全 文 ：文章编号:1001-4829(2011)01-0181-04
　　收稿日期:2010-07-23
　　基金项目:四川省财政育种工程青年基金项目(2008QNJJ-017);
公益行业专项(nyhyzx07-008);农业部 948项目 2006-G11(A1-
01)
作者简介:贾定洪(1977-),男 , 硕士 ,助理研究员 ,主要从事食
用菌分子生物学和遗传育种研究 , ＊为通讯作者。
22个毛木耳菌株 ITS序列分析
贾定洪 ,王　波 ,彭卫红 ,甘炳成 ,黄忠乾 ,郑林用＊
(四川省农业科学院土壤肥料研究所 ,四川 成都　610066)
摘　要:以 22个不同来源的毛木耳菌株为材料 ,采用 MEGA4.0软件对 ITS序列进行分析 ,构建系统发育树。试验结果显示 22个
菌株的 ITS序列长度为 620bp左右 , GC含在 50.6% ～ 51.1%,被聚为 5个分支 ,其中黄耳 10号和 781系统发育关系较近 ,共同聚
在第一个分支 ,而琥珀聚在第二分支。 ITS序列分析试验结果从系统发育角度反映出了研究菌株的遗传关系 ,是进行毛木耳菌株
遗传分析及科学鉴定的重要工具。
关键词:毛木耳;MEGA4.0;ITS
中图分类号:S646.6　　　文献标识码:A
Analysison22 AuriculariapolytrichaStrainsUsingITSSequencing
JIADing-hong, WANGBo, PENGWei-hong, GANBing-cheng, HUANGZhong-qian, ZHENGLin-yong＊
(SoilandFertilizerInstitute, SichuanAcademyofAgriculturalSciences, SichuanChengdu610066, China)
Abstract:22Auriculariapolytrichastrainswerestudiedusinginternaltranscribedspacer(ITS)sequencingmethodandthephylogenetictree
wasgeneratedbasedonKimura-2parameters.ResultsshowedthattheITSlengthsof22Auriculariapolytrichastrainswereabout620bp, GC
contentrangedfrom50.6% to51.1%, andalwereclusteredinto5clades, amongwhich, Huanger10#and781hadacloserphylogenetic
relationshipandwereclusteredintothefirstclade, whileHupointoanotherthesecondclade.Thephylogeneticrelationshipsweredistinctly
delineatedusingITSsequencing, whichindicateditcouldplayanimportantroleinthegeneticanalysisandidentificationofAuricularia
polytrichastrains.
Keywords:Auriculariapolytricha;MEGA4.0;ITS
　　毛木耳 (Auriculariapolytricha)又称黄背木耳 、
大木耳 、粗木耳等 。其耳片厚 、质地较柔软 ,营养丰
富 。食用性平 、味甘 ,药用有滋润强生 、清肺益气 、补
血活血 、镇痛止痛等功效 。四川毛木耳年产量居省
内食用菌生产量的第 2位 ,已发展成为农民脱贫致
富的一个重要途径。但由于部分非专业菌种制作者
忽视国家菌种生产管理条例 ,未严格按照菌种生产
要求 ,通过组织分离 、连续转管等方式粗放生产菌
种 ,菌种又以相互引用等方式逐步扩散 ,导致栽培品
种混淆日益严重 、品种特性不明等问题 ,甚至部分品
种出现严重退化 、产量下降 、病虫害滋生情况 ,极大
地阻碍了毛木耳产业的健康持续发展 [ 1] 。
因此 ,对菌株进行种质鉴定将是澄清毛木耳菌
株遗传背景 ,明确菌株品种特性的重要关键。但菌
株形态鉴定中 ,菌丝形态基本一致 ,子实体形态也易
受到环境因素影响且栽培耗时较长 ,不利于菌株的
快速 、准确鉴定 。而真菌 DNA基因组不受外界因素
干扰 ,遗传稳定 ,是其品种特性等性状的遗传本源。
基因组中的 rDNA包括 18 S, 5.8 S, 28 S和 5 SrD-
NA及其间隔区域(ITS和 NTS),它们以多拷贝串联
重复单位存在于一条染色体上[ 2] , 但进化速率不
同 ,其中 ITS序列因具有科 、属 、种水平上的特异性
和较快的进化速度 ,已被广泛应用于种属间遗传变
异 、亲缘关系以及分类和系统发育研究 [ 3 ～ 5] 。
本研究通过对 ITS序列分析研究 ,构建 22个毛
木耳栽培菌株 ITS序列特征指纹图谱 ,揭示其系统
发育关系 ,为毛木耳的品种选育 、资源保护 、遗传学
研究等提供参考依据。
181
2011年 24卷 1期
Vol.24　　No.1　　　　　　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2011.01.056
表 1　供试菌株及来源
Table1　StrainsusedforITSsequencing
编号 No. 品种名称 Strain 来源 Origins 编号AccessionNo.
