全 文 ：　　为此下一步重新做层析 , 只是收集洗脱液时 , 每管收集
1m L,作好标记 ,共收集 15管。将试管放在 50℃的水浴锅里
小心蒸干 , 由于用无水乙醇溶解后 , 做液相时 , 会出现一个很
高的溶剂峰 , 给积分带来很大的影响 , 所以这里采用流动相
来做溶剂 , 这样就不会有一个很高的溶剂峰 , 减少积分的误
差。得到的数据见表 2。
表 2　洗脱液各管中所含的姜黄素含量(每管 1mL)
Tab 2　Cu rcum in conten t o f eve ry eluent tube(eve ry tube 1m L)
管号 峰面积
1 0
2 0
3 0
4 28153
5 135084
6 284485
7 285319
8 212274
9 130726
10 64834
11 40171
12 25668
13 27778
　　从表 2可以看出 ,姜黄素主要集中在 5 ～ 9号管中 , 也就
是在第 5 ～ 9m L中 ,尤其是第 6 ～ 8管较多 , 因此下一步的收
集 6 ～ 8三管 , 经干燥得到一定纯度姜黄素的样品 , 并计算其
纯度。
2. 4　姜黄素纯度的计算
收集第 6 ～ 8管的姜黄素 , 合并共 27 mL,取 0. 5mL经在
水浴锅里(50℃)干燥 ,用 2. 5m L流动相溶解 , 测得其浓度为
374. 593μg /mL,将洗脱液蒸干 , 测得其重为 0. 0125g 。
姜黄素的纯度 =浓度 ×体积 /重量 ×100%
=3. 74×10- 4 ×26. 5 /0. 0125×100%
=79. 4%
2. 5　讨论
本实验是利用硅胶的极性吸附原理来分离姜黄素 , 粗品
中的物质由弱到强依次被洗脱下来。用一定比例的二氯甲
烷与丙酮的混合液 (3∶1, 9∶1, 95∶5)进行实验 , 发现二氯甲
烷-丙酮 =95∶5的洗脱效果较好。
用乙醇热提取姜黄素时 , 会有很多淀粉被乙醇溶解出
来 , 虽然经过减压过滤 , 但是过滤之后还有大量的淀粉通过
滤纸间隙而进入滤液。用二氯甲烷与甲醇溶解后 , 瓶壁上还
有很多的固体没有溶解 ,可能就是淀粉。
用乙醇提取物直接做液相时 , 要用 0. 45μm有机膜过滤
两次 , 防止色谱柱被堵住。
色谱柱的制作也可以用湿柱法(石油醚浸泡), 因石油醚
极易挥发 , 安全性不好。用干柱法的好处是制作方便 、减少
有机溶剂消耗 ,提高安全性。
3　结论
本实验所得的姜黄素样品的纯度为 79. 4%,如果再深入
做下去 , 相信可以得到更高纯度的姜黄素 , 这有待下一步实
验来证实。本实验证明用醇提法从姜黄中提取姜黄素 , 用柱
层析法把姜黄素从醇提物中与其它杂质分离 ,从而达到一定
纯度的姜黄素样品 ,是切实可行的。
参考文献
[ 1] 唐课文 ,周丹.从姜黄中提取姜黄素的研究 [ J] .天然产物研
究与开发 , 2004, 16(3):231.
[ 2] 中国发明专利 , CO9B61 / 100, GK87101355.
[ 3] 王贤纯. 姜黄色素及其提制方法 [ J] . 生物学杂志 , 2000, 17
(1):36.
[ 4] 中国发明专利 , CO9B61 /100, GK88100041.
[ 5] 董海丽 ,纵伟.酶法提取姜黄素的研究 [ J] .纯碱工业 , 2000,
6:55.
[ 6] 吴伟志 ,袁翠美.姜黄素的高效液相色谱分析 [ J] .中国野生
植物资源 , 1998, 3:56.
[ 7] 汤球华 ,胡永狮. 姜黄 、莪术 、郁金中姜黄素的含量 [ J] .海峡
药学 , 1998, 3:30.
