全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2015)02 － 0723 － 05 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2015． 02． 050
收稿日期:2014 － 05 － 10
基金项目:国家现代食用菌产业技术体系毛木耳和药用菌栽培
岗位专项资金(cars24);四川食用菌产业技术体系创新团队栽
培岗位专项资金
作者简介:吴 翔(1980 －)，女，羌族，助理研究员，博士研究
生，E-mail:qingshui028@ 126． com，* 为通讯作者，E-mail:huang-
zhongqian29@ 126． com。
毛木耳发菌棚内外空气真菌的检测
吴 翔，黄忠乾* ，苗人云，郑林用，周 洁，甘炳成，彭卫红，谢丽源，谭 伟，唐利民
(四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066)
摘 要:为了解毛木耳发菌棚中空气真菌与温度和湿度的关系以及发菌棚内主要的真菌种类，在四川省毛木耳主栽区的接种季
节，对毛木耳发菌棚内外空气中 24 h的真菌数量和主要种类进行检测，并运用 SPSS软件分析了真菌数量与棚内外空气温度和湿
度的关系，结合形态特征和 rDNA ITS区序列的综合分析，对发菌棚内分离所得主要真菌进行鉴定。结果表明，凌晨 1:00 到 5:00
时间段中空气真菌数量较小，棚内外空气真菌数量呈显著正相关，但与棚内外空气温度和湿度都不呈显著相关性，检测时间内空
气中的真菌种类有曲霉属、木霉属、蓝状菌属、链格孢属。本试验显示，凌晨 1:00 到 5:00 适宜于毛木耳菌袋接种工作，毛木耳发菌
棚中真菌曲霉属的菌株较多。
关键词:毛木耳;发菌棚;真菌
中图分类号:S567． 3 文献标识码:A
Detection of Airy Fungi in and out of Auricularia polytricha’s Culture Ｒoom
WU Xiang，HUANG Zhong-qian* ，MIAO Ｒen-yun，ZHENG Lin-yong，ZHOU Jie，
GAN Bing-cheng，PENG Wei-hong，XIE Li-yuan，TAN Wei，TANG Li-min
(Soil and Fertilizer Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China)
Abstract:In order to detect the relationship of the contents of fungi in air with temperature and humidity and the species of main fungi in and
out of Auricularia polytricha’s culture room，in the main Auricularia polytricha plantation of Sichuan province，the contents of fungi in air in-
side and outside culture room were detected in 24 hours after inoculation，where the fungi contents in air with temperature and humidity were
correlatively analyzed by SPSS software，meanwhile based on the morphological and phylogenetic analysis of rDNA ITS，the species of main
fungi were identificated． The result showed that the fungi content was minimum from 1:00 to 5:00． Both the temperature and humidity were
not the main factors affecting the fungi contents，and the content of fungi inside culture room was significantly positively correlated with the
content of fungus outside culture room，and the result of identification indicated that those fungus belonged to Aspergillus，Trichoderma，Ta-
laromyces，Talaromyces and Alternaria． It was concluded that the best time for Auricularia polytricha plantation was from 1:00 to 5:00，and
most of fungus in culture room was Aspergillus．
Key words:Auricularia polytricha;Culture room;Fungi
毛木耳(Auricularia polytricha)是黄背木耳和白
