全 文 ：收稿日期:2004-10-19原稿;2004-11-29修改稿
基金项目:上海市农业科学院发展基金项目“羊肚菌双歧杆菌混菌发酵技术的研究”的部分内容
作者简介:邢增涛(1971-),男 , 2001年毕业于南京农业大学食品科技学院 ,博士 ,助研 ,主要从事食用菌生理生化和食
用菌产品质量检测方面的研究 ,发表主笔论文 4篇。
　食用菌学报　2004.11(4):38 ～ 43
　Acta Edulis Fungi
文章编号:1005-9873(2004)04-0038-06
尖顶羊肚菌液体培养条件的研究
邢增涛1 , 孙芳芳2 , 刘景圣3
(1 农业部食用菌产品质量监督检验测试中心(上海);农业部食用菌遗传育种重点开发实验室;
上海市农业遗传育种重点实验室;上海市农业科学院食用菌研究所 ,上海 201106;
2南京农业大学资环学院 ,南京 210095;3吉林农业大学食品科技学院 , 长春 130118)
摘　要:尖顶羊肚菌液体静止培养的优化培养基为:蔗糖 4%, 胰蛋白胨 0.4%, 酵母粉
0.15%, 天门冬酰胺 0.08%, MgSO4·7H2O 0.5g/ L , KH2PO4 1.45g/ L , Na2HPO4·2H2O 0.48g/ L ,
VB1 25mg/ L , CaCl2 0.013g/ L , 微量元素溶液 1.0mL/ L。 培养基初始 pH 7.0 , 装量 50mL/250mL ,
接种量 2%, 培养温度 26℃。培养 10d 菌丝体生物量可达 12.64g/ L。
关键词:尖顶羊肚菌;液体静止培养;生物量;正交实验
中图分类号:S646.703.6　　　　文献标识码:A
羊肚菌属 (Morchel la)隶属子囊菌纲(Ascomycetes), 盘菌目(Pezizales), 羊肚菌科
(Morchellaceae)[ 1] 。世界上已经发表的羊肚菌属有 33个种(包括亚种和变种),分布于亚洲 、
欧洲 、北美洲及大洋洲等地区 。据报道 ,我国目前已经发现的羊肚菌有 11个种 ,分布在我国西
北 、西南 、华中 、华南和华东等地。据《本草纲目》记载 ,羊肚菌具有“甘寒无毒 ,益肠胃 ,化痰理
气”的特性和功效。现代研究也表明 ,羊肚菌不仅具有一定的食用价值 ,还具有抗疲劳 、免疫调
节等功效[ 2～ 4] 。尽管目前国内外都有羊肚菌栽培成功的报道 ,但依然没有实现羊肚菌的商业
化人工栽培 。国内不少研究人员利用野生羊肚菌或羊肚菌菌丝体研制和开发了羊肚菌腐乳 、
羊肚菌保健胶囊 、羊肚菌饮料和羊肚菌杏食品等食品或保健食品[ 5 ～ 8] ,受到了人们普遍欢迎 。
为了更好地开发和利用这一优质食用菌资源 ,我们筛选出了适合液体生产的羊肚菌菌种 ,同时
对其液体培养条件进行了优化 ,现报道如下。
1　材料与方法
1.1　菌种
羊肚菌 (Morchella esculenta)菌株 0469 、 0464 、 0463 、 1209 ,粗柄羊肚菌 (Morchel la
crassipes)菌株 1208和尖顶羊肚菌(Morchel la conica)菌株均由中国微生物菌种保藏中心管
理委员会农业微生物中心上海食用菌分中心提供 。
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2004.04.008
1.2　培养基
1.2.1　菌种保藏培养基　PDA 粉(美国 DIFCO 公司产品)39g ,加蒸馏水至 1L , pH 自然 ,
121℃灭菌 15 min ,制成斜面培养基。
1.2.2 　基础培养基 　胰蛋白胨 2.0g/L , 酵母粉 1.0g/L , MgSO4·7H2O 0.5g/L , KH2PO4
1.45g/L ,Na2HPO4·2H2O 0.48g/L ,VB1 25mg/L ,CaCl2 0.013g/ L ,微量元素溶液(FeC6H5O7·
5H2O 4.8g/ L ,ZnSO4·7H2O 2.64g/L ,MnCl2·4H2O 2g/ L ,CoCl2·6H2O 0.4g/ L ,CuSO4·5H2O
0.4g/L)1.0mL/ L。
1.2.3　液体发酵种子培养基　PDB粉(美国 DIFCO 公司产品)24g ,加蒸馏水至 1L , pH自然 ,
121℃灭菌 15min。
1.2.4　液体发酵菌种筛选用培养基　1.2.2基础培养基加葡萄糖 20g/L ,pH6.5 ,121℃灭菌
15min。
1.2.5　液体发酵培养基　正交试验因素与水平见表 1。实验中通过对培养基中碳氮源优化
后进行配制。
