全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１３（１６）：１１４～１１９
第一作者简介：李颖（１９８７－），女，硕士，研究方向为真菌分子遗传。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｙｉｎｇ５１１９６＠１２６．ｃｏｍ．
责任作者：谢占玲（１９６６－），女，博士，教授，硕士生导师，研究方向
为真菌及酶学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｅｚｈａｎｌｉｎｇ２００３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ．
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１２６００２１）；青海省自然
科学基金资助项目（２０１１－ｚ－７２４）；国家重点实验室培育基地青
海省高原作物种质资源创新与利用重点实验室开放课题资助
项目（２０１１－０５）。
收稿日期：２０１３－０４－０９
黄绿蜜环菌ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的优化及引物筛选
李 　 颖１，谢 占 玲１，２，田 　 飞１，贾 贤 卿１，方 　 慧１，夏 明 哲１
（１．青海大学 生态环境工程学院，青海 西宁８１００１６；２．青海省高原作物种质资源创新与利用重点实验室，青海 西宁８１００１６）
　　摘　要：以ＣＴＡＢ法提取的黄绿蜜环菌（Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ）ＤＮＡ为模板，应用Ｌ１６（４５）正
交实验设计，对Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ、引物和Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、模板浓度５种因素进行ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体
系优化，建立了适合黄绿蜜环菌ＳＳＲ－ＰＣＲ反应的最佳体系并对退火温度进行检测。结果表明：
在１５μＬ反应体系中包括：１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｅｒ，１００ｎｇ模板ＤＮＡ，ｄＮＴＰｓ　２１７μｍｏｌ／Ｌ，引物０．５μｍｏｌ／Ｌ，
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．７５Ｕ，Ｍｇ２＋１．３ｍｍｏｌ／Ｌ。稳定性检测证明，该反应体系具有较高的稳定性和
重复性，并从３４对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的ＳＳＲ引物８对。该体系的建立
为今后利用ＳＳＲ标记对黄绿蜜环菌遗传多样性研究、亲缘关系分析及种质资源鉴定等研究提供
了依据。
关键词：黄绿蜜环菌；ＳＳＲ－ＰＣＲ；体系优化；正交设计；引物
中图分类号：Ｓ　５０３．５３　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１３）１６－０１１４－０６
　　黄绿蜜环菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ）属担子菌
门（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）层菌纲（Ｈｙｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）伞菌目
（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）口蘑科（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａｔａｃｅａｅ）蜜环菌属
［Ａｒｍｉｌａｒｉａ（Ｆｒ．：Ｆｒ．）Ｓｔａｕｄｅ］，又名黄蘑菇，主要分布在
我国的青海、西藏等地，海拔３　０００～４　５００ｍ的草原或高
山草甸上，与高原牧草嵩草属（Ｋｏｂｒｅｓｉａ）植物形成外生
菌根［１］。黄绿蜜环菌营养丰富，香气浓郁，味道鲜美，具
有重要的食药用价值和生态功能，是青藏高原珍贵真菌
资源宝库中典型代表种之一［２］。但是由于其特殊生态
环境及短促的发生时间，其研究才刚刚起步。
蜜环菌属是口蘑科中一个重要的属，也是全球森林
生态系统真菌区系的一个重要的组成部分，世界各大洲
均有分布［３］。蜜环菌具有较高的食药用价值，而且还
是名贵中药天麻（Ｇａｓｔｒｏｄｉａ　ｅｌａｔａ）和猪苓（Ｇｒｉｆｏｌａ
ｕｍｂｅｌａｔａ）栽培所必备的共生菌。同时，蜜环菌在全世
界温带和寒带侵染６００多种树木，可导致林木根朽病，造
成巨大的经济损失［４］。目前，已报道的蜜环菌有５２种，
其中中国记录种有１４种［５］。近年来，在对蜜环菌属真菌
的分子研究方面，Ｋｉｍ等［６－７］采用ＲＦＬＰ、ＩＴＳ、ＩＧＳ－１和
ＡＦＬＰ对北美的部分蜜环菌属种进行了分子鉴定以及亲
缘关系分析；Ｃｏｅｔｚｅｅ等［８－９］基于ＩＴＳ和ＩＧＳ－１序列对南
美、印尼以及马来西亚的部分蜜环菌属种进行分子鉴定
和系统进化地位分析，Ｌａｎｇｒｅｌ等［１０］对法国西南的部分
蜜环菌属种进行简单重复序列多态性位点分离和鉴定；
Ｐｒｏｓｐｅｒｏ等［１１－１２］对法国西南的部分蜜环菌属种的种群遗
传结构进行了研究并用８个微卫星标记对瑞士和乌克
兰的部分蜜环菌属种进行研究，并将其成功运用到蜜环
菌属其它种，在这些研究报道中均未见有黄绿蜜环菌
（Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ）种；国内关于蜜环菌报道中，孙
立夫等［１３］采用ＩＳＳＲ对采自东北的５３个法国蜜环菌
（Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｇａｌｉｃａ）菌株进行遗传多样性分析，且表明
ＩＳＳＲ标记在蜜环菌中存在较高的多态性；王守现等［１４］
用ＲＡＰＤ技术对１３个蜜环菌（Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｍｅｌｅａ）菌株
进行了遗传多样性分析，研究结果表明ＲＡＰＤ技术可以
有效区分蜜环菌菌株并分析其遗传多样性。目前，青藏
高原黄绿蜜环菌研究报道主要是关于黄绿蜜环菌的生
物学特征，人工培养，化学成分分析等方面［１５－１６］；李海波
等［１７］首次基于分子手段对我国青藏高原的黄绿蜜环菌
种进行了分离培养、分子鉴定和系统发育分析，但是关
于黄绿蜜环菌（Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ）菌株ＳＳＲ研究方
面鲜见报道。
