全 文 ：用原生质体融合进行冬菇育种的研究
刘作喜　郝振军　刘　威　许庆兰
(黑龙江大学生物工程系　哈尔滨 150080)
赵　华　　　　　　　　　　　　王永吉
(哈尔滨工业大学　哈尔滨 150080)　(黑龙江省自然资源研究所　哈尔滨 150040)
　　摘要　用灭活的 〔Flammulina subnudus(Pr.)Sing〕 双
核菌株原生质体与 〔Flammulina velutipes (Fr.) Sing〕 双核
菌株原生质体融合 , 在 22℃的条件下筛选得融合子。融
合频率为 0×10-5 ～ 4.1×10-5。融合子与双亲有明显的拮
抗性。融合子的菌丝体形态 , 氨基酸含量 , 子实体的形
态 , 以及酸性磷酸酶的测定都与双亲不同。
关键词　近裸冬菇　冬菇　灭活原生质体　融合
采用非人工标记菌株融合选择方面的研究对加
快冬菇的远缘杂交育种工作有其重大意义。
1　材料和方法
1.1　试验菌种　近裸冬菇 (Flammulina subnudus)
简称 S 株双核菌株 , 菌丝体最佳生长温度为 20 ～
24℃, 能在 18℃形成子实体。 冬菇 (Flammulina
velutipes)简称 E 株双核菌株 , 最佳生长温度为 21
～ 26℃, 子实体形成的温度 8 ～ 18℃。均由黑龙江
大学食用菌基地提供。
1.2　培养基　马铃薯 、 葡萄糖 、 琼脂综合培养基:
马铃薯 200g , 葡萄糖 20g , 磷酸二氢钾 2g , 硫酸镁
0.5g , 维生素 B110mg , 琼脂 18g , 水1 000mL。液体
再生培养基 (MB):蛋白胨 0.5g , 甘露醇 12.66g ,
酵母膏 0.48g , 葡萄糖 1g , 磷酸二氢钾 0.006g , 硫
酸镁 0.006g , 双蒸水 100mL。
1.3　酶液　蜗牛消化液原液稀释6倍 , 加 0.5%,
0.5M 硫酸镁 (国产)。使用前15 000r/min , 4℃离心
55min。
1.4　融合剂　35%聚乙二醇 (FEG , 由日本进口 ,
M.W.6000), 12mMCaCl2 , 用三羟甲基烷调 pH7.0。
1.5　化学灭活剂 (CLA 灭活处理) 　灭活剂为
0.83%碘乙酰胺 , 0.6M 硫酸镁。随配随用。灭活
处理过程是先将 S 株原生质体悬浮于灭活剂中 ,
20℃5min , 然后立即用 0.6M 硫酸镁溶液离心洗涤 3
次。
1.6　原生质体的分离及融合　移斜面菌丝于液体
MB , 26℃培养 72h后转 20℃培养 48h , 将培养好的
菌丝滤出 , 用 0.6M 硫酸镁洗涤后吸干水分 , 于
30℃酶液中不断摇动 , 恒温酶解 3h 后 , 用棉花过
滤 , 10×103 r/ min 离心收取原生质体 , 用 0.6M 硫
酸镁洗涤后悬浮于 2mL0.6M 硫酸镁中 , 用血球计
数器计数后移适量于MB中 , (25℃12h 后涂 MB 平
板。 E株分别于 25℃, 30℃培养 10d 计算再生率和
计算 E 株的存活率。)S 株悬液用 CLA 处理后悬浮
于 2mL0.6 硫酸镁中 , 计数后移适量于 MB 中 ,
(25℃, 12h后涂 MB 平板 , 30℃培养 10d 计算存活
率。)然后S 株和 E 株原生质体等量混合 , 离心去
上清 , 加入预热的融合剂 , 30℃不断振荡 15min ,
加入预热的融合剂 30℃不断振荡 15min , 加入 MB
稀释 20 倍 , 25℃, 12h 后涂 MA 平板于 30℃培养
10d。
1.7　融合子的测定
1.7.1　拮抗试验:双亲与融合子接种于同一 MA
平板上培养 , 观察拮抗作用。
1.7.2　菌丝氨基酸含量的测定:移斜面菌丝于 MA
平板 , 25℃, 5d 后菌落外沿用 0.5cm打孔器打孔接
种块 , 接种于液体 MA 中 (150mL锥形瓶 , 30mL/
瓶)。每瓶5 个接种块 , 25℃, 10d 后滤取菌丝 , 自
来水 、 蒸馏水 、 双蒸水顺序各洗涤一次后于 82℃
烘干 , 称重。
1.7.3　冬菇杂木屑袋栽培法〔3〕。
1.7.4　胞外酸性磷酸酶同功酶鉴定:在相同接种
量和相同的培养条件下得到的培养液经过滤 , 离心
后作为样品 , 采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,