表 1　试验因素和水平
Table 1　The factors and levels of the orthogonal test
水平
Levels
因素　Factors(%)
A　蔗糖
A　Sucrose B　胰蛋白胨B　T ryptone C　酵母粉C　Yeast ext ract powder D　天门冬酰胺D　L-Asparagine
1 2.0 0.4 0.05 0.04
2 4.0 0.8 0.10 0.06
3 6.0 1.2 0.15 0.08
1.3　羊肚菌的培养
1.3.1　菌种活化　将所有保藏菌种分别接种在新鲜的 PDA 平板培养基上 ,26℃培养 1周 ,进
行菌种活化和复壮。将培养好的菌种保藏在 4℃冰箱中待用。
1.3.2　固体菌种均质化　取新鲜的 PDA平板菌种 ,用打孔器在菌落边缘取直径 1.0cm 的菌
种块 。用加有定量无菌水的均质器在无菌条件下将接入菌种筛选培养基或种子培养基的菌种
块打碎 ,26℃避光静止培养 10d。
1.3.3　液体菌种均质化　在培养条件优化和液体发酵实验中 ,首先将液体静止培养的菌丝于
无菌条件下过滤 ,并用无菌水洗涤菌丝 ,然后用均质器将菌丝充分打碎 ,再用移液器定量接种 。
1.4　生物量的测定
静止培养 10d后 ,培养液经 40目尼龙布过滤 ,菌丝体经蒸馏水冲洗数次后 ,冷冻干燥至恒
重 ,电子天平称量菌丝体干重 。
2　结果与分析
2.1　菌种的筛选
将 6个受试菌株分别接入装有 50mL 液体发酵菌种筛选培养基的 250mL 三角瓶中 , 26℃
避光静止培养 10d ,测定菌丝体干重 ,筛选出最佳的液体发酵用菌种。从图 1 可以看出 ,尖顶
羊肚菌在液体培养条件下的菌丝体生物量最大 ,因此 ,选择尖顶羊肚菌作为后试菌株 。
2.2　培养基组成对液体培养尖顶羊肚菌菌丝体生物量的影响
394 期　　　　　　　　　　　邢增涛等:尖顶羊肚菌液体培养条件的研究
2.2.1　碳源的筛选　在基础培养基中分别加入 2%的葡萄糖 、蔗糖 、可溶性淀粉 、麦芽糖 、玉
米粉作为碳源 ,以 0.4%的胰蛋白胨为氮源 ,进行碳源筛选实验 。
从图 2可以看出 ,尖顶羊肚菌对蔗糖的利用效果较好 ,而对玉米粉的利用率却非常低 ,因
此选蔗糖作为尖顶羊肚菌液体发酵用碳源。
2.2.2　氮源的筛选　在基础培养基中分别
加入 0.4%的麸皮 、玉米蛋白粉 、豆粕粉 、胰
蛋白胨 、硝酸铵 、硫酸铵作为氮源 ,以 2%的
葡萄糖作为碳源 ,进行氮源筛选实验。
从图 3可以看出 ,尖顶羊肚菌利用胰蛋
白胨的效果较好 ,但对无机氮的利用率相对
较低 ,因此选胰蛋白胨作为尖顶羊肚菌液体
发酵用氮源。
2.2.3　正交试验结果　据报道 ,天门冬酰胺
对食用菌液体发酵具有很好的促进作用 ,酵
母粉不仅会影响食用菌液体发酵的菌丝体生
物量 ,也会影响发酵液的风味 。因此 ,除选用
蔗糖作为碳源 ,胰蛋白胨作为氮源外 ,为了考
察天门冬酰胺和酵母粉对尖顶羊肚菌液体发
酵的影响 ,设计了四因素三水平正交试验 。
　　1:麸皮　2:玉米蛋白粉　3:豆粕粉
4:胰蛋白胨　5:硝酸铵　6:硫酸铵
1:Wheat bran　2:Corn protein pow der
3:S oybean cake pow der　4:Tryptone
5:Ammonium nit rate　6:Ammonium sulphate
图 3　不同氮源对液体培养尖顶羊肚菌菌丝体生物量的影响
Fig.3　The effect of different nitrogen sources on the
mycel ial biomass of submerge-cultured M.conica
采用 L9(34)正交表 , 试验结果见表 2。培养基中的其它成分为:MgSO4·7H2O 0.5g/L ,
KH2PO41.45g/L , Na2HPO4·2H2O 0.48g/L , VB1 25mg/L , CaCl2 0.013g/L ,微量元素溶液
1.0mL/ L。
由表 2可以看出 ,四因素中以B因素(胰蛋白胨)极差最大 ,即胰蛋白胨对尖顶羊肚菌液体
发酵菌丝体生物量的影响最大 ,D因素(天门冬酰胺)的影响最小。最优培养基为:B1A2C3D3 ,
即 4%蔗糖 , 0.4%胰蛋白胨 ,0.15%酵母粉 ,0.08%天门冬酰胺 。
40 食　用　菌　学　报　　　　　　　　　　　　　　 　11 卷
表 2　正交试验结果
Table 2　The results of the orthogonal test
试验编号
Experiment nos.
