全 文 ：d ib le fu n g i 2010（3）
黄绿蜜环菌液体培养几种胞外酶的测定
焦迎春 1 余 梅 2 唐 达 3
（1青海大学生物科学系，青海西宁 810016；2青海普兰特药业有限公司，青海西宁 810007；3博福-益普生（天津）制药有限公司，天津 300384）
摘 要 在黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-virens）液体发酵培养
过程中，对羧甲基纤维素酶 （CMCase），漆酶 （Laccase），淀粉酶
（Starchase），过氧化物酶（Peroxidase），锰过氧化物酶（Manganese
peroxidase，MnP），蛋白酶（Prolease）六种重要的胞外酶间隔 24 h
测定酶活力。 结果如下：淀粉酶、锰过氧化物酶、羧甲基纤维素
酶、 漆酶和过氧化物酶的酶活均有较大变化， 产酶高峰期也不
同；菌丝体重量在第 6 天达最大值，可作为菌丝体（液体菌种）收
获期。
关键词 黄绿蜜环菌 胞外酶 酶活力
文章编号 1000-8357（2010）03-0006-02
收稿日期：2009-11-08 一稿；2009-11-19 修改稿。
基金项目：国家自然科学基金项目（30460083）；教育部重点科学
技术研究资助项目（20516）。
黄绿蜜环菌（Armillaria luteo-virens），俗名黄蘑菇 ，在自
然条件下，生长于高寒嵩草草甸上，并与嵩草属（Kobresia）植
物形成菌根。 主要分布于青海、西藏海拔 2 500~4 500 m 的草
原或高山草甸上，单生或群生，形成蘑菇圈。四川西部、甘肃南
部等地也有少量分布 [1]。 黄绿蜜环菌子实体肥厚，味道鲜美，
香气浓郁，营养丰富，是一种名贵食用菌，也是一种重要的高
原生物资源。 近年来，野生黄绿蜜环菌的过度采食，加上退变
的生境致使发生量逐年减少， 市场需求增加和产量趋减使供
需矛盾日见突出，并对该野生物种造成严重威胁。而黄绿蜜环
菌属于外生性菌根菌，其人工栽培子实体难度相当大 [2]。 有研
究表明[3]黄绿蜜环菌菌丝与子实体营养成分类似，采用液体发
酵菌丝的方法获得子实体进行资源的开发利用具有重要的意
义。 试验对黄绿蜜环菌液体培养过程中酶的活性变化进行了
测定， 旨在为这一高原野生珍稀食用菌资源的开发提供一定
的营养生理基础理论。
1 材料与方法
1.1 供试材料 ①供试菌种：供试的黄绿蜜环菌由青海大学
生物科学系微生物实验室提供。②试验培养基：葡萄糖 15 g/L，
酵母膏 5 g/L，磷酸氢二钾 1 g/L，磷酸二氢钾 0.5 g/L，硫酸镁
0.3 g/L，pH 自然。
1.2 试验方法
1.2.1 菌丝培养 将培养好的菌丝球接种 5 mL 到液体发酵
培养基中，在 26℃±1℃，120 r/min 恒温振荡培养。
1.2.2 制备酶液 连续 8 d，每天定时取 5 mL 发酵液于 4℃、
4 000 r ／min 离心 15 min，上清液即为粗酶液，置于 4℃低温冰
箱保存备用。
1.2.3 酶活力测定 以煮沸 15 min 的酶液作对照，每组 3 个
重复。 酶活力以样品与底物反应 30 min 后光密度的改变值表
示。 ①羧甲基纤维素酶活力测定 [4]；②漆酶活力测定[5]；③淀粉
酶活力测定 [4] ；④锰过氧化物酶活力测定 [6]；⑤过氧化物酶活
力测定[7]；⑥蛋白酶活力测定[8]。
1.2.4 发酵液 pH 测定 用 pHS-3C 数字酸度计测量。每组 3
个重复。
1.2.5 氨基酸含量测定[9] 茚三酮法。
1.2.6 生物量测定[10] 干重法。
2 结果与讨论
2.1 酶活力测定结果
由图 1 可以看出， 在黄绿蜜环菌分批液体深层培养过程
中锰过氧化物酶的活性最高，但出现的时间最晚；淀粉酶的酶
活性在第 4 天就达到最高；CMC 酶的酶活性高点出现在第 3
天；漆酶、过氧化物酶的最高酶活性均出现在液体培养 120 h
处，随后逐渐降低；蛋白酶的酶活性高点出现最早，但酶活性
总体水平不高，变化趋势也较平缓。根据酶活力的变化情况推
断：黄绿蜜环菌能在菌丝生长初期利用木质素作为碳源，随后
