物经 0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定成像。
1.4　标本量及 β-巯基乙醇浓度的摸索
为了优化条件 , 我们在改良 CTAB 法中设置了样品量为
0.05、0.10 、0.15g 三个级别 , β -巯基乙醇浓度设为 0.5%、
1.0%、2.0%、3.0%四个级别。通过比较分析 ,确定加入的最
适标本量和最适 β-巯基乙醇浓度。
2　结果
2.1　三种方法提取的 DNA 沉淀颜色有差别 , SDS 法为深棕
色 , CTAB法为淡黄色 ,改良 CTAB 法所提 DNA 为白色 ,从外观
上看每种方法所提 DNA 所含的杂质量是不同的。紫外分光光
度仪检测结果:改良 CTAB 法所得 DNA 产量较高 , 且纯度最
高 , A260 A280值在 1.721 ～ 1.886 之间 ,见表 1。
表 1　三种方法提取的DNA的吸光度和得率的比较
Table 1　Comparison of the absorbency and extraction rate of DNA extracted by
three methods
方法 品种 颜色 A260 A280 A260 A280 C(ng μl)DNA得率
SDS法 石虎吴茱萸 棕色 0.0947 0.0736 1.287 947 18.94
疏毛吴茱萸 棕色 0.0964 0.0766 1.258 964 19.28
CTAB法 石虎吴茱萸 浅黄色 0.0518 0.0363 1.427 518 10.36
疏毛吴茱萸 浅黄色 0.0504 0.0377 1.337 504 10.08
改良 CTAB法 石虎吴茱萸 白色 0.0659 0.0370 1.781 659 13.18
疏毛吴茱萸 白色 0.0735 0.0412 1.784 735 14.70
2.2　琼脂糖凝胶电泳结果显示(见图 1), 3种方法所提的 DNA
均有20kb的主带 , 改良CTAB 法的 DNA 条带最亮 , DNA分子大
小均一 ,条带集中在 20kb左右。
图 1　3种方法提取的核总 DNA
1-2:改良CTAB法;3-4:SDS 法;5-6:CTAB法。
Fig.1　Patterns of DNA extracted by three methods
1-2:improved CTAB method;3-4:SDS method;5-6:CTABmethod.
2.3　核糖体 DNA(rDNA)的PCR扩增片段的电泳检测(见图2)
在780bp 处均可见一清晰 、明亮条带 , 符合引物扩增片段
大小。相同模板用量情况下 , 7 ～ 9 条带为改良 CTAB 法所提
DNA的扩增片段 , 条带单一 ,亮度最强 ,含量最高 , 重复性好。
通过以上外部观测 ,紫外分光光度仪 , 琼脂糖凝胶电泳检
测和 PCR扩增产物鉴定可以确定改良 CTAB 法是提取吴茱萸
叶基因组 DNA 的最佳方法。
图 2　吴茱萸 rDNA基因片段 PCR扩增产物电泳结果
1-3为 SDS法提取吴茱萸叶DNA扩增片段;4-6为CTAB法提取吴茱
萸叶 DNA 扩增片段;7-9为改良 CTAB法提取吴茱萸叶 DNA 扩增片
段。
Fig.2　The electrophoresis of PCR amplified fragment of rDNA of Fructus Evo-
dia
1-3:PCR amplified f ragment of DNA extracted by SDS method;4-6:PCR
amplified fragment of DNA extracted by CTAB method;7-9:PCR amplified
fragment of DNA ext racted by improved CTAB method.
2.4　不同实验样品量和不同 β -ME 浓度对提取 DNA 的影响
(结果见图 3)
图 3　不同实验用品量和不同 β-ME浓度对总 DNA的影响
1-3的 β-ME浓度为 0.5%;4-6的β -ME浓度为 1.0%;7-9的 β-
ME浓度为 2.0%;10-12的 β -ME浓度为 3.0%。样品量:1 、4 、7 、10
(0.05g);2 、5 、8 、11(0.10g);3 、6 、9 、12(0.15g)。
Fig.3　Comparison of the effect with different contents of sample and different
concentration of β -ME
1-3 corresponding to 0.5%β -ME;4-6 corresponding to 1.0%β-ME;7
-9 corresponding to 2.0%β-ME;10-12 corresponding to 3.0%β -ME.
Content of sample leaves:1 , 4 , 7.10 corresponding to 0.05g;2, 5 , 8 , 11 corre-
sponding to 0.10g;3 , 6, 9 , 12 corresponding to 0.15g.