因素　Factors
A B C D
菌丝体生物量
Mycelial biomass(g/ 50mL)
1 1 1 1 1 0.3141
2 1 2 2 2 0.3109
3 1 3 3 3 0.2923
4 2 1 2 3 0.5707
5 2 2 3 1 0.4440
6 2 3 1 2 0.3389
7 3 1 3 2 0.5726
8 3 2 1 3 0.3921
9 3 3 2 1 0.3809
K1 0.3058 0.4858 0.3484 0.3797
K2 0.4512 0.3823 0.4208 0.4075
K3 0.4485 0.3374 0.4363 0.4184
R 0.1454 0.1484 0.0879 0.0387
2.3　初始 pH 对尖顶羊肚菌菌丝体生物量的影响
分别选择初始 pH3.0 、4.0 、5.0 、6.0 、7.0和 8.0进行试验 ,结果见图 4 。从图 4可以看出 ,
尖顶羊肚菌菌丝在初始 pH4.0 ～ 7.0之间都能生长 ,最适 pH7.0 。pH 高于 7.0会影响尖顶羊
肚菌菌丝的生长 。pH 低于 4.0则会抑制尖顶羊肚菌菌丝的生长 。
2.4　培养基装量对尖顶羊肚菌菌丝体生物量的影响
使用 250mL 三角瓶作为培养容器 ,培养基装量为 25mL 、50mL 、75mL 、100mL 、125mL 和
150mL ,26℃避光静止培养 10d ,结果见图 5。从图 5可以看出 ,当装量在 25mL/250mL 时 ,液
体静止培养 10d的菌丝体生物量最大 ,达 14.3g/L 。尖顶羊肚菌为好气菌 ,液体静止培养装瓶
量越小 ,培养基与空气的接触面积相对越大 ,尖顶羊肚菌的菌丝就更容易生长。因此 ,在液体
培养生产尖顶羊肚菌菌丝时必须重视通气量 。
2.5　接种量对尖顶羊肚菌菌丝体生物量的影响
以培养基装量 50mL/250mL ,接种量 1%、2%、4%、6%、8%和 10%进行试验 ,结果见图
414 期　　　　　　　　　　　邢增涛等:尖顶羊肚菌液体培养条件的研究
6。从图 6可以看出 ,接种量对液体静止培养尖顶羊肚菌菌丝体生物量的影响并不大 ,接种量
2%和接种量 10%的菌丝体生物量基本相当。因此 ,在实际生产中选择 2%的接种量 。
2.6　培养时间对尖顶羊肚菌菌丝体生物量的影响
分别收集液体静止培养 2 、4 、6 、8 、10d的尖顶羊肚菌菌丝体进行检测 ,结果见图 7。
从图 7可以看出 ,接种 4d后尖顶羊肚菌菌丝就开始快速生长 ,第 10天 ,菌丝体生物量达
12.64g/ L。
3　结论
经试验 ,筛选出尖顶羊肚菌为适于液体培养的菌种 。尖顶羊肚菌液体振荡培养时 ,菌丝体
极易形成菌团或大菌球 ,菌团或菌球内外菌丝体因吸收营养成分或氧气的不同 ,其生长状态和
代谢情况必然存在一定的差异 ,不能真实地反映不同生长因素对尖顶羊肚菌菌丝生长的影响 。
因此 ,本研究选择静止培养研究尖顶羊肚菌菌丝的生理生化特征 。
初步确定了尖顶羊肚菌菌丝液体静止培养条件。优化培养基为:蔗糖 4%, 胰蛋
白胨 0.4%,酵母粉 0.15%,天门冬酰胺 0.08%, MgSO4·7H2O 0.5g/L , KH 2PO4 1.45g/L ,
Na2HPO4·2H2O 0.48g/ L , VB1 25mg/L , CaCl2 0.013g/ L , 微量元素溶液 1.0mL/L。初始
pH7.0 ,培养基装量 50mL/250mL ,接种量 2%,培养温度 26℃。培养 10d后菌丝体生物量可
以达到 12.64g/ L。试验为我们进一步研究尖顶羊肚菌发酵液促进双歧杆菌生长的能力或开
发双歧杆菌和尖顶羊肚菌双菌保健产品打下了良好的基础 。
参　考　文　献
[ 1] 黄年来.中国食用菌百科[ M] .北京:农业出版社 , 1993.
