全 文 ：doi:10. 7629 /yxdwfz201511034 ·检验技术·
反相高效液相色谱法测定大籽獐牙菜中当药黄素、当药醇苷的含量
马春光，甘瑛琳，马占林
西宁市疾病预防控制中心，青海 810007
摘要:目的 建立反相高效液相色谱法 (Ｒeversed Phrase High Performance Liquid Chromatography，ＲP － HPLC)测定大
籽獐牙菜中当药黄素、当药醇苷两种功效成分含量的方法。方法 样品处理后，采用 Kromasil － C1 8 (250 mm × 4. 6
mm，5 μm.)色谱柱，甲醇和水 (含 0. 04% H3PO4)为流动相，线性梯度洗脱，DAD － HPLC测定。结果 两种功效
成分都达到基线分离，当药黄素、当药醇苷的线性范围分别是 0. 0275 ～ 0. 165 (r = 0. 9 996)、0. 055 ～ 0. 33μg (r = 0. 9
995) ，加标回收率分别为 103. 3%、99. 6%，ＲSD (Ｒelative Standard Deviation)分别为 3. 2%、2. 7%。结论 该方法
测定快速，结果准确、可靠，适用于大籽獐牙菜中当药黄素、当药醇苷含量的测定。
关键词:反相高效液相色谱法;大籽獐牙菜;当药黄素;当药醇苷
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标识码:B 文章编号:1003 － 6245 (2015)11 － 1283 － 03
大籽獐牙菜 (Swertia macrosperma)系龙胆科獐
牙菜属植物［1］，主要产于西藏、贵州、云南等地区，
藏语称“蒂达”，具有清肝利胆、退诸热之功效，用
于黄疸型肝炎、病毒性肝炎以及血病、胃病、缓泻等
疾病的治疗［2 － 3］。现代药理学研究证明，大籽獐牙菜
具有显著的护肝、利胆作用［4 － 6］。当药黄素和当药醇
苷具有利胆清湿热、解毒、强壮、止痛的作用，对四
氯化碳引起的转氨酶升高有降低作用［7 － 8］，是大籽獐
牙菜的功效成分。本文建立了同时测定大籽獐牙菜中
当药黄素和当药醇苷含量的试验方法，为该药材的开
发利用提供依据。
1 材料和方法
1. 1 仪器 Agilent1100 高效液相色谱仪，配置:手
动进样器、在线脱气机、高压二元梯度泵、恒温柱温
箱、DAD检测器，Agilent1100 色谱工作站、Kromasil
－ C18 (250 mm × 4. 6 mm，5 μm)色谱柱;KQ3200
超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。
1. 2 试剂 甲醇:高效液相色谱专用试剂 (山东禹
王实业有限公司禹城化工厂) ;水:娃哈哈纯净水
(杭州娃哈哈集团公司) ;磷酸:AＲ 级 (北京红星化
工厂)。
1. 3 样品及对照品来源 样品购自青海省西宁市八
一路中藏药材市场。当药黄素、当药醇苷自行分离得
到，经归一化法检测纯度在 98%以上。
1. 4 溶液配制
1. 4. 1 对照品溶液的配制 分别取 2. 7 mg 当药黄素
和 2. 2 mg当药醇苷标准对照品，分别置于 10 ml容量
瓶中，以甲醇溶解定容到 10 ml，配制成对照品溶液，
使用时稀释到所需浓度。
1. 4. 2 样品溶液的配制 超声提取:称取大籽獐牙
菜若干，粉碎过 80 目筛，精密称取长梗喉毛花干粉
0. 5 g，加入甲醇 10 ml，超声提取 1 h，过滤后加入
10 ml甲醇，按上法重复两次，合并滤液后用甲醇定
容至 25 ml，备用。
1. 5 色谱条件 Kromasil － C18 (250 mm × 4. 6 mm，
5 μm)色谱柱，流动相甲醇和水 (含 0. 04%
H3PO4) ，20 min 由 40% ～ 63%梯度洗脱，流速 0. 8
ml /min，柱温 30 ℃，检测波长 254 nm。该色谱条件
下当药黄素、当药醇苷都达到基线分离。
2 结 果