收稿日期:2003-10-15
基金项目:国家 “ 863”计划重点资助项目(2002AA2Z3217)。
作者简介:邹盛勤(1970 -),男 ,江西奉新人 ,大学本科 ,副教授 ,从事有机化工和生物医药研究。
反相高效液相色谱法测定陆英中乌索酸和齐墩果酸含量
邹盛勤 1 ,刘传安 2(1.宜春学院生物工程研究所 ,江西　宜春 336000;2.宜春学院理学院 ,江西　宜春 336000)
摘要:目的　建立陆英药材中乌索酸和齐墩果酸含量的测定方法 。方法　选用 Symme try C18(3. 9mm ×150 mm , 5μm)色谱柱 ,
流动相甲醇-水 (88∶12), 检测波长 220nm , 流速 0. 6 mL /m in, 柱温 25℃。 结果　乌索酸的线性范围 0. 098 ～ 2. 35 μg, r =
0. 9999;齐墩果酸的线性范围 0. 099 ～ 2. 38 μg, r=0. 9997。乌索酸和齐墩果酸平均回收率分别为 97. 9 %(RSD为 2. 11 %)和
98. 6 %(RSD为 1. 84%)。结论　本法可同时测定乌索酸和齐墩果酸含量 , 具有准确 、灵敏 、数据可靠的优点 ,可用于陆英药
材的质量控制。
330 Ch in JMAP, 2005 Augus t, Vo.l 22 N o. 4　　　　　　　　　　　　　　　中国现代应用药学杂志 2005年 8月第 22卷第 4期
DOI牶牨牥牣牨牫牱牬牳牤j牣cnki牣issn牨牥牥牱牠牱牰牴牫牣牪牥牥牭牣牥牬牣牥牪牱
关键词:陆英;乌索酸 ;齐墩果酸;反相高效液相色谱法;含量测定
中图分类号:R917. 799. 1　　　文献标识码:B　　　文章编号:1007-7693(2005)04-0330-04
Determ ination of ursolic ac id and oleanolic acid in Sambucus chinensis byRP-HPLC
ZOU Sheng-qin1 , LIU Chuan-an2(1. B ioengineering Research Institute, Y ichun University, Y ichun 336000, China;2. School of
Science, Y ichun University, Y ichun 336000, Ch ina)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To deve lop a new m e thod fo r dete rm ina tion of urso lic acid and o leano lic ac id in Sam bucus ch inensis
L ind.l METHOD S　The Symm e try C18(3. 9×150 mm , 5 μm)w as used as analytical co lomn w ith m ethano l-wa ter(88∶12)a s mobile
phase. The detec tion wave leng th w as a t 220nm. The flow ra tew as 0. 6 mL /m in and the co lum n tem pe ra turew as 25℃. RESULTS　
The calibration cu rve of urso lic acid w as linear ove r the range o f 0. 098 ～ 2. 35μg, the corre lation coe fficien tw as 0. 9999. The ca libra-
tion curve of o leano lic acid wa s linear over the range of 0. 099 ～ 2. 38μg, the corre lation coe fficien tw as 0. 9997. The ave rage recoveries
o f u rso lic acid and o leano lic acid w ere 97. 9% (RSD=2. 11%) and 98. 6% (RSD=1. 84%), respective ly. CONCLUTION　The
content of urso lic acid and o leano lic acid can be simu ltaneously de term ined byHPLC. Them e thod is accurate, sensitive and re liab le, it