简单重复序列（Ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ），又称
微卫星ＤＮＡ（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ＤＮＡ），是由１～６个核苷酸
为单位多次串联重复的ＤＮＡ序列，广泛分布于真核生
物基因组中。同一类微卫星ＤＮＡ可分布在整个基因组
４１１
北方园艺２０１３（１６）：１１４～１１９ ·生物技术·
不同位置上，由于重复次数不同，或重复程度不完全，而
形成每个座位的多态性［１８－１９］。由于微卫星标记具有中
性、量大、共显性、多态性高等特点，故而是一种理想的
遗传标记。自发现以后，它很快发展为一种极具价值的
遗传标记［２０］，并在种群分化、家系分析、基因连锁分析、
进化研究、遗传多样性等方面的研究中广泛应用［２１－２２］。
在已有的报道中，Ｌａｎｇｒｅｌ等［１０］对法国西南的部分蜜
环菌属种进行ＳＳＲ位点分离和鉴定；Ｐｒｏｓｐｅｒｏ等［１１－１２］
对法国西南的部分蜜环菌属种的种群遗传结构进行了
研究并用８个微卫星标记对瑞士和乌克兰的部分蜜环
菌属种进行了研究，将其成功运用到蜜环菌属其它种；
Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ等［２３］用１２个微卫星标记对北美的部分蜜
环菌属种进行了研究。目前尚鲜见有关将微卫星技术
应用到黄绿蜜环菌遗传多样性研究的报道。由于微卫
星引物具有种属特异性，研究适用于黄绿蜜环菌遗传分
析的微卫星引物的任务就变得越来越紧迫和重要。
该研究选用采自青藏高原的野生药食两用菌—黄
绿蜜环菌为试材，利用正交实验设计方法，首次对影响
黄绿蜜环菌ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中的因素进行优化，以
期建立较为完整可靠的黄绿蜜环菌ＳＳＲ反应体系，为后
续开展遗传多样性的研究奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试黄绿蜜环菌子实体于２０１２年７月采自青海祁
连和西藏那曲、当雄及安多，体系优化仅选用采自青海
祁连样品。采集回来的样品立刻４０℃烘干，之后于干燥
环境中存储备用，用于ＤＮＡ提取。
用于ＳＳＲ－ＰＣＲ反应的Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、
Ｍｇ２＋均购于ＴａＫａＲａ公司，引物参考自文献［１０－１２，２３］，由
上海生物工程公司合成。标准分子量（Ｍａｒｋｅｒ）ＤＬ　５　０００
购于ＴａＫａＲａ公司。
１．２　试验方法
１．２．１　ＤＮＡ的提取与浓度测定　黄绿蜜环菌总ＤＮＡ提
取采用改良ＣＴＡＢ法［２４］，提取黄绿蜜环菌ＤＮＡ于－２０℃
下保存待用。用Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司生产的ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ
核酸检测仪检测ＤＮＡ溶液浓度与纯度，并将其稀释
５０ｎｇ／μＬ，－２０℃下保存。
１．２．２　ＰＣＲ反应因素水平的确定与正交表的设计　经
初步筛选，以条带清晰的Ａｒｍ１１作为正交实验的引物，
其序列为：Ｆ：５′－ＣＧＡＧＣＣＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣ－３′，Ｒ：
５′－ＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＴＧＡ－３′，为了确定ＰＣＲ反
应中的５个因素，即Ｔａｑ 聚合酶、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物、
ＤＮＡ模板５个因素的最佳水平，采用Ｌ１６（４５）正交设计
进行试验，正交实验因素及水平见表１，设计方案见表２，
设２次重复。共３２个ＰＣＲ管，按表２的数据加样；
另外，每管还加入１．５μＬ的１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（终浓
度为１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｅｒ），其余用ｄｄＨ２Ｏ补足，反应体系总
体积为１５μＬ。
表１ ＰＣＲ反应的因素和水平
　　Ｔａｂｌｅ　１ Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ μＬ
水平
因素
Ｔａｑ聚合酶
（５Ｕ／μＬ）
ｄＮＴＰ
（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｍｇ２＋
（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）
引物
（１０μｍｏｌ／μＬ）
ＤＮＡ模板
（５０ｎｇ／μＬ）
１　 ０．１０　 ０．９　 ０．８　 ０．２５　 ０．５
２　 ０．１５　 １．１　 １．０　 ０．５０　 １．０
３　 ０．２０　 １．３　 １．２　 ０．７５　 １．５
４　 ０．２５　 １．５　 １．４　 １．００　 ２．０
　　表２ ＳＳＲ－ＰＣＲ正交实验设计Ｌ１６（４５）
　　Ｔａｂｌｅ　２ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　Ｌ１６（４５）
处理
引物
（１０μｍｏｌ／Ｌ）
Ｍｇ２＋
（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）
ｄＮＴＰ
（各２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）
ＤＮＡ模板
（５０ｎｇ／μＬ）
Ｔａｑ酶
（５Ｕ／μＬ）
１　 ０．２５　 ０．８　 ０．９　 ０．５　 ０．１０
２　 ０．２５　 １．０　 １．１　 １．０　 ０．１５
３　 ０．２５　 １．２　 １．３　 １．５　 ０．２０
４　 ０．２５　 １．４　 １．５　 ２．０　 ０．２５
５　 ０．５０　 ０．８　 １．１　 １．５　 ０．２５
６　 ０．５０　 １．０　 ０．９　 ２．０　 ０．２０
７　 ０．５０　 １．２　 １．５　 ０．５　 ０．１５
８　 ０．５０　 １．４　 １．３　 １．０　 ０．１０
９　 ０．７５　 ０．８　 １．３　 ２．０　 ０．１５
１０　 ０．７５　 １．０　 １．５　 １．５　 ０．１０
１１　 ０．７５　 １．２　 ０．９　 １．０　 ０．２５
１２　 ０．７５　 １．４　 １．１　 ０．５　 ０．２０
１３　 １．００　 ０．８　 １．５　 １．０　 ０．２０
１４　 １．００　 １．０　 １．３　 ０．５　 ０．２５
１５　 １．００　 １．２　 １．１　 ２．０　 ０．１０