品种名称
Strain
来源
Origins
1 ZH 四川省资源所 12 川耳 7号 四川省农科院土肥所
2 781 福建三明真菌研究所 13 红大木耳 上海农科院食用菌研究所
3 上海 3号 四川省农科院土肥所 14 Ap1142 四川省农科院土肥所
4 951 四川省农科院土肥所 15 Ap1192 四川省农科院土肥所
5 243 福建轻工所 16 3039 台湾裕农
6 青优 四川省农科院土肥所 17 Ap117 四川省农科院土肥所
7 三优 四川省农科院土肥所 18 Apw82 四川省农科院土肥所
8 紫木耳 四川省农科院土肥所 19 抗 1 四川省农科院土肥所
9 琥珀 四川省农科院土肥所 20 菊耳 2号 四川省农科院土肥所
10 Au2 广东微生物研究所 21 上海 1号 上海农科院食用菌研究所
11 苏毛 3 江苏农科院蔬菜所 22 黄耳 10号 四川省农科院土肥所
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试菌株　试验菌株 22个 ,各菌株信息见
表 1 。
1.1.2　培养基　斜面培养基:蔗糖 20 g,麸皮 15 g,
蛋白胨 2g,酵母粉 2g, KH2PO4 1 g, MgSO4 0.5g,琼
脂 21g,水 1000mL。
液体培养基:蔗糖 20 g,麸皮 15g,蛋白胨 2 g,
酵母粉 2 g, KH2PO4 1g, MgSO4 0.5 g,水 1000mL。
1.1.3　试剂　本试验所用 TaqDNA聚合酶 、dNTPs
购自立陶宛的 MBIFermentas公司 , ITS4、5引物由上
海生工生物工程技术服务有限公司合成。其它试剂
购自成都市长征化学试剂公司 。
1.2　方法
1.2.1　菌丝体制备　供试菌株菌种转接在斜面培
养基上 , 25 ℃培养 ,菌丝长满斜面后转接于液体培
养基中 , 26 ℃培养 10 d。收集菌丝 ,无菌水洗涤 2
次后 ,用无菌滤纸汲干菌丝体表面的水分 ,于 -20
℃保存备用 。
1.2.2　DNA的提取 　菌丝体 DNA的提取采用
CTAB法 ,具体方法见文献 6。
1.2.3　rDNAITS区序列扩增 、测序　ITS序列采用
通用引物 ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)
和 ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)进
行扩增 。PCR扩增采用 25μl反应体系 。本扩增反
应试剂均来自 TaKaRa公司。 DNA模板 0.5 μl, 2.5
μl10 ×PCR缓冲液 (含 MgCl2 ), 2.5 dNTP(2.0
mmol/L), 1.0 μl引物(20 μmol/L), 0.5 μlTaq聚
合酶(5 U/μl),最后加 ddH2O补充至总体积为 25
μl,而后进行 PCR扩增。 ITS扩增在 BIO-RADMy
Cycler型 PCR仪上进行 ,扩增程序为:94 ℃预变性
2.5 min;94℃变性 30s, 60 ℃退火 40 s, 72 ℃延伸
30 s,共 5个循环 ,每个循环退火温度降 0.8 ℃;第
二组循环开始 , 94℃变性 30s, 56℃退火 40s, 72℃
延伸 30 s,共 30个循环;最后一个循环结束后 , 72
℃延伸 5 min。 rDNAITS区扩增后 , PCR产物在 1.