生 理 生 化
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为响应党中央建设社会主义新农村的号召， 发挥中国农
业科学院蔬菜花卉研究所公益型研究所的作用， 结合蔬菜所
菜病综防课题组承担的相关科研项目， 特向全国食用菌、蔬
菜、花卉、瓜类主产区免费提供病害诊断、防治技术服务。
主诊专家 李宝聚， 中国农业科学院蔬菜花卉研究所研
究员，博士，博士生导师（植物病理学、农药学 、农业微生物
学），国家蔬菜现代产业技术体系岗位专家（病害诊断与综合
防治）。
咨询方式 由于受人力限制， 仅接受送样与寄样病害诊
断及防治指导工作，原则上不接受电话咨询诊断工作，也不接
受明显是生理性病害的样品。对于邮寄的所有样品，诊断结果
和防治技术给予电话回复。对于地区性严重危害病害，根据专
家的工作安排，可以现场诊断，指导防治。
寄、 送样方式 可将发病部位制成半干样品用 “特快专
递”寄至本课题组。 具体方法：将食用菌子实体置于阴凉处晾
干，再用多层旧报纸包裹寄出。 蔬菜茎、叶部发病，可将病茎、
叶置于强日照下暴晒，任其失水半天左右；也可将其放在热锅
盖上烘烤，使其快速失水，半干后夹于旧报纸国寄出（叶片之
间也用报纸隔离）。 果实发病，可将病果或切开晾干的病斑部
位包裹于多层报纸中寄出。花和小苗等幼嫩多汁的样品，可夹
在多层报纸或卫生纸中压制寄出。 切记不要用塑料袋直接装
样品，那样容易腐烂。寄样品时请标明详细的采集时间、地点、
蔬菜种类及品种。 亦可将病样直接送至中国农业科学院蔬菜
花卉研究所菜病综防组。
地址：北京市海淀区中关村南大街 12 号
中国农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综防组
邮编：100081 电话：010-89119659 联系人：石延霞
免费食用菌、蔬菜、花卉、瓜类病害诊断、防治咨询
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由于淀粉质原料的大量利用使木质素作为碳源的利用被减
弱；黄绿蜜环菌利用淀粉质原料的能力最强，可能是由于培养
基中淀粉质原料较多对淀粉酶的酶活性有一定的诱导激活作
用有关；其蛋白酶是一种诱导酶，当培养基中的蛋白质含量较
高时酶活力也相应增加。
2.2 发酵液 pH 值和氨基酸的变化 由表 1 可以看出，在整
个发酵期内 pH 值变化不大， 说明黄绿蜜环菌在液体发酵中
很少产生酸类或碱类物质。 发酵液中氨基酸的含量变化也不
大，这与蛋白酶活力的变化相符。
2.3 菌丝生物量的变化 过滤后的菌丝球用蒸馏水多次冲
洗后，称其湿重；然后烘至恒重后称其干重。 结果发现第 7 天
菌丝重量达到最大生长量；以后菌丝重量不再增加。说明在液
体培养条件下，如以收获菌丝体为目的（液体菌种培养），在该
培养条件下，第 7 天为其最佳液体种子收获期（图 2）。
3 结 论
在发酵过程中，黄绿蜜环菌对营养的利用以及生物量与
发酵液胞外酶活性变化有较大的相关性，酶活性越大，营养利
用较好，菌丝生长越旺盛，生物量也愈大。 淀粉酶活性表明黄
绿蜜环菌具有降解多糖类物质的能力，CMC 酶活性表明黄绿
蜜环菌具有降解纤维素的能力；漆酶、过氧化物酶、锰过氧化
物酶活性表明黄绿蜜环菌具有降解木质素的能力； 蛋白酶的
活性变化不大，说明菌丝生长过程中对氮源的要求不高。这几
种酶的活性高峰期交替出现，具有明显的变化，表明黄绿蜜环
菌具备液体发酵培养所需的条件， 在合适的培养条件下可以
得到较优的液体种子。
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表 1 黄绿蜜环菌发酵液 pH及氨基酸含量
发酵时间/d 1 2 3 4 5 6 7 8
pH 值 5.1 5.08 5.02 4.94 4.8 4.62 4.45 4.36
氨基酸/（g·L-1） 1.36 1.35 1.34 1.26 1.13 1.14 1.13 1.09
生 理 生 化
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