１６　 １．００　 １．４　 ０．９　 １．５　 ０．１５
１．２．３　ＳＳＲ－ＰＣＲ 扩增及检测　ＰＣＲ 扩增反应在
Ｂｉｏ－Ｒａｄ　ＰＣＲ扩增仪上进行，反应程序为：９４℃预变
性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５２℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，
３５个循环；７２℃延长１０ｍｉｎ，４℃保存。ＰＣＲ产物加３μＬ
６×Ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｅｒ，混匀后取５μＬ，以ＴａＫａＲａ公司的
ＤＬ　５　０００Ｍａｒｋｅｒ为对照，用２．０％琼脂糖凝胶，在电泳
仪上电泳。之后在凝胶成像系统拍照，得到ＰＣＲ电
泳图。
１．２．４　ＰＣＲ退火温度筛选　依据以上所得的最佳因素
水平，利用ＰＣＲ扩增仪进行ＰＣＲ反应程序中退火温度
梯度试验。退火温度在５１～５８℃之间设置１２个梯度：
５１．０、５１．２、５１．６、５２．２、５３．０、５４．０、５５．２、５６．２、５７．０、５７．５、
５７．９、５８．０℃。选择５１．０、５２．２、５３．０、５４．０、５５．２、５６．２、
５７．０、５８．０℃共８个温度设为梯度，对所得ＰＣＲ产物进
行电泳检测。
１．２．５　ＳＳＲ最佳反应体系体系稳定性检测　应用上述
最佳反应体系，用筛选出的其它ＳＳＲ引物，对１７份黄绿
蜜环菌ＤＮＡ进行ＳＳＲ扩增，进行黄绿蜜环菌ＳＳＲ－ＰＣＲ
反应体系的稳定性检测。
１．２．６　ＳＳＲ引物筛选　首先，将获得的３４对蜜环菌属
ＳＳＲ标记引物对黄绿蜜环菌的基因组ＤＮＡ模板进行初
步筛选，对初步筛选出的引物先进行退火温度梯度试
５１１
·生物技术· 北方园艺２０１３（１６）：１１４～１１９
验，再根据每对引物的最佳退火温度对４个不同地域黄
绿蜜环菌ＤＮＡ模板进行复筛，以条带数量丰富，清晰度
高，易于统计，稳定性好，背景低，多态性好作为核心引
物的标准，筛选核心引物。ＰＣＲ产物均在６％的变性聚
丙烯酰胺凝胶（ＰＡＧＥ）进行检测，用银染法进行显色、定
影，待凝胶干燥后使用扫描仪记录图像。
２　结果与分析
２．１　ＤＮＡ质量检测结果
用改良ＣＴＡＢ法提取的黄绿蜜环菌基因组ＤＮＡ，
其检测结果ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值在１．７９～１．８９之间，ＤＮＡ浓
度大致在２１３．１～７２５．３μｇ／ｍＬ之间，其纯度和产量均
较高。说明所提取的ＤＮＡ可用于ＳＳＲ分析。
２．２　ＳＳＲ－ＰＣＲ正交实验设计的直观分析
图１可以清晰看出，１６个组合的扩增结果存在差
异。可见ＰＣＲ的扩增结果是由 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ、引物和
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、模板等组分浓度综合作用的结果。其
中，第１、１１、１２、１５、１６组合扩增效果很差，几乎扩增不出
条带；第２、３、４、６、８组合电泳条带较弱；第５、７、９、１０、１３、
１４组合处理效果较好，通过条带数量丰富、清晰度高、背
景低的比较原则并综合经济因素等选择出最佳反应体
系９。即在１５μＬ反应体系中包括：１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｅｒ，
１００ｎｇ模板ＤＮＡ，ｄＮＴＰｓ　２１７μｍｏｌ／Ｌ，引物０．５μｍｏｌ／Ｌ，
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．７５Ｕ，Ｍｇ２＋１．３ｍｍｏｌ／Ｌ。
图１　正交设计ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的扩增结果
注：１～１６为处理组合代号，参见表２；Ｍ：ＤＬ　５　０００Ｍａｒｋｅｒ。
Ｆｉｇ．１　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ
Ｎｏｔｅ：１～１６ａｒｅ　ｔｈｅ　ｃｏｄｅｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｉｎ　ｔａｂｌｅ　２；Ｍ：ＤＬ　５　０００Ｍａｒｋｅｒ．
２．３　不同退火温度对黄绿蜜环菌ＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的影响
图２　不同退火温度对ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的影响
注：１～８依次为５１、５２．２、５３、５４、５５．２、５６．２、５７、５８℃；Ｍ：标准分子量
ＤＬ　５　０００。
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ
ＳＳＲ－ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｎｏｔｅ：１～８ａｒｅ　５１，５２．２，５３，５４，５５．２，５６．２，５７，５８℃；Ｍ：标准分子量
ＤＬ　５　０００．
不同的引物有不同的退火温度。ＰＣＲ反应中，退火
温度的高低直接影响引物与模板ＤＮＡ的特异性结合。
利用最佳反应体系进行退火温度梯度试验，由图２可以
看出，退火温度过低，则产物多且非特异性扩增条带较
多，结果不可靠；退火温度过高，引物与模板结合差，ＰＣＲ
产物丰度低，电泳条带亮度小，因此，如果采用该试验选
用的引物，应该采用５３．０℃的退火温度，即可扩增出清
晰的ＳＳＲ靶目标条带。
２．４　ＳＳＲ最佳反应体系稳定性检测
对已经筛选处理的引物中随机选择引物ＦＬＬ７，应
用上述最佳反应体系对１７份黄绿蜜环菌ＤＮＡ进行
ＳＳＲ扩增。由图３可知，引物对每份ＤＮＡ样品均扩增
出清晰、亮度较好的目的片段，说明该体系稳定，适用于
黄绿蜜环菌ＳＳＲ反应。
图３　引物ＦＬＬ７对１７份黄绿蜜环菌个体的扩增结果
注：１～１７为１７份黄绿蜜环菌ＤＮＡ扩增结果。Ｍ：ＤＬ　５　０００。
Ｆｉｇ．３　ＤＮＡ　ｂａｎｄｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｒｉｍｅｒ　ＦＬＬ　７ｉｎ
１７　Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ
Ｎｏｔｅ：１～１７ａｒｅ　１７　Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ．Ｍ：ＤＬ　５　０００．
６１１
北方园艺２０１３（１６）：１１４～１１９ ·生物技术·
表３　 １４对微卫星引物序列
　　Ｔａｂｌｅ　３　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１４ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ
引物代号 位点名称 引物序列（５′－３′） 碱基数 筛选结果
ＦＬＬ１
ＣＡＧ２５ａＦ
ＣＡＧ２５ａＲ
ＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＡ
ＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧ
２１
１９
ｐ
ＦＬＬ２
ＡｏＳＳＲ２１ａＦ
ＡｏＳＳＲ２１ａＲ
ＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＡ
ＣＡＣＣＡＣＧＡＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＣＡ
２０
２０
ｐ
ＦＬＬ３
ＣＡＧ７７ａＦ
ＣＡＧ７７ａＲ
ＴＡＧＣＣＴＧＣＧＧＴＴＡＣＧＡＴＧＡＣ
ＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＣＡＡＴＣＴＴＴＧＧ
２０
２０
ｍ
ＦＬＬ４
Ａｒｍ１５Ｆ
Ａｒｍ１５Ｒ
ＣＧＡＧＣＣＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣ
ＴＣＣＣＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＣＴＣ
２０
２０
－
ＦＬＬ５
Ａｒｍ１１Ｆ
Ａｒｍ１１Ｒ
ＣＡＴＣＣＣＴＴＴＣＧＧＡＣＡＧＣＡＣ
ＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＴＧＡ
１９
２０
ｐ
ＦＬＬ６
Ａｒｍ０５Ｆ
Ａｒｍ０５Ｒ
ＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＧ
ＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＧＡＧＧＴＣＴＡ
２０
１９
ｐ
ＦＬＬ７
Ａｒｍ１６Ｆ
Ａｒｍ１６Ｒ
ＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴＧＣ
ＧＧＣＧＣＡＴＴＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＡＡ
２０
２０
ｐ
ＦＬＬ８
Ａｍ０２４Ｆ
Ａｍ０２４Ｒ
ＧＡＣＣＧＧＡＣＣＴＣＧＴＡＴＧＡＣＡＣ
ＧＣＡＣＴＴＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＡＴＣＣ
２０
２０
±
ＦＬＬ９
Ａｍ１０９Ｆ
Ａｍ１０９Ｒ
ＡＴＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＡ
ＣＡＣＧＴＴＧＡＣＡＡＡＴＣＣＡＡＴＧＣ
２２
２０
±
ＦＬＬ１０
Ａｍ１２５Ｆ
Ａｍ１２５Ｒ
ＡＧＣＧＴＧＴＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＡ
ＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＧ
２０
２０
ｐ
ＦＬＬ１１
Ａｍ０３６Ｆ
Ａｍ０３６Ｒ
ＡＴＴＣＴＴＧＣＡＡＴＣＣＧＴＣＧＡＧＴ
ＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＴ
２０
２０
－
ＦＬＬ１２
Ａｍ０９４Ｆ
Ａｍ０９４Ｒ
ＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＴＣＧＡＡＣＡ
ＡＧＡＣＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＧＴＡ
２０
２０
ｐ
ＦＬＬ１３
ＡｏＳＳＲ２２Ｆ
ＡｏＳＳＲ２２Ｒ
ＡＧＡＴＡＣＣＡＴＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＴ
ＧＧＣＴＡＧＡＡＡＴＧＣＡＡＣＡＧＣＧ
２０
１９
ｐ
ＦＬＬ１４
ＡｏＳＳＲ７４Ｆ
ＡｏＳＳＲ７４Ｒ
ＧＣＴＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＡ
ＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＡ
２０
２０
－
　　注：－：无电泳条带；±：有条带但不清晰，模糊且不稳定；ｍ：电泳条带没有多态
性；ｐ：电泳条带多态性好。
Ｎｏｔｅ：－：Ｎｏ　ｂａｎｄ；±：Ｔｈｅｒｅ　ａｒｅ　ｂａｎｄｓ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｃｌｅａｒ，ｖａｇｕｅ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｓｔａｂｌｅ；ｍ：Ｎｏ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ｐ：Ｇｏｏｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ．
２．５　ＳＳＲ引物筛选结果
在初步筛选出的１４对微卫星引物中，有１１对微卫星
引物得到明显扩增产物，如表３所示。将初筛得到的１１
对微卫星引物对４０份黄绿蜜环菌ＤＮＡ模板进行扩增。
电泳检测后发现，引物ＦＬＬ４、ＦＬＬ１１、ＦＬＬ１４没有扩增条
带，说明这３对微卫星引物不适用于黄绿蜜环菌种群，引
物ＦＬＬ８、ＦＬＬ９扩增带非常弱且难分辨，引物ＦＬＬ３扩增
的带型中多态性较低，其余的８对引物（占５７．１％）都能对
黄绿蜜环菌ＤＮＡ模板产生各自特有且清晰的微卫星带
谱，电泳条带丰富，能较灵敏和准确的反应黄绿蜜环菌
ＤＮＡ的多态性（图４）。复筛入选的引物信息见表４。
表４ 筛选获得的８对ＳＳＲ引物信息和
ＰＣＲ扩增退火温度
　　Ｔａｂｌｅ　４ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　６ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ
ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｉｎ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
位点名称
Ｌｏｃｕｓ
重复序列
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｍｏｔｉｆ
引物序列（５′－３′）
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５′－３′）
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ／℃
