全 文 ：文章编号:1001-4829(2010)05-1595-04
　　收稿日期:2010-06-03
　　基金项目:省财政育种工程青年基金项目(2008QNJJ-017);公益
行业专项(nyhyzx07-008);农业部 948项目 [ 2006-G11(A1-01)]
作者简介:贾定洪(1977-),男 ,硕士 ,助理研究员 ,主要从事食
用菌分子生物学和遗传育种研究 , ＊为通讯作者。
22个毛木耳菌株的 ISSR分析
贾定洪 ,郑林用 ,王　波 ,彭卫红 ,甘炳成 ,黄忠乾＊
(四川省农业科学院土壤肥料研究所 ,四川 成都　610066)
摘　要:采用 ISSR分子标记技术对 22个毛木耳菌株进行分析 ,应用 NTSYSpc2.1生物软件进行遗传聚类 ,构建系统树。试验筛选
出 12个扩增谱带清晰 、多态性好的 ISSR引物 ,共扩增出 80条清晰易辨的多态性谱带。聚类分析结果表明 ,利用 ISSR技术可将 22
个毛木耳菌株材料区分开 ,遗传相似系数变异范围为 0.100 ～ 0.846,遗传差异较大 ,在相似系数为 0.421时, 22个菌株聚为聚为 4
个类群 ,其中在四川广泛栽培的主栽品种黄耳 10号 、琥珀 、781之间存在较大遗传差异。
关键词:毛木耳;NTSYSpc2.1;遗传差异
中图分类号:S646.6　　　文献标识码:A
Analysisof22 AuriculariapolytrichaStrainswithISSRMarkers
JIADing-hong, ZHENGLin-yong, WANGBo, PENGWei-hong, GANBing-cheng, HUANGZhong-qian＊
(SoilandFertilizerInstitute, SichuanAcademyofAgriculturalSciences, SichuanChengdu610066, China)
Abstract:22AuriculariapolytrichastrainswerestudiedusingISSR(Inter-SimpleSequenceRepeat)methodandthedendrogramwasgenera-
tedbyUPGMA(unweightedpairgroupmethodwitharithmeticaverage)methodbasedonthesimilaritycoeficientofISSRpaters.12ISSR
primerswerescreenedfrom 60testedISSRprimersand80distinctandpolymorphicDNAbandsoftestedstrainswereamplified.Clustering
resultsrevealedthat22accessionscouldbedistinguishedusingISSRmethod, andsimilaritycoefficientsrangedfrom0.100to0.846.Alac-
cessionswereclusteredinto4groupsonthesimilarityof0.421, and3majorvarietiesinSichuanprovince, includingHuanger10#, Hupoand
781, hadalargegeneticdistance.
Keywords:Auriculariapolytricha;NTSYSpc2.1;Geneticdiferences
　　毛木耳 (Auriculariapolytricha)又叫黄背木耳 、
大木耳 、粗木耳等 。其耳片厚 、质地较柔软 ,营养丰
富 。食用性平 、味甘 ,药用有滋润强生 、清肺益气 、补
血活血 、镇痛止痛等功效 。四川毛木耳年产量居省
内食用菌生产量的第二位 ,成为农民脱贫致富的一
个重要途径 。但由于部分非专业菌种制作者忽视国
家菌种生产管理条例 ,未严格按照菌种生产要求 ,通
过组织分离 、连续转管等方式粗放生产菌种 ,菌种又
以相互引物等方式逐步扩散 ,导致栽培品种混淆日
益严重 、品种特性不明等问题 ,甚至部分品种出现退
化 、产量下降 、病虫害滋生情况 ,极大地阻碍了毛木
耳产业的健康持续发展[ 1] 。
而 ISSR(inter-simplesequencerepeats)是基于
SSR发展起来的一种新型分子标记技术[ 2] ,它根据
谱带的有无及相对位置 ,来分析不同样品间 ISSR
标记的多态性 ,它可以和 RAPD一样用于各类动植
物的研究 ,但其产物多态性远比 RFLP、SSR、 RAPD
更加丰富 ,可以提供更多的关于基因组的信息 ,而且
比 RAPD技术更加稳定可靠 ,实验重复性更好 [ 3] ,
已广泛应用于胡枝子[ 4] 、玉米[ 5] 、芍药 [ 6] 、珊瑚 [ 7]和
番茄 [ 8]等的研究 。
本研究通过对 ISSR研究 ,明确 22个毛木耳栽
培菌株间的遗传差异 ,揭示其遗传亲缘关系 ,为毛木耳
的品种选育 、资源保护 、遗传学研究等提供参考依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试菌株　试验菌株 22个 ,各菌株信息见
表 1 。
1595
2010年 23卷 5期
Vol.23　　No.5　　　　　　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2010.05.056
表 1　供试菌株及来源
Table1　StrainsusedforISSRanalysis
编号
Accession
No.
品种名称
Strain
来源
Origins
编号
Accession
No.