由图 3 分析 ,实验标本量较少及过多时 , 所提的 DNA均为
弱带或无带 , 当样品控制量在 0.10g 左右时 , 条带最亮。当样
品量不变时 , 随 β-ME 浓度增高 , DNA 条带亮度呈增高趋势 ,
但达到 3.0%时反而多数无条带或弱带 , 因此 , β -ME 浓度建
议控制在 2.0%。
3　讨论
植物中的多酚类化合物和多糖常常造成 DNA 提取的质量
下降[4 ,5] ,因此提取高质量的 DNA 是 AFLP标记分析的首要解
决问题。目前 , 药用植物 DNA 的提取有多种方法:高盐低 pH
法 、SDS 法 、CTAB 法等 , 但效果不一。李毅等[ 6] 采用 SDS 法提
取天麻干品 DNA , CTAB 法提取天麻鲜品 DNA 效果最理想;陆
嘉惠等[7]采用核 DNA 提取法提取甘草属植物 DNA , 实验中加
入 PVP干粉 , CTAB 为 3%;郝岗平等[ 8] 采用改良 CTAB 法提取
泰山白花丹参干叶片 DNA ,实验中也加入了 PVP 干粉 , β -ME
为4%。我们发现仅仅在 CTAB 法中添加抗氧化剂和提高
CTAB 的浓度 ,也不能完全避免 DNA 褐变 , 因为吴茱萸叶片研
磨第一步过程中 , 会释放大量的多酚类化合物与 PVP 结合 , 如
果我们在加入 CTAB 液裂解细胞前 ,就以缓冲液将这部分多酚
氧化物溶解除去 , 就可以有效避免 DNA被多酚褐变。 我们还
发现 β-ME的用量并非越多越好 ,加入过高的 β-ME 会影响
392007年 10 月　　　　　　　　　　　　　　基于 AFLP分析用吴茱萸叶高质量 DNA的提取　　　　　　　　　　　　　　　
DNA的产率。对于一些条件一般的常规实验室 , 液氮运输不
便 ,不易贮存。因此我们在总结以往经验的基础上 , 对 CTAB
法作了如下改进:①在叶片研磨过程中 , 以石英砂代替液氮。
石英砂研磨均匀 ,快速 , 大大减少了破碎组织与空气接触的时
间 ,可以取得同样满意的效果。为了保证低温研磨 , 事先将研
钵放入-20℃预冷。 ②在 CTAB 裂解细胞前 , 加入固体 PVP
(聚乙烯吡咯烷酮),可以与多酚类杂质结合形成络合物 , 用缓
冲液提取除去。 ③在 CTAB裂解细胞抽提 DNA 过程中以固体
形式加入Vc(抗坏血酸), 可以阻止多酚类物质的氧化 , 抑制
DNA酶的活性 , 防止 DNA 分解。 ④通过优化比较 , 确定了最
佳叶片用量为 0.10g 及最佳 β-巯基乙醇浓度为 2%。 叶片标
本加入量会影响 DNA 的提取 ,太少的样品会导致 DNA 得率较
低 ,样品太多 , CTAB 溶液黏稠 , 细胞裂解不充分导致 DNA 没有
完全释放 ,影响 DNA浓度和纯度。
以优化的改良 CTAB法提取的 DNA为白色 , 约 20kb 左右 ,
电泳条带清晰 、明亮 , 无杂带或脱尾 , 采用一段植物基因保守
序列进行 PCR扩增 , 进一步验证了所提取的 DNA 纯度高 、质
量好 ,能满 AFLP 分析要求。
总之 ,本实验中的改良 CTAB 法是一种小量 、快速提取吴
茱萸叶基因组 DNA的优化方法 , 所提 DNA 模板可用于后续的
AFLP分析。
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γ-谷氨酰转肽酶活性电泳染色新方法
袁江兰1, 2 ,胡征1 ,康旭1 ,李良1 ,张樊1 ,邹国林2＊(1.湖北工业大学生物工程学院 ,湖北 武汉 430064;2.武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室 , 湖北 武汉 430072)
摘要:目的:建立一种新的电泳活性染色方法 ,以快速地对活性电泳中γ-谷氨酰转肽酶(GGT)进行显色 , 从而准确鉴定和定
位该酶 ,并可用于该酶的电泳法纯化制备。方法:低温下 ,样品活性电泳结束后立即将浸有γ-L-谷氨酰-α-萘氨和双甘肽混
合底物溶液的滤纸贴在胶面上反应 5min ,然后再用浸有对氨基苯磺酸和亚硝酸钠混合显色液的滤纸覆盖在基质滤纸上显色。 结
果:在滤纸上很快显示出一条红色条带 , 经切胶酶促反应检验确定为 GGT , 经电泳法和高效液相色谱法确定 GGT 达到了电泳纯。
结论:该法快速 、灵敏 、简单 、直观 ,为 GGT的鉴定和纯化提供了一条新思路。
关键词:γ-谷氨酰转肽酶;对氨基苯磺酸染色法;电泳;纯化
中图分类号:Q503　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)05-0040-003
Novel Staining Method for Native-electrophoresis on γ-glutamyltranspeptidase
YUAN Jiang-lan1 , 2 ,HU Zheng1 , KANG Xu1 , LI Liang1 , ZHANG Fan1 ,ZOUGuo-lin2＊
(1.College of Biological Engineering , Hubei University of Technology , Wuhan 430064 , China;
2.College of Life Sciences , National Key Laboratory of Virology , Wuhan University , Wuhan 430072 , China)