2. 1 对照品色谱图和 UV 图 分别取等量的 0. 27
mg /ml当药黄素和 0. 22 mg /ml 当药醇苷标准对照品
溶液混合，稀释 10 倍，取 5 μl 在色谱条件下进样，
得图 1 为混合对照品色谱图，图 2 和图 3 分别为当药
黄素和当药醇苷对照品 UV图。
图 1 混合对照品当药黄素 1 和当药醇苷 2
图 2 当药黄素对照品 UV图
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图 3 当药醇苷对照品 UV图
2. 2 样品色谱图和 UV图
2. 2. 1 超声提取液 分别取 1. 4. 2 项下的样品溶液 5
μl在色谱条件下进样得到色谱图，图 4 为超声提取样
品色谱图，图 5 和图 6 分别为超声提取样品中当药黄
素、当药醇苷 UV图。
图 4 超声提取样品色谱图
图 5 超声提取样品中 1 (当药黄素)UV图
图 6 超声提取样品中 2 (当药醇苷)UV图
2. 2. 2 热回流提取液 图 7 为热回流提取样品色谱
图，图 8 和图 9 分别为热回流提取样品中当药黄素、
当药醇苷 UV图。
2. 2. 3 对照品和样品在热回流提取和超声提取条件
下的保留时间 (见表 1)。
2. 3 检测波长确定 当药黄素和当药醇苷对照品分
别进样后，经 DAD 检测器在 200 ～ 400 nm 扫描其吸
收光谱，在 254 nm 处有较高的吸收。结合文献［5］，
选择该波长为检测波长 254 nm。
图 7 热回流提取样品色谱图
图 8 热回流提取样品中 1 (当药黄素)UV图
图 9 热回流提取样品中 2 (当药醇苷)UV图
表 1 对照品和样品中当药黄素和当药醇苷的色谱保留时间
样品
当药黄素
(min)
当药醇苷
(min)
热回流提取 15. 9 10. 6
超声提取 16. 3 10. 3
对照品 15. 8 10. 5
2. 4 流动相选择 为了防止色谱峰拖尾，在水中加
入 0. 04%磷酸可改善峰形，故选择甲醇和含 0. 04%
磷酸的水作为流动相。
2. 5 线性范围 分别取 0. 27 mg /ml 的当药黄素和
0. 22 mg /ml当药醇苷标准对照品溶液 1 ml，稀释 10
倍，每次分别进样 2. 5 μl、5 μl、7. 5 μl、10. 0 μl、
12. 5 μl、15 μl得到各个峰面积，当药黄素线性关系
(见表 2) ，当药醇苷线性关系 (见表 3)。
当药黄素和当药醇苷标准曲线:
当药黄素:A =3 029. 6X + 16. 6，r = 0. 9 995
当药醇苷:A =5 351. 3x － 46. 116，r = 0. 9 995
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表 2 当药黄素线性关系
进样量 (μg) 0. 0275 0. 0550 0. 0825 0. 1100 0. 1375 0. 1650
峰面积 99. 7 184. 1 261. 2 353. 7 439. 1 511. 4
表 3 当药醇苷线性关系
进样量 (μg) 0. 0550 0. 1100 0. 1650 0. 2750 0. 3300
峰面积 232. 8 563. 5 828. 3 1444. 2 1704. 1
2. 6 检测限
2. 6. 1 当药黄素 在选定的色谱条件下，0. 27 mg /
ml标准溶液逐级稀释，每次进样 5 μl 测得当浓度为
2. 5 × 10 － 4 mg /ml时，信噪比 S /N = 3，故最低检测限
为 0. 27 ng。
2. 6. 2 当药醇苷 在选定的色谱条件下，0. 22 mg /
ml标准溶液逐级稀释，每次进样 5 μl 测得当浓度为
2. 5 × 10 － 4 mg /ml时，信噪比 S /N = 3，故最低检测限
为 0. 44 ng。
2. 7 方法精密度与准确度
2. 7. 1 精密度试验 分别取 0. 027 mg /ml、0. 022