can be used for quality con tro l of m ed ic ina lm ate ria ls o fSam bucus ch inensis L ind.l
KEY WORDS:Sam bucus chinensis L ind.l;ursolic acid;oleano lic acid;RP-HPLC;de term ination
　　中药陆英 Sambucus ch inensis L ind.l ,为忍冬科接骨木属植
物 ,又名八棱麻 、接骨木 、八里麻 , 多年生草本 , 产于我国南北
各地 ,以根 、茎 、叶入药 , 是我国民间常用草药 , 有活血 、散瘀 、
止痛 、利尿 、消肿等作用 [1] 。江西宜春应用陆英及其制剂治疗
肝炎取得了显著效果 ,随后深入进行了药化 、药理的研究 ,从
陆英中提取分离出 α-香树脂醇(α-amy rin), β-香树脂醇(β-
amy rin), β-谷甾醇 (β-sitostero l), 齐墩果酸(oleanolic acid)及
乌索酸(urso lic acid)5种成分, 证实了陆英中乌索酸(熊果酸)
的含量远远高于齐墩果酸的含量 ,乌索酸是陆英抗肝炎的主
要活性成分 [ 2, 3] 。其含量测定方法未见报道 ,为了控制陆英药
材质量 ,我们研究建立了 RP-HPLC法同时测定不同采收期或
不同产地陆英药材中乌索酸与齐墩果酸的含量。
1　仪器与试剂
1. 1　仪器
W aters高效液相色谱仪:600泵 , 2478紫外可见光检测
器 , 7725I进样阀 , 柱温箱 , M illennium32色谱管理系统;
FA2004N电子分析天平 (上海天平仪器厂);TG16-W S高速
离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司);0. 45 μm微孔
滤膜。
1. 2　试剂
甲醇为色谱纯 , 乙醇 、盐酸 、氢氧化钠为分析纯 , 水为重
蒸馏水。乌索酸和齐墩果酸对照品由中国药品生物制品检
定所提供 (批号分别为 110742-200314和 110709-200311, 供
含量测定用 )。陆英药材于 2002年采自江西奉新 、宜丰 、高
安 、万载及袁州区 , 并经江西省药物研究所张海道研究员鉴
定为陆英(Sambucus ch inensis L ind.l )。
2　方法与结果
2. 1　溶液的配制
2. 1. 1　对照品溶液的配制　精确称取乌索酸对照品 19. 6
m g,齐墩果酸对照品 19. 8 mg, 分别置于 10 m L量瓶中 , 用甲
醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 , 制成含乌索酸 1. 96 m g /mL和齐
墩果酸 1. 98 mg /mL的对照品溶液 ,备用。
2. 1. 2　样品溶液的配制　采用酸解乙醇回流法提取。分别
称取干燥至恒重的陆英药材 2. 0g,置于圆底烧瓶中 , 加入体
积分数为 95%乙醇 60 m L及体积分数为 20%盐酸 2 mL, 水
浴加热回流提取 2 h。过滤 ,滤液用饱和氢氧化钠溶液调 pH
值为 5,定量转移至 100 m L量瓶中 , 乙醇定容 , 摇匀。取 2
mL于离心机(3000 r /m in)中离心 5 m in, 上清液用 0. 45 μm
微孔滤膜过滤 ,得样品溶液。
2. 2　色谱条件
色谱柱为 Symm etry C
18
柱(3. 9 mm ×150 mm , 5 μm ,美国
W aters公司), 流动相为甲醇-水(88∶12), 流速 0. 6 m L /m in,
检测波长为 220 nm , 柱温 25℃。数据处理为外标法峰面积
定量 [ 4] 。对照品 HPLC谱图见图 1(a)。
图 1　对照品和样品的 HPLC谱图
F ig 1　HPLC ch rom a tag ram sof standard and samp le
a. 对照品　 b.陆英样品　 1.齐墩果酸　2.乌索酸
a. standard　b. sam p le　1. o leanolic acid　2. u rsolic acid
2. 3　线性关系试验
分别吸取乌索酸和齐墩果酸对照品溶液 25, 50, 100,
200, 300, 400, 500, 600 μL至 10 mL量瓶中 , 用甲醇定容 , 摇
匀 , 得乌索酸和齐墩果酸对照品系列混合溶液。各精密吸取