背木耳等的总称，是我国主要栽培和重要出口的食
用菌种类。毛木耳粗纤维含量较高，这些纤维素对
人体内许多营养物质的消化、吸收和代谢有很好的
促进作用［1 ～ 2］。四川是毛木耳的主要栽培区之一，
栽培毛木耳是菇农脱贫致富的主要途径之一［3 ～ 4］。
本实验开展的地点位于四川省什邡市西北部的湔氐
镇，海拔 550 m，是国家级毛木耳生产基地。近年
来，湔氐镇毛木耳年栽培量都超过 1． 0 × 108 袋，
2013 年栽培量约为 1． 2 × 108 袋，带来的经济收入占
当地农户年收入的 80 %，由此可知，毛木耳产业对
当地经济发展起着举足轻重的作用。然而，据统计，
每季毛木耳因为杂菌污染可导致 7 %的栽培袋受到
污染，其中因为真菌引起的污染占 6． 8 %，给毛木耳
栽培产业造成严重的经济损失。发菌棚是毛木耳接
种的主要场地，也是引起毛木耳菌袋污染的主要场
所，而空气中真菌的数量直接影响着毛木耳被污染
的几率。如何根据空气中真菌量的多少选择最佳的
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2015 年 28 卷 2 期
Vol. 28 No. 2
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
接种时间以减少毛木耳的污染率，是急需解决的实
际问题。因此，本实验以四川毛木耳主栽区什邡市
湔氐镇为试验点，通过检测接种季节发菌棚内外空
气微生物数量和主要种类，以期为减少毛木耳菌袋
受真菌污染的方法提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
采样时间:2012 年 1 月，采样时间正值当地毛
木耳接种季节，从凌晨 1:00 开始，每隔 4 h 采样 1
次，到傍晚 21:00 结束。采样过程中用自动温湿度
记录仪记录环境的温度和湿度;布点方法:布点的设
置参考《室内空气质量标准》(GB /T18883-2002)的
要求进行［5］。发菌棚长 30 m，宽 12 m，棚内面积
360 m2，设 4 角及中央 5 个点，即图 1 中 A、B、C、D、
E，其中 4 个角点均离墙 1 m。发菌棚外围设 8 个
点，图 1 中 J、K、L、M 4 个点距离发菌棚边缘距离均
为 5 m，所有采样点距地面高度均为 1． 2 m。
培养基［6］:真菌培养基:马铃薯(去皮)200． 0
g，蔗糖 20 g，蒸馏水 1000 mL，pH自然，将马铃薯去
皮，切成小块，于锅中加水1000 mL煮沸30 min，用双层
纱布过滤，取其滤液加糖，并加水补足 1000 mL。
1． 2 试验方法
采样方法:采用自然沉降法采集样品。各点设
3 次重复，同时设置空白对照(同采样皿一起放入采
样点，不开皿盖)。用直径 9 cm 普通营养琼脂平板
在采样点打开，准确暴露空气中 5 min 加盖后立即
送实验室培养箱 25 ℃培养 48 h。采样同时测定采
样时间棚内外空气温度和湿度。
菌落数计数方法及相关性分析［5，7］:奥梅梁斯
基公式进行计算。
图 1 发菌棚内外采样点布置图
Fig． 1 Layout diagram of sampling point in and out of culture room
真菌总数(cfu /m3):C = 5000 N /(A × T) ，其中，
C为每立方米空气中真菌数(cfu /m3)，A 为平皿面
积(cm2)，T 为平板暴露时间(min)，N 为平均菌落
数(cfu)。
用 SPSS17． 0 软件分析真菌数量与温度以及湿
度的相关性。
1． 3 菌株鉴定
1． 3． 1 菌株鉴定 将分离纯化得到的棚内主要真
菌菌株 F1 ～ F6 进行鉴定，形态特征鉴定方法参考
真菌鉴定手册［8］进行。
1． 3． 2 DNA的提取以及 rDNA ITS 区序列扩增、测
序及系统发育树的构建 菌株的 DNA 通过上海生
物工程有限公司基因组 DNA 快速抽提试剂盒(真
菌)提取。ITS 序列采用通用引物 ITS4(5-TCCTC-
CGCTTATTGATATGC-3)和 ITS5 (5-GGAAGTA-
AAAGTCGTAACAAGG-3)进行扩增。PCＲ 扩增采
用 25 μl 反应体系［9］。本扩增反应试剂均来自
TaKaＲa公司。DNA 模板 0． 5 μl，2． 5 μl 10 × PCＲ
缓冲液(含MgCl2)，2． 5 μl dNTP(2． 0 mmol /L) ，1． 0
μl引物(20 μmol /L)，0． 5 μl Taq 聚合酶(5 U /μl)，
最后加 ddH2O 补充至总体积为 25 μl，然后进行
PCＲ扩增。ITS 扩增在 BIO-ＲAD My Cycler 型 PCＲ
仪上进行，扩增程序为:94 ℃预变性 2． 5 min，94 ℃
变性 30 s，60 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 30 s，共 5 个循
环，每个循环退火温度降 0． 8 ℃;第二组循环开始，
94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 30 s，共
30 个循环;最后一个循环结束后，72 ℃延伸 5 min。
应用MEGA4． 0软件，将测序获得的真菌菌株 ITS
基因序列进行多序列完全比对，去掉两端差异序列后，
根据 Kimura-2法计算各类群间的核苷酸差异值，运行