品种名称
Strain
来源
Origins
1 ZH 四川省资源所 12 川耳 7号 四川省农科院土肥所
2 781 福建三明真菌研究所 13 红大木耳 上海农科院食用菌研究所
3 上海 3号 四川省农科院土肥所 14 Ap1142 四川省农科院土肥所
4 951 四川省农科院土肥所 15 Ap1192 四川省农科院土肥所
5 243 福建轻工所 16 3039 台湾裕农
6 青优 四川省农科院土肥所 17 Ap117 四川省农科院土肥所
7 三优 四川省农科院土肥所 18 Apw82 四川省农科院土肥所
8 紫木耳 四川省农科院土肥所 19 抗 1 四川省农科院土肥所
9 琥珀 四川省农科院土肥所 20 菊耳 2号 四川省农科院土肥所
10 Au2 广东微生物研究所 21 上海 1号 上海农科院食用菌研究所
11 苏毛 3 江苏农科院蔬菜所 22 黄耳 10号 四川省农科院土肥所
1.1.2　培养基　斜面培养基:蔗糖 20 g,麸皮 15 g,
蛋白胨 2g,酵母粉 2g, KH2PO4 1 g, MgSO4 0.5g,琼
脂 21g,水 1000mL;液体培养基:蔗糖 20g,麸皮 15
g,蛋白胨 2 g,酵母粉 2g, KH2PO4 1g, MgSO4 0.5 g,
水 1000mL。
1.1.3　试剂　本试验所用 TaqDNA聚合酶 、dNTPs
购自立陶宛的 MBIFermentas公司 , ISSR引物由上
海生工生物工程技术服务有限公司合成。其它试剂
购自成都市长征化学试剂公司 。
1.2　方法
1.2.1　菌丝体制备　供试菌株菌种转接在斜面培
养基上 , 25 ℃培养 ,菌丝长满斜面后转接于液体培
养基中 , 26 ℃培养 10 d。收集菌丝 ,无菌水洗涤 2
次后 ,用无菌滤纸汲干菌丝体表面的水分 ,于 -20
℃保存备用。
1.2.2　DNA的提取 　菌丝体 DNA的提取采用
CTAB法 ,具体方法见文献 [ 9] 。
1.2.3　PCR反应及电泳 　PCR反应在美国 BIO-
RADMyCycler型 PCR仪上进行 ,反应体系为:Taq
酶 1 U, 2 μl10×Bufer(200 mmol/LTris-HCl;100
mmol/L(NH4 )2SO4;200 mmol/LKCl;15 mmol/L
MgCl2),模板 DNA40 ng, dNTPs0.2 mmol/L,引物
0.2 μmol/L,加水补齐至 20 μl。扩增程序为 94 ℃
充分变性 5 min,然后进行 35个循环:94 ℃变性 30
s, 51 ～ 73 ℃(根据引物而定)退火 45 s, 72 ℃延伸
1.5min, 最后 7 2℃延伸 7min。4℃终止反应 。
表 2　ISSR引物序列
Table2　SequencesofISSRprimers
引物编号
Primercode
核苷酸序列
Nucleotidesequence
条带数
Bandnumber
UBC807 5 AGA GAG AGA GAG AGA GT 3 11
UBC808 5 AGA GAG AGA GAG AGA GC 3 10
UBC809 5 AGA GAG AGA GAG AGA GG 3 6
UBC810 5 GAG AGA GAG AGA GAG AT 3 8
UBC815 5 CTC TCT CTC TCT CTC TG 3 5
UBC817 5 CAC ACA CAC ACA CAC AA 3 4
UBC818 5 CAC ACA CAC ACA CAC AG 3 6
UBC823 5 TCT CTC TCT CTC TCT CC 3 6
UBC829 5 TGT GTG TGT GTG TGT GC 3 7
UBC830 5 TGT GTG TGT GTG TGT GG 3 6
UBC862 5 AGC AGC AGC AGC AGC AGC 3 5
UBC873 5 GAC AGA CAG ACA GAC A 3 6
1596 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
PCR产物在 1.5 %琼脂糖凝胶上电泳分离 , Gold-
view染色 [ 10] ,用美国 BIO-RADUNIVERSALHOOD
Ⅱ型凝胶成像系统照相。
1.2.4　数据分析　将 ISSR图谱以 TIFF文件格式
保存 ,有 ISSR谱带计为 1,无 ISSR谱带计为 0,构建
初始数据矩阵 ,用 NTSYSpc2.1专业版软件计算遗
传相似系数(Nei＆Li系数),公式为:Cij=2a/(2a
+b+c)(其中 a是菌株 i和菌株 j的公有条带数 , b
是仅出现在菌株 i的谱带数 ,而 c是仅出现在菌株 j
的谱带数)[ 11] ,以平均连锁法(UPGMA)进行聚类分
析 ,得出聚类图谱 。
2　结果与分析
2.1　毛木耳菌株的 ISSR指纹图谱