331 中国现代应用药学杂志 2005年 8月第 22卷第 4期　　　　　　　　　　　　　　　Ch in JMAP , 2005August, Vo.l 22 No. 4
20 μL进样 , 平行三次 ,按上述色谱条件测定峰面积 。以峰面
积平均值对样品进样量(μg)进行线性回归 , 得乌索酸回归
方程为:Y =4. 60×105X +1. 29×104 , r=0. 9999;齐墩果酸回
归方程为:Y =5. 17×105X +2. 74 ×104 , r=0. 9997。表明当
乌索酸进样量在 0. 098 ～ 2. 35 μg, 齐墩果酸进样量在 0. 099
～ 2. 38 μg之间时 , 线性关系良好。
2. 4　精密度试验
以同一对照品混合溶液进样 , 每次 20 μL, 重复进样 5
次 , 分别测定峰面积数值 , 计算得乌索酸峰面积 RSD为 1. 30
%, 齐墩果酸峰面积 RSD为 0. 92%。
2. 5　重现性试验
精密称取干燥至恒重的同一批陆英样品 5份 (每份 2. 0
g),按 “ 2. 1. 2”项下样品溶液配制方法制备 , 进样量为 20
μL, 测定峰面积 ,计算得乌索酸峰面积 RSD为 1. 76 %, 齐墩
果酸峰面积 RSD为 2. 13 %。
2. 6　回收率测定
采用加样回收法测定。精密称取已知乌索酸与齐墩果
酸含量的陆英 5份 , 加入乌索酸 、齐墩果酸对照品适量 , 按
“ 2. 1. 2”项下样品溶液配制方法提取处理 ,进样 20 μL, 测定
峰面积 , 用外标法计算乌索酸与齐墩果酸含量 , 得乌索酸的
平均回收率为 97. 9%, RSD为 2. 11 %;齐墩果酸的平均回
收率为 98. 6 %, RSD为 1. 84 %。结果见表 1、表 2。
表 1　陆英中乌索酸回收率测定结果
Tab 1　The experim ental results of the recoveries o f urso lic acid
in Sam bucus chinensis L ind.l
样品量
/g
样品中含量
/m g
对照品加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
1. 007 3. 47 3. 53 6. 95 98. 6
0. 998 3. 44 3. 53 6. 91 98. 3
1. 016 3. 51 3. 53 6. 93 96. 9 97. 9 2. 11
1. 032 3. 61 3. 53 7. 04 97. 2
0. 981 3. 38 3. 53 6. 86 98. 6
表 2　陆英中齐墩果酸回收率测定结果
Tab 2　The experim en ta l results o f the recove rise of o leanolic
acid in Sambucus chinensis L ind.l
样品量
/g
样品中含量
/m g
对照品加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均值
/%
RSD
/%
1. 007 0. 41 0. 99 1. 41 101. 0
0. 998 0. 41 0. 99 1. 38 98. 0
1. 016 0. 42 0. 99 1. 38 97. 0 98. 6 1. 84
1. 032 0. 42 0. 99 1. 41 100. 0
0. 981 0. 40 0. 99 1. 36 97. 0
2. 7　样品测定
按 2. 1. 2项下样品溶液配制方法提取处理得样品溶液 ,
进样 20μL测定峰面积 ,用外标法计算乌索酸和齐墩果酸含
量。样品 HPLC谱图见图 1(b),不同采收期和不同产地陆英
药材中乌索酸和齐墩果酸含量测定结果见表 3, 表 4。
表 3　不同采收期陆英中乌索酸与齐墩果酸含量 (n =5)
Tab 3　The conten t o f urso lic acid and oleano lic acid in Sambu-
cus chinensis L ind .l in various co llecting pe riods(n=5)
药材采收月份
(奉新)
乌索酸含量
/%
RSD
/%
齐墩果酸含量
/%
RSD
/%
1 0. 276 0. 35 0. 029 1. 32
3 0. 297 0. 82 0. 034 0. 92
5 0. 345 1. 76 0. 041 2. 30
7 0. 326 2. 10 0. 038 1. 76
9 0. 246 1. 39 0. 026 2. 13
11 0. 262 0. 68 0. 031 1. 42
表 4　不同产地陆英中乌索酸与齐墩果酸含量 (n =5)