凝胶板厚 0.6mm , 分离胶 130mm , 浓缩胶长 15mm ,
电泳开始时稳压 100 伏 , 30min 后稳压 600 伏。 4℃
冰箱内电泳 , 分离胶浓度为 10%, 加样量为 60uL。
2　结果与分析
2.1　原生质体的分离 、 再生及其在特定条件下的
存活率　S 株用酶液作用 136min , 原生质体产量可
达 4.6×105 ～ 9.0×105。 再生率 8%。经 CLA 灭活
后的再生率为 0。 E 株用酶液作用 179min , 原生质
体产量可达 1.8×105 ～ 4.8×105 , 在 25℃的条件下
再生率为 3%。在30℃的条件下再生率为 0。
经酯酶 、 漆酶 、 过氧化物酶 、 酸性磷酸同功酶
的测定 , 没有发现再生菌株与原始亲株在同功酶谱
收稿日期 1999—04—23
6 中国食用菌　EDIBLE FUNGI OF CHINA　　　　　　　Vol.18 , No.5
DOI :10.13629/j.cnki.53-1054.1999.05.003
上有差异。生物学的测定表明:再生菌株与原始亲
本无拮抗性 , 最适生长温度 、 菌落形态 、 菌丝转色
情况 , 在 MA上形成子实体等均相同。而且双亲在
特定条件下的再生率也比较稳定。有理由认为:未
经核配和减数分裂的双亲生化特性和生物学特性稳
定 , 只要重复相同的条件就能重复其生化特性和生
物学特性。
2.2　原生质体的融合　双亲的原生质体以106的浓
度 , 按 1∶1 比例混合 , 在融合剂的诱导下融合 , 其
融合率为 0×10-5～ 3.9×10-5 。
从显微镜中可以观察到融合过程不是在添加融
合剂后立即发生。加入融合剂后可以看到略微皱缩
的原生质体聚集。加入MB 稀释后 , 聚集的原生质
体逐渐过渡到融合状态。 12h 后可以观察到体积较
大的球形 、 椭圆形 、 哑铃形 、 葫芦形的细胞。
表 1　　　生　物　学　性　状　的　比　较
Table1　The Comparison of Biological Phenomenon
菌株
Strains
S SE-91 SE-92 SE-93 E
锁状联合
Clamp connection
有
Present
无
Absent
无
Absent
无
Absent
有
Present
菌丝质地
Quality of mycelium
坚韧
Leathery
肉质
Fleshy
肉质
Fleshy
肉质
Fleshy
肉质
Fleshy
生长速度
Growth rate
快
Fast
快
Fast
快
Fast
快
Fast
慢
Slow
在MA形成子实体
Fructification in MA
形成
Able
不形成
No
不形成
No
不形成
No
不形成
No
2.3 　融合产物的鉴定 　合子 SE—91 , SE—92 ,
SE—93与双亲比较有以下结果:
2.3.1　菌丝 、 菌落形态的比较:S 株和 E株菌丝体
均有明显的锁状联合。S 株易形成坚韧菌皮 , 在液
体和固体 MA 上都能形成子实体。 E 株菌丝肉质
性 , 不易形成坚韧菌皮。
如表 1所示 , 融合子的菌丝不论在液体或固体
MA上经多次培养 (20 ～ 30℃至今尚未观察到锁状
联合 , 菌丝肉质性 , 不形成坚韧菌皮 , 在液体或固
体MA上至今尚未培养出子实体。 (对照 S 株均能
形成子实体)。
2.3.2　生物转化率和氮化合物转化率的比较:菌
丝干重表示菌丝的生物转化率。如表 2 所示 , 生物
转化率与氨基酸含量明显相关。各菌株生物转化率
由高到低的顺序与氨基酸的含量的顺序相反。菌丝
量与氨基酸百分含量的乘积表示氮化合物的转化
率 , 其结果从表 2 , 可以说明:融合子与双亲在代
谢生理上是有一定差异。
2.4　子实体的形态比较　E 株生长很慢 , 未能得
到子实体。 S 株子实体菌盖近似半圆球形 , 淡黄
色 , 略大时菌盖呈扁平 , 直径可达 8 ～ 15cm 以上 ,
直径为 0.3 ～ 0.8cm , 上下等粗或上部略细 , 菌柄初
期充实 , 后期中空。
表 2　　生物转化率和氮化合物的转化率的比较
Table 2　the Comparison of Frenquence of Biological