Abstract:Objective:In the paper , a novel staining method for native-electrophoresis was established to display γ-glutamyltranspeptidase(GGT)in glue of native-PAGE quickly , consequently identify and orient the enzyme exactly , and be applied to purify and produce the enzyme
by electrophoresis.Methods:after the GGT samples were native-electrophoresed under low temperature , a filter paper with mixed substrate ofγ-L-glutamyl-α-naphthylamide and glycylglycine was pasted on the glue immediately to react with GGT for 5 minutes , then another filter pa-
per with solution of P-aminobenzene sulfonic acid and sodium nitrite was affixed on the previous one to display the color.Results:a bright red
strip was showed on the paper and confirmed as GGT by the characteristic reaction of GGT , and further the product was validated to up to the elec-
trophoresis purity.Conclusion:This method was fast , sensitive , simple and intuitionistic and provided a new idea to identification and purification
of GGT.
Key words:γ-glutamyltranspeptidase;staining;native-electrophoresis;P-aminobenzene sulfonic acid;electrophoresis purification
收稿日期:2007-04-09;修回日期:2007-07-12
作者简介:袁江兰(1970-),女 ,博士 ,讲师 ,研究方向为应用生物化学
和分子生物学 , E-mail :jlyuan1229@163.com , 承担省级重点项目 2
项 , 发表 SCI 论文 4篇;＊通讯作者:邹国林(1947-),男 ,教授 ,博士生
导师 ,研究方向为应用生物化学和分子生物学 , E-mail:zouguolin@
whu.edu.cn ,发表论文 200余篇。
　　γ-谷氨酰转肽酶(GGT , γ-glutamyltranspeptidase , EC 2.3.
2.2)是一个异二聚体酶 ,从细菌到哺乳动物都发现了 GGT 的
存在。GGT是γ-谷氨酰循环中的关键酶 , 与谷胱甘肽的代谢
有关[ 1] , 它能催化γ-谷氨酰基化合物中γ-谷氨酰基团的断
裂 ,如果 GGT进一步将γ-谷氨酰基团转移给其它的氨基酸
和肽 ,就形成了新的γ-谷氨酰基化合物 , 如果γ-谷氨酰基
团的受体为水 ,该酶促反应就成为一个水解反应 , 产物为γ-
谷氨酸[ 2] 。 GGT参与了γ-谷氨酰循环和氨基酸的跨细胞膜
转运 , 与机体内谷胱甘肽(glutathione , GSH)水平的调节有关。
对于氨基酸和蛋白质的吸收 、转运 、合成具有重要作用。 GGT
常分布于肾 、胰 、肝 、肠 、脑等组织中 , 在人体中以肾脏含量最
高[3] 。
大量研究已证明病毒性肝炎与肝细胞损伤密切相关 , 并
且以 GGT的高表达为特征[ 4] , 因此 GGT 在国内主要应用于在
临床检测 , 作为肝病的生物标志 , 在国外对 GGT在细胞中的
生理生化作用及其应用的研究较多 , 日本则在利用γ-GT 催
化合成短肽药物方面研究较多[ 3] 。利用细菌 GGT 生产γ-谷
氨酰基化合物具有两大优点:GGT的催化反应为简单的单步
骤过程;不需能量。但是该生产过程中最昂贵的过程是 GGT
的制备 , 即使利用固定化酶或细胞情况也是如此[ 2] 。 因此
GGT具有非常重要的生物学意义 , 也是新一代生物医药生产
的重要酶 , 具有重要的药用价值 ,但 GGT的理论和应用研究都
很不充分 , 原因在于GGT 的稳定性较差 ,而且在大多数生物体
内均属于一种胞内酶[ 5] , 纯化非常困难 , 迄今为止 , GGT 的发
现已经有 55 年的历史[ 6] , 但直到 2006 年大肠杆菌GGT的晶体
结构才公诸于世[7] , 2007 年才有大肠杆菌 GGT前体蛋白晶体
结构的报道[8] ,研究多以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的 GGT 为
模型 , 采用分子生物学的方法获得 GGT。目前 , 还没有任何纯
第 17卷第 5 期:40
2007 年 10 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.5:40
Oct.2007