Tab 4　The conten t o f urso lic acid and oleano lic acid in Sambu-
cus chinensis L ind .l in differen t co llec ting places(n=5)
药品采收地
(5月)
乌索酸含量
/%
RSD
/%
齐墩果酸含量
/%
RSD
/%
奉新 0. 345 1. 76 0. 041 2. 30
宜丰 0. 319 0. 99 0. 035 1. 13
高安 0. 341 1. 17 0. 038 1. 42
万载 0. 323 1. 28 0. 029 1. 15
袁州区 0. 315 1. 52 0. 034 1. 26
3　讨论
3. 1　由于乌索酸和齐墩果酸均属五环三萜酸 , 且为同分异
构体 , 两者极性几乎无差别 , 因此在薄层板上很难将两种成
份分离开 , 从而难于建立薄层扫描法对其进行准确测定。而
这两种天然成分在植物中往往同时共存 , 因此建立 HPLC法
同时测定乌索酸和齐墩果酸含量具有重要意义。
3. 2　乌索酸和齐墩果酸在流动相中的最大吸收波长为
202. 2nm和 203. 4nm , 由于在短波长处溶剂甲醇也有末端吸
收 , 故选取 220nm为测定波长 , 既能降低基线噪音 , 又可以保
证检测器的灵敏度 [ 5] 。
3. 3　在 2. 0 g陆英样品中分别加入体积分数为 95%乙醇或甲
醇 60 mL及体积分数为 20%盐酸 2 mL, 分别回流提取 1. 0,
1. 5, 2. 0, 2. 5, 3. 0 h, 测定提取液中乌索酸和齐墩果酸含量 ,
2. 0 h后 ,随回流时间的延长 , 提取液中乌索酸和齐墩果酸含
量基本不变 ,表明样品中乌索酸和齐墩果酸已提取完全 ,乙醇
和甲醇提取效率基本相同, 但甲醇提取杂质峰较多 ,影响乌索
酸和齐墩果酸的分离 ,故确定用乙醇回流提取2. 0 h。
3. 4　从表 3,表 4可知 , 同一产地 5月 、7月份采收的陆英药材
中乌索酸和齐墩果酸含量较高 ,与其他月份采收的样品有较
大差别 , 5 ～ 7月份为最佳采收期;不同产地同一采收期陆英药
材中乌索酸和齐墩果酸含量基本相同。测定结果表明, 不同
采收期或不同产地陆英药材中的乌索酸含量均远远高于齐墩
果酸含量 ,从而证实乌索酸是陆英中抗肝炎的主要活性成分。
3. 5　采用 HPLC法测定陆英药材中乌索酸与齐墩果酸的含
量 ,方法简便 ,准确灵敏, 可以作为控制陆英药材质量的方法。
参考文献
[ 1] 江苏新医学院.中药大词典(下册)[M ] .上海:上海人民出版
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HPLC测定 [ J] .中草药 , 1999, 30(12):901.
收稿日期:2003-06-10
作者简介:徐韧柳(1962-),女,河北省人 ,主任药师。主要研究方向:中药制剂工艺与质量标准研究。电话:(0311) 85212008-8045
反相高效液相色谱法测定野菊花中绿原酸的含量
徐韧柳 1 ,李丽华 2 ,康怀萍3(1.河北省药品检验所 ,河北　石家庄 050011;2.河北医科大学中医学院 ,河北　石家庄 050000;3. 河北科
技大学 ,河北　石家庄 050018)
摘要:目的　建立野菊花中绿原酸的含量测定方法 , 控制其质量。方法　采用高效液相色谱法 ,以 Agilen t ZORBAX SB-C18柱
为色谱柱 , 乙腈-0. 1%磷酸溶液(9:91)。为流动相 , 检测波长为 327nm, 流速 1. 0m L /m in,采用面积外标法计算。结果　绿原
酸浓度在 1. 02 ～ 102. 0mg /L范围内与峰面积呈良好线性关系 , r=0. 9998, 平均加样回收率为 99. 82%(RSD=1. 2%, n =9)。
结论　本方法简便易行 ,结果准确 , 可有效控制生药的质量。
关键词:高效液相色谱法;野菊花;绿原酸
中图分类号:R917. 799. 1　　　文献标识码:B　　　文章编号:1007-7693(2005)04-0333-02
Determ ination of chlorogenic ac id in Flos Chrysanthem i Indic i by RP-HPLC
XU Ren-liu1 , LI Li-hua2 , KANG Huai-ping3(1. Hebei P rovincial Institute for D rug Control, Shijiazhuang 050011, China;2.