1000 次 bootstrap构建获得系统发育树状图。
2 结果与分析
2． 1 温度、湿度检测
根据自动温湿度记录仪采集的温度湿度情况如
表 1。从表 1 中可以看出，不同时间发菌棚内的温
度均高于对应时间棚外的温度，湿度则低于棚外或
与棚外相差不大。
2． 2 室内外真菌数量检测结果及相关性分析
从图 2 可以看出，除了午后 13:00 这个采样时
间室外的真菌数量高于室内，其它采样时间都低于
或和室内真菌数量差别不大。证明发菌棚的局部空
间不仅对隔离室外真菌进入棚内没有作用，反而不
利于室内真菌对外的扩散，增加棚内真菌数量，提高
了毛木耳菌袋的污染机率。空白对照无菌落检出。
从表 2 可以看出，室内外空气真菌数量与温度
427 西 南 农 业 学 报 28 卷
表 1 测试时间段内环境温度和湿度
Table 1 The environmental temperature and humidity of testing period
测定时间
Time
温度(℃)
Temperature
湿度(%)
Humidity
棚内 棚外 棚内 棚外
1:00 12． 5 6． 7 77． 5 84． 4
5:00 8． 9 3． 3 81． 3 96． 6
9:00 6． 4 4． 4 81． 3 93． 4
13:00 14． 3 3． 0 45． 0 49． 3
17:00 13． 1 7． 8 73． 4 72． 5
21:00 12． 1 6． 6 75． 8 78． 8
以及湿度的相关性都不呈显著相关，棚内外真菌数
量呈显著正相关，棚内真菌数量与棚内的温度和湿
度都呈负相关。
2． 3 鉴定结果
各菌株在 PDA培养基上 25 ℃培养 5 d 后的形
态如图 3(a)所示，显微形态如图 3(b)所示。F1 生
长较快，质地絮状，颜色呈带灰的橄榄色，具有较轻
的霉味;菌落反面淡黄色。分生孢子头球形，150 ～
350 μm或更长。菌株 F2 生长快，质地疏松，呈黄
色，后变为褐色至淡绿褐色，背面无色。分生孢子头
放射状，直径 150 ～ 300 μm，也有少数为疏松柱状。
菌株 F3 分生孢子呈淡肉色，分生孢子梗光滑无色;
顶囊半球形，顶部之半至 2 /3 处密生小梗，分生孢子
小而光滑，球形或椭圆形。菌株 F4 菌落正面鹅黄
色，背面黄色，菌落表面平滑、致密，有同心环，质地
粉粒状，菌落扁平，生长较在察氏培养基上生长快，
短绒毛状，表面形成一层黄色颗粒状子囊果。菌株
F5 呈黑色，孢子呈发射状分散，背面无色，生长速度
40
35
30
25
20
15
10
5
0
真
菌
数
量
（ c
fu
/m
3 ）
Co
nt
en
ts
of
fu
ng
i
1:00 5:00 9:00 13:00 17:00 21:00
采样时间
Time
室内
室外
图 2 不同时间段室内外检测的真菌含量
Fig． 2 The contents of fungi indoor and outdoor testing in different
time periods
快，分生孢子梗长，分生孢子聚生成头状。菌株 F6
在 PDA培养基上生长很快，呈墨绿色的绒状，菌丝
灰色至黑色，分生孢子链状或单生，淡褐色至深褐
色，形状不一大，典型的为卵圆形或倒棍棒形。
菌株 F1 rDNA的 ITS 序列长度为 623 bp，与烟
曲霉原变种 Aspergillus fumigatus(HQ026746)相似性
为 100 %;菌株 F2 rDNA的 ITS序列长度为 612 bp，
与米曲霉 Aspergillus oryzae(FJ859878)相似性 99
%;菌株 F3 rDNA 的 ITS 序列长度为 1755 bp 与土
曲霉 Aspergillus terreus(FJ878635)相似性 99 %;菌
株 F4 rDNA 的 ITS 序列长度为 600 bp 与黄蓝状菌
Talaromyces flavus (EU273527)相似性 99 %;菌株
F5 rDNA的 ITS序列长度为 578 bp 与哈茨木霉 Tri-
choderma harzianum(HQ259312)相似性 100 %;F6
rDNA的 ITS序列长度为 598 bp 与链格孢 Alternaria
alternate (GU797144)相似性 99 %。结合各菌株的
形态特征等信息，鉴定菌株 F1 为烟曲霉变种，初步
命名为 A． fumigatus F1，鉴定菌株 F2 为米曲霉，初
表 2 空气中真菌数量与温度和湿度的相关性
Table 2 Correlation analysis of bacterium and fungi contents in air with temperature and humidity
棚内真菌 棚外真菌 棚内温度 棚内湿度 棚外温度 棚外湿度
棚内真菌 相关性 1 0． 837* － 0． 018 － 0． 202 0． 063 － 0． 112
显著性 0． 019 0． 486 0． 350 0． 453 0． 417
棚外真菌 相关性 0． 837* 1 0． 341 － 0． 549 0． 232 － 0． 467
显著性 0． 019 0． 254 0． 130 0． 329 0． 175
棚内温度 相关性 － 0． 018 0． 341 1 － 0． 962＊＊ 0． 842* － 0． 973＊＊
显著性 0． 486 0． 254 0． 001 0． 018 0． 001