5%琼脂糖凝胶上电泳分离 , Goldview染色 [ 7] , 用
美国 BIO-RADUNIVERSALHOODⅡ型凝胶成像系
统照相。 rDNAITS序列扩增纯化后 ,与 pEASY-T1
质粒载体连接并转化进入 DH5α感受态细胞 ,克隆 、
检验后送交英骏生物技术有限公司(invitrogen)测
序 ,提交 GenBank。
1.2.4　ITS序列分析 　应用 MEGA4.0软件 ,将测
M:DL2000, 1～ 22泳道:1 ～ 22号菌株
M:DL2000, lanes1-22:StrainsNo.1toNo.22
图 1　22个毛木耳菌株 ITS电泳图谱
Fig.1　Theelectrophoretogramof22 Auriculariapolytrichastrains
amplifiedwithprimerITS4andITS5
182 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
表 2　22个毛木耳菌株 ITS序列的 GC含量及序列长度
Table2　TheITSGCcontentandlengthof22Auriculariapolytrichastrains
编号 No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
G+C含量(%)
G+Ccontent 50.6 50.6 50.8 50.6 50.6 50.8 50.8 50.6 50.8 50.6 51.1 50.6 50.6 50.8 50.8 50.8 50.8 50.6 50.6 50.8 50.6 50.6
长度(bp)Length 494 494 494 494 494 494 494 494 494 494 495 494 494 494 494 494 494 494 494 494 494 494
序获得的 22个毛木耳菌株 ITS基因序列进行多序
列完全比对 ,去掉两端差异序列后 , 根据 Kimura-2
法计算各类群间的核苷酸差异值 , 运行 1000次
bootstrap构建获得系统发育树状图 [ 8] 。
2　结果与分析
2.1　ITS扩增及克隆
应用 CTAB法对 22个毛木耳菌株进行基因组
DNA提取后 ,通过 ITS4、ITS5引物对进行 ITS扩增 ,
纯化后进行电泳检验 ,结果如图 1。通过 DNAMak-
er(DL2000)分子量估算 ,发现 22个毛木耳菌株 ITS
条带在 620bp左右。
2.2　ITS基因测序及 GenBank提交
22个毛木耳菌株 rDNAITS序列扩增纯化后 ,
与 pEASY-T1质粒载体连接并转化进入 DH5α感受
态细胞 ,克隆 、检验后送交英骏生物技术有限公司
(invitrogen)测序。将 ITS序列提交 GenBank后 ,得
到 1 ～ 22号菌株受理号依次为 HM448450 ～
HM448471。
2.3　22毛木耳菌株 ITS序列分析
测序结果显示 ,在去除两端 ITS引物序列后 ,应
用 MEGA4.0软件将 22个菌株 ITS基因序列进行多
序列完全比对 ,计算得到 GC含量表(表 2)。结果
显示 22个菌株 GC含量在 50.6 % ～ 51.1%,其中
苏毛 3号 GC含量最高;ITS对齐序列长度在 494 ～
图 2　22个毛木耳属菌株 ITS系统发育树
Fig.2　PhylogenetictreeresultingfromUPGMAmethodwithin22 Au-
riculariapolytrichastrains
495 bp。
2.4　22毛木耳菌株系统发育分析
根据 Kimura-2法计算各类群间的核苷酸差异
值 ,运行 1000次 bootstrap得到 phylogenetictree文
件 ,使用 MEGA4.0软件显示系统发育树状图(图
2)。
　　结果显示 , 243、ZH、951、上海 1号 、Au2、781、川
耳 7号 、Apw82、黄耳 10号 、紫木耳 、抗 1这 11个菌
株聚在第一个分支 ,三优 、琥珀两个菌株聚在第二个
分支 , 上海 3号 、菊耳 2号 、Ap117、青优 、 3039、
Ap1142、Ap1192共计 7个菌株聚在第三个分支 ,而
红大木耳 、苏毛 3两个菌株各自聚为一个分支。系
统发育分析中 22个菌株聚为 5个分支 ,应视为 5个
遗传株系 ,分支间遗传距离较大 ,可在遗传分支间挑
选亲本菌株进行杂交育种 ,以便充分发挥杂交后代
遗传互补优势 。
3　讨　论
黄耳 10号 、琥珀 、781为四川重要的毛木耳主
栽品种 ,在 ITS序列分析中 ,黄耳 10号和 781聚在
第一个分支 ,系统发育关系很近 ,而琥珀和三优聚在
另一个分支 ,与黄耳 10号和 781分属不同的遗传分
支 ,遗传距离为 0.0022,系统发育关系较远。栽培
中可以将琥珀与黄耳 10号和 781搭配种植 ,以扩大
栽培菌株间的遗传背景 ,利于改良栽培品种结构 ,提
高毛木耳栽培品种对环境 、病虫害等因素的适应性。
研究还对 781、琥珀 、黄耳 10号作了 PDA菌丝
生长速度进行了测试 ,在 25 ℃培养时生长速度大小
关系为:781 >琥珀 >黄耳 10号 ,分别为 1.114、0.