College of T raditional ChineseMed icine,HebeiM edicalUn iv isity, Shijiazhuang 050011, China;3. HebeiUn ivisity of Science and Techn-
olog, Shijiazhuang 050011, Ch ina)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To deve lop a me thod for the dete rm ina tion o f ch lo rogen ic ac id in F lo s Chry san them i Ind ic.i METHOD
　H igh perfo rmance liqu id chroma tog raphy (HPLC) me thod w as app lied to dete rm ine the con ten.t Analysis co lum n o f Agilen t ZORB-
AX SB-C18(4. 6mm ×250mm , 5μm), mobile phase o f ace tonitrile-0. 1% phospho ric ac id so lu tion (9∶91), detec tive w aveleng th a t
327nm , flow ra te o f 1. 0mL /m in and externa l standard m ethod we re se lec ted in assay. RESULTS　The m e thod w as linear ove r the
rang of 1. 02 ～ 102. 0m g /L, r=0. 9998, the average recovery w as 99. 82%(RSD=1. 2%, n =9). CONCLU SION　This m ethod is
proved to be sim ple and reliable and can be used fo r the qua lity control o f F los Ch rysanthem i Ind ic .i
KEY WORDS　high perform ance liquid ch rom a tog raphy;F lo s Chry santhem i Indici;ch lo rogenic acid
　　野菊花为菊科植物野菊 Chry santhem um indicum L. 的干
燥头状花序。它具有清热解毒的功效 , 用于疔疮痈肿 , 目赤
肿痛 , 头痛眩晕等症 [ 1] 。收载于中国药典 2000年版一部 ,现
行标准中没有含量测定项。有关野菊花有效成分的含量测
定报道较少 , 为了有效控制药材的质量 , 建立野菊花中绿原
酸的高效液相测定方法。该方法简便易行 , 结果准确 , 不仅
适用于野菊花药材的质量分析 ,还可供野菊花单方或复方制
剂借鉴。
1　实验方法
1. 1　仪器与试药
高效液相色谱 仪:日本岛津 LC-10ADVP 泵;SPD-
M 10AVP二极管阵列检测器;CLASS-VP /LC色谱工作站。美
国 7725手动进样器。
绿原酸对照品购自中国药品生物制品检定所(供含量测
定用),野菊花为河北以岭医药研究院有限公司和河北华加
药业有限公司提供 , 乙腈为色谱纯 , 磷酸为优级纯 , 其他试剂
为分析纯。
1. 2　色谱条件
色谱柱:USA Agilen t ZORBAX SB-C18色谱柱 (规格 4. 6
mm ×150mm , 5μm)。柱温:室温。流速:1. 0mL /m in。 流动
相:乙腈-0. 1%磷酸溶液 (体积比为 9∶91)。 检测波长
327nm。进样量 20μL。 理论板数按绿原酸峰计算不低于
4000。
1. 3　样品测定方法
对照品溶液的制备　精密称取干燥的绿原酸对照品约
10mg, 置 50mL棕色量瓶中 , 用甲醇溶液并稀释至刻度 , 摇
333 中国现代应用药学杂志 2005年 8月第 22卷第 4期　　　　　　　　　　　　　　　Ch in JMAP , 2005August, Vo.l 22 No. 4