全 文 ：第 14卷第 1期
2 0 0 8 年0 3 月
分析测试技术与仪器
ANALYSIS AND TEST ING TECHNOLOGY AND INST RUMENTS
Vo lume 14 Number 1
　 　　　Mar.2008
分析测试新方法(19～ 22)
高效液相色谱法测定竹节参中多种人参皂苷含量
李　露1 , 程　薇1 , 杨　洁2
(1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所 ,湖北 武汉　430064;
2.农业部食品质量监督检验测试中心 , 湖北 武汉　430064)
摘　要:建立了高效液相色谱法(H PLC)测定竹节参中人参皂苷 Rg1 、Re 、Rb1 、Rb2 、Rg2 、 Rd 含量的方法.运用二极
管阵列检测器(DAD)峰纯度和光谱检索功能 ,结合保留时间定性 , 外标峰面积法定量.采用 C18反相柱 , 以乙腈-水
梯度洗脱测定了同一批竹节参总皂苷中人参皂苷 Rg1 、Re 、Rd 的含量分别为 0.81%、0.15%、2.99%, 回收率为
93.46%～ 94.02%, 含量及回收率的 RSD 均小于 5%, 该方法简便 、灵敏 ,精密度及准确度在允许范围内 , 可作为竹
节参皂苷提取物中多种人参皂苷的同时测定方法.
关键词:竹节参;人参皂苷;高效液相色谱法
中图分类号:O657.32 文献标识码:B 文章编号:1006-3757(2008)01-0019-04
　　竹节参(Panax japonicus C.A Mey)为五加科
人参属植物 ,以根状茎和肉质根入药.研究表明 ,其
主要药理活性成分为竹节参皂苷[ 1] ,具有抗炎 、镇
痛 、免疫调节 、抗心肌缺血 、降血糖 、抗衰老等作用.
其应用前景十分广阔.
据文献报道 ,已分离出竹节参皂苷二十余种[ 2] ,
分别为齐墩果烷型 、达玛烷型 、奥寇梯木醇型及甾醇
型等.其中达玛烷型皂苷结构式见图 1和表 1.
图 1　达玛烷型皂苷的结构式
Fig.1　Chemical
structure of ginsenosides with dammarane type
目前 ,竹节参总皂苷的提取分离技术尚无统一
的标准 ,不同产地竹节参有效成分可能不尽相同 ,因
此确定合理 、可行的产品质量控制标准十分重要.
国内外人参皂苷的测定方法主要有比色法 、薄
层光密度法[ 3] 、高效液相色谱法(HPLC)[ 4 ～ 8] 、液质
联用法[ 9] 等.比色法仅能测定总皂苷 ,薄层光密度法
分离效率及重现法均低于 HPLC法 ,液质联用法灵
敏度高 ,结果准确可靠 ,能有效地对多种人参皂苷进
行检测和结构分析 ,但仪器价格昂贵 ,不易推广.经
综合比较 , HPLC 法在众多检测方法中是最佳的 ,但
大多数只限于测定水解后的苷元 ,即齐墩果酸 、人参
二醇和人参三醇 ,不能全面表征竹节参所含的功效
成分及对其品质进行评价[ 4] .陈永波等[ 4] 报导的方
法仅能测定竹节参原料中人参皂苷 Rb1 、Rg1 .本文
所引用的 HPLC 文献 ,流动相中有的添加酸 ,有的
添加盐 ,我们用乙腈-水体系流动相 , 操作上较前
者简便.
本文报导了可同时测定 6种人参皂苷的 HPLC
方法.测定了竹节参总皂苷中人参皂苷 Rg1 、Re 、Rd
的含量 ,运用二级管阵列检测器(DAD)峰纯度检测
及光谱鉴定功能 ,结合保留时间定性 ,能迅速准确地
确定各色谱峰的归属.此方法国内外未见报导.
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
HP1100高效液相色谱仪 ,配置 G1311A 四元
泵 ,G1313A 自动进样器 ,G1315A 二级管阵列检测
器(DAD), HPChem色谱工作站 .人参皂苷标样
收稿日期:2007-11-16;　修订日期:2008-01-25.
作者简介:李露 , 女 ,高级工程师 , 多年来从事保健食品研究及其有效成份检测.
分析测试技术与仪器 第 14 卷
表 1　6 种达玛烷型人参皂苷的结构
Table 1　Chemical structure of ginsenosides with dammarane type
皂苷 R1 R2 R3
人参皂苷 Rb1 -glc(2-1)g lc -H -glc(6-1)glc
人参皂苷 Rb2 -glc(2-1)g lc -H -g lc(6-1)araf
人参皂苷 Rd -glc(2-1)g lc -H -glc
人参皂苷 Re -H -O-glc(2-1)rha -glc
人参皂苷 Rg1 -H -O-g lc -glc
人参皂苷 Rg2 -H -O-glc(2-1)rha -H
　　rha:α-L-r hamnopy ranosyl;g lc:β-D-g lucopy rano sy l;araf:α-L-arabinofurano sy l.