ＦＬＬ１ ＣＡＧ２５ （ＣＡＧ）ｎ
Ｆ：ＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＡ
Ｒ：ＴＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧ
５５
ＦＬＬ２ ＡｏＳＳＲ２１ （ＣＡ）ｎ
Ｆ：ＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＡＡＡＣＴＡ
Ｒ：ＣＡＣＣＡＣＧＡＧＴＧＣＴＴＣＴＡＣＣＡ
５２
ＦＬＬ５ Ａｒｍ１１ （ＣＡＧ）ｎ
Ｆ：ＣＡＴＣＣＣＴＴＴＣＧＧＡＣＡＧＣＡＣ
Ｒ：ＴＡＣＣＡＧ　ＴＣＣＡＴＣＴＧＧＣＡＴＧＡ
５３
ＦＬＬ６ Ａｒｍ０５ （ＧＴＣ）ｎ
Ｆ：ＧＡＧＧＡＡＧＡＧＣＴＡＣＧＣＡＣＡＧＧ
Ｒ：ＣＧＧＴＴＴＣＡＴＣＧＧＡＧＧＴＣＴＡ
５４
ＦＬＬ７ Ａｒｍ１６ （ＴＣＧ）ｎ
Ｆ：ＡＴＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴＧＣ
Ｒ：ＧＧＣＧＣＡＴＴＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＡＡ
５２
ＦＬＬ１０ Ａｍ１２５ （ＣＡＣ）ｎ
Ｆ：ＡＧＣＧＴＧＴＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＡ
Ｒ：ＣＡＣＡＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＧ
５２
ＦＬＬ１２ Ａｍ０９４ （ＣＡＣ）ｎ
Ｆ：ＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＴＴＣＧＡＡＣＡ
Ｒ：ＡＧＡＣＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＧＴＡ
５３
ＦＬＬ１３ ＡｏＳＳＲ２２ （ＧＴ）ｎ
Ｆ：ＡＧＡＴＡＣＣＡＴＡＣＧＡＧＣＧＣＧＡＴ
Ｒ：ＧＧＣＴＡＧＡＡＡＴＧＣＡＡＣＡＧＣＧ
５４
图４　引物ＦＬＬ１对黄绿蜜环菌部分个体扩增
Ｆｉｇ．４　ＤＮＡ　ｂａｎｄｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｒｉｍｅｒ　ＦＬＬ１ｉｎ　Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ
３　讨论
利用正交设计优化黄绿蜜环菌ＳＳＲ反应体系是
一种有效、简便且适用的方法，它能较好较快的识别
ＳＳＲ反应体系中各影响因素，并优化反应条件。在该
试验中，若采用单因素试验需要处理数为４５＝１　０２４
个，而应用正交设计方法只利用了５因素４水平共１６
个处理，较快的找到了最佳反应体系，大大提高了工
作效率。该研究构建的适宜黄绿蜜环菌遗传分析的
ＳＳＲ－ＰＣＲ体系为：１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｅｒ，１００ｎｇ模板ＤＮＡ，
ｄＮＴＰｓ　２１７μｍｏｌ／Ｌ，引物０．５μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶
０．７５Ｕ，Ｍｇ２＋１．３ｍｍｏｌ／Ｌ，加ｄｄＨ２Ｏ至１５μＬ。
ＳＳＲ标记技术是一种多态性和稳定性俱佳的分子
标记技术，在水稻、玉米、棉花等作物的基因图谱绘制、
标记基因、进化研究、分析群体遗传、揭示遗传多样性及
亲缘鉴定等方面已得到广泛应用［２５－２８］。但在真菌中，尤
其在食用真菌中，ＳＳＲ研究起步较晚［２９］。由于ＳＳＲ标
７１１
·生物技术· 北方园艺２０１３（１６）：１１４～１１９
记是基于ＰＣＲ反应的分子标记技术，而ＰＣＲ反应所含
组分较多，各组分均可能对扩增结果的特异性和敏感性
产生影响。用传统方法探讨ＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应体系
时，常采用固定几种因素而变换其中某一因素的方法，
需要进行多次梯度试验，有耗时、耗力、耗材、特异性差
的缺点，且没有兼顾各因素的交互作用。因此，采用正
交设计，利用正交表的均衡分散性和整齐可比性，可有
效地解决理论上需要进行的试验次数与实际可行的试
验次数间的矛盾以及实际所做的有限量试验与要求全
面掌握事物内在规律之间的矛盾［３０］。
该研究表明，采用不同的体系组合，黄绿蜜环菌
ＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果差异明显。Ｍｇ２＋浓度对扩增结果影
响较大，不仅影响Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶的活性，还影响引物
与模板的结合效率产物的特异性，同时又受到ｄＮＴＰｓ
的拮抗作用［３１］，该试验中Ｍｇ２＋终浓度是１．３３ｍｍｏｌ／Ｌ。
引物浓度太高电泳时会产生非特异性条带和引物二聚
体，这二者又可作为ＰＣＲ反应的底物，与靶序列竞争
Ｔａｑ　ＤＮＡ酶和ｄＮＴＰｓ底物，从而使靶序列的产量降
低［３２］。高浓度ｄＮＴＰｓ易产生错误掺入，过高则可能不
扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。ＰＣＲ中常
用终浓度为５０～４００μｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰｓ
［３３］，该试验中
ｄＮＴＰｓ终浓度为２１７μｍｏｌ／Ｌ，符合这一范围。Ｔａｑ　ＤＮＡ
聚合酶浓度过高易产生非特异性产物，且从经济角度考
虑不合理。此外，退火温度也对ＰＣＲ扩增有一定影响，
其随ＳＳＲ引物不同而变化。在具体应用中应根据不同
的引物试验选择其适宜的退火温度。ＰＣＲ试验中，研究
者常采用低于Ｔｍ 值５℃的温度作为实际退火温度，该
试验中引物ＦＬＬ５上游和下游Ｔｍ 值分别为５９．７２和
５７．８℃，因此设置５１～５８℃为试验退火温度梯度，并根
据试验结果选择５３℃为退火温度，此结果与前人经验
一致。
通常微卫星引物构建方法是首先建立ＤＮＡ文库，
用各种简单重复序列作为探针在ＤＮＡ文库中筛选，在
获得阳性克隆子后进行测序，之后根据所测的序列设计
ＳＳＲ引物。这种方法工作量大，资金投入较高，目前只
在少数模式生物中得到大量开发。由于在近缘物种间
微卫星位点左右的侧翼序列是相对保守的，因此可以通
过近缘物种跨种扩增来进行所需物种的微卫星引物筛
选，达到省时省力的效果。该试验依据优化的ＰＣＲ体系
对黄绿蜜环菌同属不同种的３４对微卫星引物筛选后，
从初步筛选的１４对引物中再次筛选获得了８对（占
５７．１％）具有较高多态性的ＳＳＲ引物。这说明蜜环菌属
ＳＳＲ引物适用于黄绿蜜环菌，同时黄绿蜜环菌是参考文
献［１０－１２，２３］中蜜环菌属种的近缘物种，该试验结果也说明
在近缘物种间共用ＳＳＲ引物来进行遗传研究的思路和