888、0.477 cm/d,生长速度差异达到极显著差异水
平;在 35 ℃培养时生长速度大小关系为:琥珀 >
781>黄耳 10号 ,分别为 4.72、3.92、1.30 cm/d,生
长速度存在显著差异 ,而 781与黄耳 10号生长速度
差异甚至达到极显著差异水平。菌丝生长速度试验
结果显示琥珀比黄耳 10号更适合高温环境 ,更能够
快速生长占据菌袋空间 ,利于毛木耳病害防治。尽
管黄耳 10号菌丝生长速度较慢 ,但因其良好的商品
性状 ,同样受到毛木耳栽培者的青睐 。而基于 ITS
序列分析结果 ,将黄耳 10号与琥珀等菌株进行杂交
育种 ,得到的杂交菌株其杂交优势可能更加明显 。
1831期 　　　　　　贾定洪等:22个毛木耳菌株 ITS序列分析
Ap1142、Ap1192、Ap117菌株为野生分离菌株 ,
在 ITS序列分析中与上海 3号 、菊耳 2号 、青优 、
3039聚在一个分支 ,系统发育关系很近。但因其采
自野生环境 ,具有特有的环境适应性 、抗逆性等优良
特性 ,能够作为优良亲本菌株在育种中得到较好应
用 。
在 ITS序列分析试验中 ,获得了 22个毛木耳菌
株的 ITS特征指纹图谱 ,并被聚为 5个分支 ,反映出
了研究菌株的系统发育关系。试验结果从系统发育
角度分析得到了研究菌株的遗传关系 ,其研究结果
能够直接应用于进一步的遗传育种和种质鉴定等工
作 ,是进行毛木耳菌株遗传分析及科学鉴定的重要
工具。
参考文献:
[ 1]张　丹 ,郑有良 ,王　波 ,等.四川省毛木耳主要栽培品种出菇比
较试验 [ J] .四川农业大学学报 , 2004, 22(4):353-355.
[ 2] RoyseDJ, NicholsonMS, BunyardBA, etal.RibosomalDNAfor
molecularsystematicsandgeneticanalysisofpopulationsofedible
fungi[ A] .In:XCLuoandMZanged.TheBiologyandTechnology
ofLxntinulaMushroom[ M].Beijing:ChinaAgriculturalScientech
Press, 1995.
[ 3] CaoH, PaulPH, ShawPC.MethodologicalStudiesonGenomic
DNAExtractionandPurificationfromPlantDrugMaterials[ J] .Jour-
nalofChinesePharmaceuticalSciences, 1998, 7(3):130-138.
[ 4]计红芳 ,杨　谦 ,宋瑞清.杨树叶枯病菌 rDNAITS序列验证及生
物学特性研究(英文)[ J] .林业研究(英文版), 2006, 17(1):
17-20.
[ 5]曾晓葳 ,骆　勇 ,周益林 ,等.基于小麦白粉病菌 rDNAITS序列
的 PCR分子检测 [ J] .植物病理学报 , 2008, 38(2):211-214.
[ 6] ZhengLY, JiaDH, FeiXF, etal.Anassessmentofthegeneticdi-
versitywithinGanodermastrainswithAFLPandITSPCR-RFLP
[ J] .MicrobiologicalResearch, 2009, 164:312-321.
[ 7]贾定洪 , 郑林用 , 王　波 ,等.五个野生木耳属菌株的 ISSR分析
[ J] .食用菌学报 , 2008, 15(3):7-12
[ 8]费来华 ,李　赞 ,陈家鑫.10种海参 16SrDNA序列多样性及其
亲缘关系分析 [ J] .中国水产科学 , 2008, 15(5):755-765.
(责任编辑　李　洁)
184 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