Rg1 、Re 、Rb1 、Rb2 、Rg2 、Rd均由中国药品生物制品检
定所提供.乙腈 、甲醇为色谱纯.样品:竹节参总皂苷
(自制).
1.2　色谱条件
色谱柱:Phenomenex Luna C18柱 5 μm 、 4.6
mm×250 mm ;检测波长:203 nm;
流动相:A 为 H 2O , B为 CH3CN ,室温 ,梯度淋
洗.线性梯度:0 min , A∶B=80%∶20%,保持 20
min;线性变化至 25 min , A∶B=77.5%∶22.5%;
线性变化至 32 min , A ∶B=60%∶40%, ;线性变
化至 40 min , A ∶B=40%∶60%;线性变化至 42
min , A∶B=80%∶20%,保持 8 min.
流速:1 mL/min.
1.3　标准溶液的配制
1.3.1　标准溶液储备液
准确称取 6种人参皂苷标准品各 4 mg左右(准
确至±0.01 mg),分别置于 5 mL 容量瓶中 ,准确加
入 1 mL 甲醇溶解 ,作为标准溶液储备液.Rg1 、Re 、
Rb1 、Rb2 、Rg2 、Rd的浓度分别为4 900.00 、3 860.00 、
1 958.00 、3 880.00 、3 048.00 、3 660.00 ng/μL .
1.3.2　标准溶液使用液
分别取 1.3.1各标准储备液 20μL ,置于同一个
小瓶中 ,加入甲醇 280 μL ,混匀 ,作为标准溶液使用
液.Rg1 、Re 、Rb1 、Rb2 、Rg2 、 Rd 的浓度分别为 245.00 、
193.00 、97.90 、194.00 、152.40 、183.00 ng/μL.
1.4　竹节参总皂苷的提取及分离
取竹节参药材 50 g ,切片 ,加 70%乙醇回流提
取2次 ,每次 2 h ,合并提取液 ,回收乙醇 ,浓缩干燥 ,
得到竹节参提取物.
称取竹节参提取物 1.00 g ,溶于 50 mL 水中 ,
经乙醚萃取除去脂类物质后 ,用水饱和正丁醇提取 ,
提取液蒸干正丁醇 ,得到竹节参总皂苷.
1.5　HPLC 测试样品的制备
准确称取竹节参总皂苷样品约 0.05 g(准确至
±0.01 mg),置 5 mL 容量瓶中加入 60%甲醇适量 ,
超声振荡至样品全部溶解并定容 ,样液用 0.45μm
膜过滤后备用.
2　结果和讨论
2.1　色谱条件的确定
2.1.1　分离柱的选择
在各自相适应的色谱条件下 ,用 1.3.2 项下人
参皂苷混合标样及 1.5项下样液进行分离.
试验的色谱柱有 3根:柱 1 为 CAPCELL PAK
C18 ,5 μm 、4.6 mm×150 mm;
柱 2为 CAPCELL PA K C18 ,5 μm 、4.6 mm ×
250 mm;
柱 3 为 Phenomenex Luna C18柱 , 5 μm 、 4.6
mm×250 mm.
根据实验结果 , 柱 3分离 6种人参皂苷效果最
好 ,因此选择它为本实验分离柱.
2.1.2　检测波长的选择
6种人参皂苷标准混合液经柱 3 分离 , 运用
DAD的等吸收图扫描 ,可以确定人参皂苷在近紫外
区(190 ～ 200 nm)有最大吸收 ,在 193 nm 处吸收大
于 203 nm , 但 193 nm 处流动相造成基线噪音太
大 ,故选用 203 nm 作为检测波长.
2.1.3　流动相的选择
2.1.3.1　等强度淋洗
经试验的流动相有:水 ∶乙腈分别为 75 ∶25
(V/V)、70∶30(V/V);0.05 mol/ L NaH 2PO4 ∶乙
腈为 75∶25(V/V)、72∶28(V/V)、70∶30(V/V),
在以上条件下 ,6 个人参皂苷标样均不能达到基线
分离 ,其中以 Rg1及 Re 的分离最为困难.
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第 1 期 李露 , 等:高效液相色谱法测定竹节参中多种人参皂苷含量
2.1.3.2　梯度淋洗
试验了乙腈 ∶水 ,乙腈 ∶水 ∶THF , 乙腈 ∶
0.05 mo l/L NaH 2PO 4 体系的梯度淋洗 ,经实验如
1.2项下所示梯度表 , 6个标样得到最佳分离(如图
2).由于 Rg1与 Re 性质相近 ,分离十分困难 ,梯度淋
洗到 31 min 才将这对峰分开.
图 2　6 种人参皂苷标准品色谱图
Fig.2　Chromatogram of standard ginsenosides
2.2　标准曲线的制作
在 1.2所述色谱条件下 ,将 1.3.2 所配的标准
溶液使用液依次进样 1 、2 、5 、10 、15和 20 μL ,以各
人参皂苷 ng 数(X)对峰面积 A(Y)作线性回归 ,结
果见表 2.
2.3　样品的测定
按本方法选定的色谱条件 ,对同一批竹节参总
皂苷(自制)进行了含量及加标回收率测定 ,考察了
方法的精密度及准确性.含量测定:样品按 1.5制
备 ,进样量 20 μL , 5次测定结果(n=5)见表 3 ,样品
色谱图见图 3.