方法是切实可行的。
在所筛选出的引物中，参考自 Ｌａｎｇｒｅｌ 等［１０］、
Ｐｒｏｓｐｅｒｏ等［１２］文献中的Ａ．ｏｓｔｏｙａｅ微卫星引物ＦＬＬ１、
ＦＬＬ２、ＦＬＬ１３在黄绿蜜环菌扩增效果良好，多态性较高，
因此，蜜环菌属物种Ａ．Ｏｓｔｏｙａｅ的微卫星引物也可适用
于黄绿蜜环菌，同时说明同为蜜环菌属的Ａ．ｏｓｔｏｙａｅ与
黄绿蜜环菌亲缘关系最近。此外，Ｐｒｏｓｐｅｒｏ等［１１］发现引
物ＦＬＬ５、ＦＬＬ６、ＦＬＬ７在Ａ．ｇａｌｉｃａ、Ａ．ｏｓｔｏｙａｅ、Ａ．ｂｏｒｅａｌｉｓ、
Ａ．ｍｅｌｅａ４个蜜环菌群体中均得到良好扩增，ＦＬＬ４只
在除Ａ．Ｍｅｌｅａ之外的３个群体中得到扩增，而该试验
中ＦＬＬ５、ＦＬＬ６、ＦＬＬ７能对黄绿蜜环菌ＤＮＡ模板产生
各自特有且清晰的微卫星带谱，引物ＦＬＬ４并未得到扩
增，这与Ｐｒｏｓｐｅｒｏ等［１１］研究的结果一致。Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ
等［２３］在Ａ．Ｍｅｌｅａ群体微卫星标记研究中发现，引物
ＦＬＬ８、ＦＬＬ９、ＦＬＬ１０、ＦＬＬ１２在Ａ．Ｍｅｌｅａ群体中扩增效
果好的多态性均较高，但该试验结果发现只有引物
ＦＬＬ１０、ＦＬＬ１２（５０％）是适用于黄绿蜜环菌的微卫星引
物，引物ＦＬＬ８、ＦＬＬ９虽然得到了扩增带，但是带谱非常
弱且难辨认，可能是因为和其它蜜环菌属种相比，Ａ．
Ｍｅｌｅａ与黄绿蜜环菌２个物种间亲缘关系不够近所致。
该试验成功筛选的８对微卫星引物对将来黄绿蜜环菌
遗传多样性研究提供了宝贵的资源，同时证明了微卫星
引物在同属不同物种间的高效通用性。
该试验应用Ｌ１６（４５）正交实验设计筛选并优化了黄
绿蜜环菌ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，通过稳定性检测首次建
立了适合黄绿蜜环菌的ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系并筛选出了
８对具有较高多态性的ＳＳＲ引物。该体系的建立为今
后利用ＳＳＲ标记对黄绿蜜环菌遗传多样性研究、亲缘关
系分析及种质资源鉴定等研究工作奠定基础。今后将
进一步研究黄绿蜜环菌遗传多样性，丰富黄绿蜜环菌基
础研究。
参考文献
［１］　刁治民．青海草地黄绿蜜环菌生态学特性及营养价值的研究［Ｊ］．中
国食用菌，１９９６，１６（４）：２１－２２．
［２］　卯晓岚．中国大型真菌［Ｍ］．郑州：河南科学技术出版社，２０００：１８．
［３］　Ｋｉｌｅ　Ｇ　Ａ，Ｇｕｉｌａｕｍｉｎ　Ｊ　Ｊ，Ｍｏｈａｍｍｅｄ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ
ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａｒｍｉｌａｒｉａ［Ｍ］／／Ｊｏｎｈａｎｓｓｏｎ　Ｍ，Ｓｔｅｎｌｉｄ　Ｊ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｅｉｇｈｔｈ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　ｒｏｏｔ　ａｎｄ　ｂｕｔｔ　ｒｏｔｓ．Ｕｐｐｓａｌａ：Ｓｗｅｄｉｓｈ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９４：４１１－４３６．
［４］　秦国夫，赵俊，郭文辉，等．蜜环菌的生物学研究进展［Ｊ］．东北林业大
学学报，２００４，３２（６）：８９－９４．
［５］　赵俊，赵杰．中国蜜环菌的种类及其在天麻栽培中的应用［Ｊ］．食用
菌学报，２００７，１４（１）：６７－７２．
［６］　Ｋｉｍ　Ｍ　Ｓ，Ｋｌｏｐｆｅｎｓｔｅｉｎ　Ｎ　Ｂ，ＭｃＤｏｎａｌｄ　Ｇ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ
Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｂｙ　ｎｕｃｌｅａｒ　ＤＮＡ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ａｎｄ　ＲＦＬＰ
ａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，２０００，９２（５）：８７４－８８３．
［７］　Ｋｉｍ　Ｍ　Ｓ，Ｋｌｏｐｆｅｎｓｔｅｉｎ　Ｎ　Ｂ，Ｈａｎｎａ　Ｊ　Ｗ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ
Ｎｏｒｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｓｐｅｃｉｅｓ：ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　ＡＦＬＰ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｓｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００６，３６
（３）：１４５－１６４．
８１１
北方园艺２０１３（１６）：１１４～１１９ ·生物技术·
［８］　Ｃｏｅｔｚｅｅ　Ｍ　Ｐ　Ａ，Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ　Ｂ　Ｄ，Ｒｉｄｌｅｙ　Ｇ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ　ｏｆ　Ａｒｍｉｌｌａｒｉａｉｓｏｌａｔｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｓｏｕｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａ　ａｎｄ
Ｉｎｄｏ－Ｍａｌａｙｓｉａ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，２００３，９５：２８５－２９３．
［９］　Ｃｏｅｔｚｅｅ　Ｍ　Ｐ　Ａ，Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ　Ｂ　Ｄ，Ｂｌｏｏｍｅｒ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎ－
ｓｈｉｐｓ　ｏｆ　Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ａｒｍｉｌｌａｒｉａｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｌｏｇｉａ，２００１，
９３：８８７－８９６．
［１０］Ｌａｎｇｒｅｌ　Ｓ　Ｒ　Ｈ，Ｌｕｎｇ－Ｅｓｃａｒｍａｎｔ　Ｂ，Ｄｅｃｒｏｏｃ　Ｓ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ－
ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ　ｌｏｃｉ　ｉｎ　Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｏｓｔｏｙａｅ［Ｊ］．
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　Ｎｏｔｅｓ，２００１（１）：３０５－３０７．
［１１］Ｐｒｏｓｐｅｒｏ　Ｓ，Ｊｕｎｇ　Ｅ，Ｔｓｙｋｕｎ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｉｇｈｔ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｃｅｐｉｓｔｉｐｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ　Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｓｐｅｃｉｅｓ
［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ，２０１０，１２７：１６５－１７０．
［１２］Ｐｒｏｓｐｅｒｏ　Ｓ，Ｌｕｎｇ－Ｅｓｃａｒｍａｎｔ　Ｂ，Ｄｕｔｅｃｈ　Ｃ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａｎ
ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ｆｕｎｇｕｓ（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｏｓｔｏｙａｅ）ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａ
ｍａｎａｇｅｄ　ｐｉｎｅ　ｆｏｒｅｓｔ　ｉｎ　ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｆｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００８
（１７）：３３６６－３３７８．
［１３］孙立夫，裴克全，张艳华，等．法国蜜环菌Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｇａｌｌｉｃａ菌株遗
传多样性的ＩＳＳＲ分析［Ｊ］．菌物学报，２０１１，３０（５）：６８６－６９４．
［１４］王守现，刘宇，张英春，等．蜜环菌菌株遗传多样性ＲＡＰＤ分析［Ｊ］．食
用菌学报，２００９，１６（３）：１５－１９．
［１５］周连玉．黄绿蜜环菌的研究概述［Ｊ］．安徽农学通报，２０１０，１６（３）：
５２－５３．　
［１６］周劲松，熊辉岩，杨春江，等．黄绿蜜环茵子实体挥发油的化学成分
［Ｊ］．农业科学与技术，２００８，９（２）：９０－９２．
［１７］李海波，吴学谦，王立武，等．青藏高原黄绿蜜环菌纯培养菌种的分
离培养及分子鉴定［Ｊ］．菌物学报，２００８，２７（６）：８７３－８８３．
［１８］Ｈａｙｍｅｒ　Ｄ　Ｓ．Ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡｓ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｓ：
ｗｈａｔ　ａｒｅ　ｔｈｅｙ，ａｎｄ　ｃａｎ　ｔｈｅｙ　ｔｅｌ　ｕｓ　ａｎｙｔｈｉｎｇ　ｗｅ　ｄｏｎ’ｔ　ａｌｒｅａｄｙ　ｋｎｏｗ［Ｊ］．
Ｅｎｔｏｍｏｌ　Ｓｏｃ　Ａｍ，１９９４，８７（６）：７１７－７２２．
［１９］Ｃｈｏ　Ｙ　Ｇ，Ｉｓｈｉｌ　Ｔ，Ｔｅｍｎｙｋｈ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ
ｆｒｏｍ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｂａｎｋ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ　Ｌ．）［Ｊ］．
Ｔｈｅｒｏ　Ａｐｐｌｅ　Ｇｅｎｅｔ，２０００，１００：７１３－７２２．
［２０］Ｗｅｂｅｒ　Ｊ　Ｋ，Ｍａｙ　Ｐ　Ｅ．Ａｂｕｎｄａｎｔ　ｃｌａｓｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ
ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｂｅ　ｔｙｐｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｍａｌ
ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｅｓ，１９８９，４４：３８８－３９６．
［２１］黄磊，王义权．扬子鳄种群的微卫星ＤＮＡ多态及其遗传多样性保护
对策分析［Ｊ］．遗传学报，２００４，３１（２）：１４３－１５０．
［２２］Ｌａｎｔｅｒｉ　Ｓ，Ａｃｑｕａｄｒｏ　Ａ，Ｃｏｍｉｎｏ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｆｉｒｓｔ　ｌｉｎｋａｇｅ　ｍａｐ　ｏｆ　ｇｌｏｂｅ
ａｒｔｉｃｈｏｋｅ（Ｃｙｎａｒａ　ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ　ｖａｒ．ｓｃｏｌｙｍｕｓ　Ｌ．）ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＡＦＬＰ，Ｓ－ＳＡＰ，
Ｍ－ＡＦＬＰ　ａｎｄ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ，２００６，１１２：
１５３２－１５４２．　
［２３］Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ　Ｋ，Ｇｒｕｂｉｓｈａ　Ｌ　Ｃ，Ｆｕｊｉｙｏｓｈｉ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｉｔｅ　ｍａｒｋｅｒｓ
ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｉｐｌｏｉｄ　ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ　ｆｕｎｇｕｓ　Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ　ｍｅｌｌｅａ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｃｏｌｏｇｙ
Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，２００９（９）：９４３－９４６．