实验对 60条 ISSR引物进行了筛选 ,其中有 12
条引物能扩增出清晰且具多态性的带谱 ,共计扩增
出 80条清晰易辨的多态性 DNA条带 ,每个引物扩
增 4 ～ 11条谱带 (表 2), DNA带的大小为 120 ～
2000bp。其中 , 使用引物 UBC818扩增供试菌株
DNA的 ISSR指纹图谱见图 1。
2.2　毛木耳菌株的亲缘关系分析
通过 Nei＆ Li系数计算得到遗传相似系数矩
阵 ,结果显示 22个毛木耳菌株的遗传相似系数变异
范围为 0.100 ～ 0.846 ,遗传差异幅度较大 ,遗传背
景丰富 。
采用 UPGMA法对 22个毛木耳菌株的遗传相
M.DL2000;1～ 22泳道.1～ 22号菌株
M.DL2000;1-22.StrainsNo.1-22
图 1　使用 UBC818引物扩增供试菌株 DNA的 ISSR指
纹图谱
Fig.1　ISSRfingerprintingprofileofAuriculariapolytrichastrainsam-
plifiedwithprimerUBC818
似系数进行聚类分析 ,构建出 22个木耳属菌株的遗
传亲缘关系图谱 。从 ISSR聚类图(图 2)可以看出
22个供试菌株在相似系数为 0.330时聚在一起 ,相
似系数为 0.421时聚为 4个类群。 ZH、3039、川耳 7
号 、黄耳 10号聚为类群 Ⅰ ;781、紫木耳 、青优 、菊耳
2号 、三优 、Apw82、琥珀 、Ap1142、Ap1192、Ap117、
Au2和上海 1号共 12个毛木耳菌株聚为类群 Ⅱ;苏
毛 3和红大木耳聚为类群 Ⅲ;而上海 3号 、951、243
和抗 1聚为类群Ⅳ。其中 ,青优和菊耳 2号亲缘关
系最近 ,遗传相似系数达到 0.846。
3　小结与讨论
黄耳 10号 、琥珀 、781为四川重要的毛木耳主
栽品种 ,在 ISSR分析中 ,黄耳 10号聚在类群 Ⅰ ,琥
珀 、781分属于类群Ⅱ中的两个亚群 ,两个菌株间的
遗传距离相对较近 ,具有 0.558的遗传相似系数 ,而
黄耳 10号与琥珀 、781分别具有 0.549和 0.364的
遗传相似系数 ,遗传距离较大。但总体上 , 3个菌株
间存在着较大的遗传距离 ,可以搭配栽培以扩大栽
培菌株间的遗传背景 ,利于改良栽培品种结构 ,提高
毛木耳栽培品种对环境 、病虫害等因素的适应性 。
研究在对黄耳 10号 、琥珀 、781 3个栽培菌株进
行 ISSR分析中 ,还对其作了 PDA菌丝生长速度表
型测试 ,在 25 ℃培养时 , 781、琥珀 、黄耳 10号的生
长速度大小关系为:781>琥珀 >黄耳 10号 ,分别为
1.114、0.888、0.477 cm/d, 3个菌株生长速度差异
达到极显著差异水平 ,但在 35℃培养时 , 781、琥珀 、
黄耳 10号的生长速度大小关系为:琥珀 >781>黄
耳 10号 ,分别为 4.72、3.92、1.30cm/d,生长速度存
在显著差异 ,而 781与黄耳 10号生长速度差异甚至
达到极显著差异水平。菌丝生长速度试验结果显示
琥珀比黄耳 10号更适合高温环境 ,更能够快速生长
占据菌袋空间 ,利于毛木耳病害防止 。尽管黄耳 10
号菌丝生长速度较慢 ,但因其良好的商品性状 ,同样
受到毛木耳栽培者的青睐 。而从试验结果分析 ,黄
耳 10号的生长速度指标还存在较大的育种改良空
图 2　22个毛木耳属菌株的 ISSR聚类图谱
Fig.2　DendrogramresultingfromUPGMAclusteranalysisbasedonthe
similaritycoeficientofISSRpaterns
15975期 　　　　　　贾定洪等:22个毛木耳菌株的 ISSR分析
间 。试验将 3个四川毛木耳主栽菌株菌丝生长速度
表型数据作为 ISSR分析的有益补充 ,获得了 3个菌
株间较为完整的遗传及表型信息 ,基本掌握了菌株
特征数据 ,对于进一步遗传育种工作具有较好的指
导意义 。
Ap1142、Ap1192、Ap117菌株为野生分离菌株 ,
在 ISSR聚类中聚为类群Ⅱ中的一个亚群 , 3个菌株
间的遗传相似系数为 0.707,遗传差异较小。但因
其采自野生环境 ,具有特有的环境适应性 、抗逆性等
优良特性 ,能够作为优良亲本菌株在育种中得到较
好应用 。
在 ISSR分析试验中 , 22个毛木耳菌株被细致
区分 ,并聚为相对独立的 4个类群。试验结果清晰 、
详实地反映出 22个受试菌株遗传差异 ,显示出 IS-
SR技术是进行毛木耳菌株遗传分析及科学鉴定的
有力工具。
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(责任编辑　陈　虹)
1598 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