加标回收率实验:准确称取竹节参总皂苷样品
5个(n=5),重量均为 20.00 mg(准确至 0.01 mg),
置 5 mL 容量瓶中 ,分别加入 1.3.1 项标准溶液储
备液 Rg1 30 μL , Re 10 μL , Rd 100 μL ,加入 60%
甲醇适量 ,超声振荡至样品全部溶解并定容 ,样
表 2　6 种人参皂苷的线性方程及相关系数
Table 2　The linear equation and correlation coeff ient
人参皂苷 线性方程 相关系数 线性范围/ ng
Rg1 Y=0.2666X+38.974 0.9996 245.00-4900.00
Re Y=6.4481X+6.478 0.9992 193.00-3860.00
Rb1 Y=10.352X+18.708 0.9994 97.90-1958.00
Rb2 Y=3.9678X-60.786 0.9990 194.00-3880.00
Rg2 Y=5.1829X+5.641 0.9994 152.40-3048.00
Rd Y=4.6806x+10.212 0.9993 183.00-7320.00
表 3　样品中人参皂苷测定结果(%)及精密度(n=5)
Table 3　Contents(%)of ginsenosides in sample and accuracy
人参皂苷 1 2 3 4 5 平均值 RSD/ %
Rg1 0.82 0.80 0.83 0.79 0.81 0.81 1.95
Re 0.14 0.15 0.15 0.14 0.15 0.15 4.71
Rd 3.02 2.97 2.94 3.02 3.00 2.99 1.16
图 3　样品色谱图
Fig.3　Chromatogram of sample
液用 0.45 μ膜过滤 ,作 HPLC分析 ,进样量 20 μL ,
结果如表 4.
该法简便快速 ,重复性好 ,结果准确 ,能有效地
对竹节参皂苷提取物中多种人参皂苷进行检测.
2.4　方法的最小检出限
在本方法条件下 ,当性噪比 S/N =3时 , 6种人
参皂苷 Rg1 、Re 、Rb1 、Rb2 、Rg2 、Rd 的最小检出限分别
为 37.9 、38.8 、 17.6 、 22.9 、33.3 、50.2 ng .
2.5　峰纯度分析及光谱鉴定
在竹节参总皂苷中 ,有多种皂苷物质的结构类
似 ,色谱保留行为相近 ,某一皂苷色谱峰里往往混有
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分析测试技术与仪器 第 14 卷
表 4　加标回收率结果(n=5)
Table 4　Rusults of recovery
人参皂苷 本底值/μg 加入量/μg 理论值/μg 平均测定值/μg 平均回收率/ % 回收率 RSD/ %
Rg1 162.00 147.00 309.00 289.40 93.66 4.06
Re 30.00 38.60 68.60 64.60 94.17 3.02
Rd 598.00 366.00 964.00 903.79 93.75 2.40
共流出物.我们运用二极管阵列检测器 ,以标准品光
谱图为参照 ,对样品中人参皂苷 Rg1 、Re 、Rb1 、Rb2 、
Rg2 、Rd进行峰纯度分析及光谱鉴定.该手段能指出
峰的纯度及显示光谱图 ,为摸索最佳色谱分离条件
提供了依据 ,消除了结构相近皂苷对欲测组份准确
定量的干扰.经鉴定我们所测的样品中 Rg1 、Re 、Rd
为纯峰 ,可准确定量;Rb1 、Rb2 、Rg2处峰不纯 ,经多次
改变流动相 ,仍无改进 ,只能待今后选用塔板数更高
的柱子进一步摸索.
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Determination of Ginsenosides in Panax Japonicus
C.A.Mey by HPLC
LI Lu
1 , CHENG Wei1 , YANG Jie2
(1.Hubei Academy of Ag ricultural S ciences Inst itute for Farm Products processing
and Nuclear Ag ricultural Technolog y , Wuhan 430064 ,China;
2.Food Quality Supe rvision Inspection and
Testing Center(Wuhan)o f Chinese Ministry of Ag riculture , Wuhan 430064 , China)
Abstract:A HPLC me thod for determination of ginsenosides including Rg1 、Re 、Rb1 、Rb2 、Rg2 、Rd in panax
japonicus C.A.Mey w as reported.HPLC analy sis w as performed on a C18 rev ersed-phase co lumn(5μm
、4.6 mm ×250 mm)using mobile phase of acetoni trile and w ater mix ture under g radient elut ion.
Ginsenosides Rg1 、Re 、Rd in a bath of chilkusetsusaponin ex t ract w ere tested .T he contents of Rg1 、Re 、Rd
were 0.81% , 0.15%,2.99% respectively and the recove ry w as 93.46%～ 94.02%.Both sides relative
standard deriat ions w ere less than 5%.T his method is simple , sensit ivity , reproducibility and can be used
fo r the determinat ion of g insenosides in panax japonicus C.A.Mey by HPLC.
Key words:pana x japonicus C.A.Mey ;ginsenosides;HPLC
Classi fying number:O657.32
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