［２４］孙立夫，张艳华，裴克全．一种高效提取真菌总ＤＮＡ的方法［Ｊ］．菌物
学报，２００９，２８（２）：２９９－３０２．
［２５］席章营，张桂权．ＳＳＲ标记及其在作物遗传育种中的应用［Ｊ］．河南农
业大学学报，２００２，３６（３）：２９３－２９７．
［２６］高文伟，陈全家，曲延英，等．棉花ＤＮＡ提取及优化ＳＳＲ反应体系的
建立和应用［Ｊ］．新疆农业大学学报，２００９，３２（６）：３４－３７．
［２７］吴承来，张倩倩，董炳雪，等．我国部分玉米自交系遗传关系和遗传
结构解析［Ｊ］．作物学报，２０１０，３６（１１）：１８２０－１８３１．
［２８］彭锁堂，王海岗，魏兴华，等．我国三系杂交稻主要不育系的微卫星
标记多样性和遗传结构分析［Ｊ］．中国水稻科学，２００８，２２（４）：３６５－３６９．
［２９］肖扬，李黎，吴茜，等．香菇ＳＳＲ－ＰＣＲ技术体系的优化及其在遗传多
样性分析中的初步应用［Ｊ］．中国农学通报，２００９，２５（２）：２０－２４．
［３０］姜同川．正交实验设计［Ｍ］．济南：山东科学技术出版社，１９８５．
［３１］王士磊，李玉鹏，高树仁．正交设计优化玉米ＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的研
究［Ｊ］．基因组学与应用生物学，２００９，２８（１）：１１９－１２２．
［３２］屈伸，刘志国．分子生物学实验技术［Ｍ］．北京：化学工业出版社，
２００７：８２．
［３３］安建平，王廷璞．生物化学与分子生物学实验教程［Ｍ］．兰州：兰州大
学出版社，２００５：２９１－２９３．
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＳＳＲ－ＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ
Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ
ＬＩ　Ｙｉｎｇ１，ＸＩＥ　Ｚｈａｎ－ｌｉｎｇ１，２，ＴＩＡＮ　Ｆｅｉ　１，ＪＩＡ　Ｘｉａｎ－ｑｉｎｇ１，ＦＡＮＧ　Ｈｕｉ　１，ＸＩＡ　Ｍｉｎｇ－ｚｈｅ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｅｃｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｑｉｎｇｈａｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｉｎｇ，Ｑｉｎｇｈａｉ　８１００１６；２．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｂａｓｅ　ｆｏｒ
Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｔｅａｕ　Ｃｒｏｐ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ，Ｘｉｎｉｎｇ，Ｑｉｎｇｈａｉ　８１００１６）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍＡｒｍｉｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ　ｂｙ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｓ　ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｌ１６（４５）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ
ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｆｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ＳＳＲ－ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　Ｍｇ２＋，ｄＮＴＰｓ，ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｔａｑ　ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｔ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ
Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ，ａｎｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ
ｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ａ　１５μＬ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｅｒ，１００ｎｇ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ，ｄＮＴＰｓ
２１７μｍｏｌ／Ｌ，ｐｒｉｍｅｒ　０．５μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．７５Ｕ，Ｍｇ
２＋１．３ｍｍｏｌ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｉｎ
ｇｏｏｄ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ．Ａｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｔｉｍｅ，８ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ
ａｍｏｎｇ　３４ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ，ｗｈｉｃｈ　ｈａｄ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｂａｎｄｓ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ａｎｄ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｉｎ　Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｒｍｉｌａｒｉａ　ｌｕｔｅｏ－ｖｉｒｅｎｓ；ＳＳＲ－ＰＣＲ；ｓｙｓｔｅｍ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ；ｐｒｉｍｅｒｓ
９１１