[ 2] Duncan CJ , Pugh N , Pasco DS , et al .Isolation of a galactomannan that enhances macrophage activation from
the edible fungus Morchella esculenta [ J] .J Agric Food Chem , 2002 , 50(20):5683～ 5685.
[ 3] 孙晓明 , 张卫明 ,吴素玲 , 等.羊肚菌抗疲劳作用研究[ J] .中国野生植物资源 , 2001 , 20(1):17 ～ 18 , 32.
[ 4] 孙晓明 , 张卫明 吴素玲 ,等.羊肚菌免疫调节作用研究[ J] .中国野生植物资源 , 2001 , 20(2):12～ 13 , 20.
[ 5] 张　珍.羊肚菌复合保健乳饮料的研制[ J] .甘肃农业大学学报 , 2001 , 36(4):421 ～ 424.
[ 6] 蒋和林 , 任祥琴.羊肚菌保健胶囊的开发[ J] .中国野生植物资源 , 1999 , 18(2):16 ～ 19.
42 食　用　菌　学　报　　　　　　　　　　　　　　 　11 卷
[ 7] 王秀云.羊肚菌腐乳的酿造研究[ J] .中国酿造 , 1999 ,(4):30～ 30.
[ 8] 路等学 , 李成一.羊肚菌杏食品的研制[ J] .甘肃轻纺科技 , 1997 ,(1):21 ～ 23.
Studies on the Submerge-Cultured Conditions of Morchella Conica
XING Zeng-tao1 , SUN Fang-fang2 , LIU Jing-sheng3
(1Supervision and Testing Center for Edible Fungi Quality(Shanghai), Ministry of Agriculture , P.R.China;
Key Laboratory of Edible Fungus Genetics and Breeding , Ministry of Agriculture , P.R.Ching;
Key Labo rato ry of Agriculture Genetics and Breeding of shanghai;
Edible Fungi Institute , Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 201106 , China;
2 Food Science and Techno logy College , Jilin Ag ricultural University , Changchun 130118 , China;
3 Resource and Environment College , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , China)
Abstract: The experimental results showed that the optimized medium for static submerge-cultured
Morchella conica was composed of sucrose 4%, tryptone 0.4%, yeast ex tract powder 0.15%, L-asparagine
0.08%, MgSO4·7H2O 0.5g/ L , KH2PO4 1.45g/ L , Na2HPO4·2H2O 0.48g/ L , VB1 25mg/ L , CaCl2 0.013g/ L , and
element solution 1.0mL/ L.And the optimal initial pH , medium capacity , ino culation rate and culture temperature
w ere 7.0 , 50m L/250mL , 2% and 26℃ respectively.And the mycelial biomass of Morchellaconica can reach as
high as 12.64g/ L after inoculation 10 days.
Key words:Morchella conica;Static submerge-culture;Mycelial biomass;Orthogonal test
《食用菌学报》 2005 年征订启事
《食用菌学报》系由国家科委批准 ,全国公开发行的学术类刊物 。主要为食用菌专业教学
和科研人员 、生产单位的技术人员及供销外贸系统和领导机关的专业干部提供食用菌遗传育
种 、驯化栽培 、菇房管理 、栽培材料 、病虫防治 、生理生化及产后加工等方面的最新研究成果。
《食用菌学报》为季刊 ,16开本 ,64页 ,每期 5.00元 。2005年出版 4期 ,全年 30.00元(含
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