棚内湿度 相关性 － 0． 202 － 0． 549 － 0． 962＊＊ 1 － 0． 741* 0． 961＊＊
显著性 0． 350 0． 130 0． 001 0． 046 0． 001
棚外温度 相关性 0． 063 0． 232 0． 842* － 0． 741* 1 － 0． 854*
显著性 0． 453 0． 329 0． 018 0． 046 0． 015
棚外湿度 相关性 － 0． 112 － 0． 467 － 0． 973＊＊ 0． 961＊＊ － 0． 854* 1
显著性 0． 417 0． 175 0． 001 0． 001 0． 015
注:* 在 0． 05 水平(双侧)上显著相关;＊＊在 0． 01 水平(双侧)上显著相关。
Note:* represents significant correlation at 0． 05 level (double sides);＊＊ represent significant correlation at 0． 01 level (double sides)．
5272 期 吴 翔等:毛木耳发菌棚内外空气真菌的检测
(a)菌株在 PDA 培养基的菌落形态 (b)菌株在显微镜下的形态
图 3 各菌株的菌落形态以及显微形态
Fig． 3 The colonial morphology and optical micrograph of strains F1 － F6
Aspergillus flavus(HQ340108)
Aspergillus oryzae(FJ859878)
Aspergillus parvisclerotigenus(KC964101)
Aspergillus flavus(HQ340109)
Aspergillus minisclerotigenes(JX292091)
F2
Aspergillus terreus(KC119206)
Aspergillus terreus(JX290029)
Aspergillus terreus(FJ878635)
F3
Aspergillus felis(KF558318)
Neosartorya fischeri(HQ607997)
Aspergillus fumigatus(JF729022)
F1
Aspergillus fumigatus(HQ026749)
Fungal endophyte(GQ120978)
Talaromyces tipitatus(JX122729)
F4
Talaromyces purpurogenus(JX965230)
Penicillium janthinellum(JN166803)
Talaromyces purpurogenus(JX965231)
Alternaria alternate(GU797144)
Alternaria alternate(GQ121322)
F6
Alternaia sp.G5A(EF432274)
Alternaria tenuissima(EU326185)
Trichoderma harzianum(HQ259312)
Trichoderma aureoviride(JQ040330)
Trichoderma harzianum(HQ259307)
Hypocrea fomitopsis(HQ259307)
F5
Hypocrea fomitopsis(JF905628)
图 4 基于 ITS序列及相关菌株构建的系统发育树
Fig． 4 The phylogenetic tree based on ITS sequences of strains F1 － F6 with other related strains，constructed by neighbor-joining method
步命名为 A． oryzae F2，鉴定菌株 F3 为土曲霉，初步
命名为 A． terreus F3，鉴定菌株 F4 为黄蓝状菌，初步
命名为 T． flavus F4，鉴定菌株 F5 为哈茨木霉，初步
命名为 T． harzianum F5，结鉴定菌株 F6 为链格孢，
初步命名为 A． alternate F6。
3 小 结
测定分析结果表明凌晨 1:00 到 5:00 时间段中
空气真菌数量较小，在不同的时间段，棚内和棚外的
真菌数量呈不规则变化，但相互之间显著相关，棚内
真菌数量与棚内的温度和湿度都呈负相关。
根据各真菌菌株的形态特征和 ITS 序列分析，
得知菌株 F1 ～ F6 分别为烟曲霉变种、米曲霉、土曲
霉、黄蓝状菌、哈茨木霉和链格孢。从而得知所检测
的发菌棚的棚内真菌种类分别属于曲霉属、木霉属、
蓝状菌属 、链格孢属，其中属于曲霉属的种类居多。
627 西 南 农 业 学 报 28 卷
空气中优势真菌有枝孢属(Cladosporium)、链格孢属
(Alternaria)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergil-
lus)和无孢菌等［10］，本次试验获得的发菌棚内的优
势真菌与一般空气中的优势真菌大致相同。其中检
测出了容易导致食用菌菌袋污染的真菌种类［11］，如
曲霉属、木霉属和链格孢属，结合各菌株在 24 h 内
数量的变化，在数量最低的时间段内接种，对减少毛
木耳菌袋污染具有较有价值的理论依据意义。
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(责任编辑 陈 虹)
7272 期 吴 翔等:毛木耳发菌棚内外空气真菌的检测