mg /ml的当药黄素和当药醇苷对照品溶液 5 μl 混合，
稀释 10 倍，取其 10 μl 稀释 20 倍，在色谱条件下测
定色谱峰的峰面积，计算得 ＲSD 分别为 0. 73%、
0. 70% (n = 5) ，表明仪器精密性良好。
2. 7. 2 重复性试验 精密称取大籽獐牙菜干粉 0. 5 g
共 5 份，按 1. 4. 2 项下方法操作，在选定色谱条件下
测定当药黄素和当药醇苷的含量，计算得 ＲSD 分别
为 1. 4%、2. 0% (n = 5)。表明方法的重复性良好。
2. 7. 3 稳定性试验 精密称取大籽獐牙菜干粉 0. 5 g
共 5 份，按 1. 4. 2 项下方法操作，在选定色谱条件下
分别在 0、2、4、6、8 h 进样，测定当药黄素和当药
醇苷的峰面积，计算得 ＲSD分别为 1. 4%、1. 8% (n
= 5)。表明样品溶液在 8 h内稳定。
2. 7. 4 回收试验 精密称 3 份已知含量的大籽獐牙
菜样品 0. 05 g，添加对照品适量 (当药黄素 0. 027
mg /ml溶液 0. 8 ml和当药醇苷 0. 022 mg /ml 溶液 0. 7
ml，按 1. 4. 2 项下方法操作，测得当药黄素和当药醇
苷的平均回收率 (n = 3)分别为 103. 3%、99. 6%，
ＲSD分别为 3. 2%、2. 7%。
2. 8 样品测定 取样品溶液在色谱条件下进行分析，
经 DAD检测器检测待测组分的峰纯度且紫外光谱与
对照品一致后，分别获得样品中当药黄素的峰面积为
369. 88 (热回流)和 453. 97 (超声)、当药醇苷为
291. 83 (热回流)和 625. 09 (超声) ，由标准曲线获
得样品中当药黄素和当药醇苷的含量，超声提取结果
优于热回流提取 (见表 4)。
表 4 超声与热回流提取样品测定结果
样品
当药黄素
(μg)
当药醇苷
(μg)
热回流提取 0. 117 0. 063
超声提取 0. 144 0. 125
3 讨 论
反相高效液相色谱法测定大籽獐牙菜中当药黄
素、当药醇苷两种功效成分含量，用二极管阵列检测
器提供光谱扫描图和保留时间对待侧组分进行测定，
该方法不但有较高的灵敏度、准确性，而且操作简
单、稳定性好，适用于大籽獐牙菜中当药黄素、当药
醇苷含量的测定。
参 考 文 献
［1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会 . 中国植物志 ［M］ . 62 卷 .
北京:科学出版社，1988:397.
［2］ 李干鹏，文荣荣，黄飞燕，等 . 西南獐牙菜的化学成分研究 (I)
［J］ . 云南民族大学学报，2011，20 (5) :350 － 352.
［3］ 赵升逵，普杰，陈永对，等 . 大籽獐牙菜的化学成分研究 ［J］ .
中草药，2013，44 (18) :2493 － 2497.
［4］ 刘亚平，刘杰，时京珍，等 . 大籽獐牙菜保肝作用的研究 －对化
学毒物损伤动物的影响 ［J］ . 中药药理与临床，1987，3 (1) :
34 － 36.
［5］ 刘亚平，刘杰，宛蕾 . 大籽獐牙菜保肝作用的药理研究 －对大白
鼠的利胆作用 ［J］ . 中药药理与临床，1987，3 (2) :55 － 57.
［6］ 刘亚平，刘杰 . 大籽獐牙菜保肝作用的药理研究 －对体外培养大
鼠肝细胞的影响 ［J］ . 中药药理与临床，1989，5 (2) :433 －
436.
［7］ 杨雁宾 . 天然产酮类化合物 ［J］ . 云南植物研究，1980，2 (3) :
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［8］ 吉守祥 . ＲP － HPLC法测定湿生萹蕾中当药黄素的含量 ［J］ . 安
徽农业科学，2008，36 (9) :3734，3751.
(收稿日期:2014 － 12 － 16)
更正启事
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