Transformation and Nitrogen - compound
Transformation
菌株
Strains
S SE-91 SE-92 SE-93 E
菌丝干重
(g/瓶)
Dry weight
of mycelium
(g/ Bott le)
0.089 0.078 0.089 0.140 0.044
氮化合物含量
(mg/瓶)
Content of
nit rogen compound
(mg/ Bottle)
17.64 20.53 22.02 17.50 14.23
融合子 SE-91 子实体菌盖比 S 株的略小 , 色
泽略带淡黄色 , 且更富有弹性肉质。
融合子 SE-92 子实体菌盖呈扁半球形 , 或略
有上凸形 , 边缘较整齐 , 个体较 S 株的略小 , 且有
弹性肉质。菌盖表面光滑 , 有胶质的薄皮为淡褐黄
色。
3　问题与讨论
灭活原生质体融合是细胞融合技术的一个新发
展 , 优点是无需人为的标记工作。不用耽心亲本基
因型的改变 , 在同种不同菌株型中有较广的适用范
围。本研究是用巯基酶的专一性抑制剂乙酰胺使 S
株细胞代谢过程的关键酶失活 , 细胞丧失继续生长
的能力。当其与 E 株细胞融合后 , E 株细胞的酶能
救活 S 株细胞的致死损伤。在 S 株能生长而 E 株不
能生长的条件下选得融合子。这种选择过程只能选
择融合救活后的融合子而不能淘汰分离子 。因此选
择过程不能重复 , 这种选择方法要结合快速的早期
鉴定方法才能更好地发挥作用。
融合细胞是在 30℃下选择 , 故 S 株分裂快 , E
核分裂慢或甚至不分裂。核分裂慢的细胞总是易于
丢失染色体。这是真核杂种细胞丢失染色体的规律
之一。在选择方法和杂交组合都有利于亲本S 株的
情况下 , 融合产物很可能出现以表现 S 株遗传性状
为主的融合子。
参 考 文献
1　张龙翔等.生化实验方法和技术.北京:人民教育出
版社 , 1981 , 1～ 59
(下转第12页)
7第 18 卷　第 5期　　　　　　　中国食用菌　EDIBLE FUNGI OF CHINA
　　表 6 不　同　料　水　比　对　平　菇　生　物　效　率　的　影　响
处理 鲜菇产量　kg一潮 二潮 三潮
生物效率
(%) 子实体状态及出菇状况
1∶1.3 14.5 8.6 3.4 104 浅白叠生, 盖簿 , 零星
1∶1.5 20.9 15.6 10.3 183.2 灰白柄短 , 肉厚 , 出菇集中
1∶1.8 23.1 16.3 10.9 196 灰白柄短 , 肉厚 , 整齐集中
1∶2.0 14.4 11.2 7 127.6 灰白柄中长 , 较集中
用旋耕机拌料与其它两种拌料处理方法间的生物效
率差异达极显著水平。结果详见表 7。
表 7　不同拌料方法对平菇菌丝生长及产量的影响
拌料方法 日均长速(mm)
发满袋
(d)
污染率
(%)
生物效率
(%)
原料浸泡 2.9 33 9.7 183.1
手工搓料 3.6 28 4.3 177.4
旋耕机拌料 3.6 29 0 195.3
3　小结和讨论
3.1　玉米芯代用料栽培平菇各配方中菌丝的生长
速度均比对照慢 , 主要是因为各处理配方中都不同
程度地增加了氮源和其它营养成分 , 菌丝能够较好
地生长 , 而纯玉米芯培养料中由于氮素营养缺乏 ,
菌丝较为稀疏 , 且生长速度较快 , 但出菇后表现为
营养缺乏 , 后劲不足 , 生物效率低。
3.2　玉米芯为代用料的栽培基质其料水比应高于
棉籽壳基质 , 这对提高平菇生物效率是至关重要
的 , 因为平菇子实体的生长发育所需的水分绝大部
分来自培养料中。栽培原料浸泡后含水量偏大 , 用
手工搓料其含水量又偏少 , 这两种拌料方法不仅费
工费时 , 而且生产效果也不太理想。应用旋耕机拌
料不仅工效高 , 生产效果也较理想 , 是代用料栽培
较为理想的拌料方法 , 有利于大面积推广应用。
3.3　玉米芯含糖量高 , 易于污染 , 在配方中加入
适量多菌灵是十分必要的 , 本次试验主要是基于生
产低残毒的无公害平菇 , 而没有使用多菌灵 , 这在
低温季节栽培 , 发菌温度控制在 15 ～ 20℃, 配方中
不用多菌灵也是可行的。
参 考 文献
1　李胜俊, 曹钰普编著.代料栽培食用菌新技术.北京:
中国林业出版社 , 63～ 80
2　周廷斌等.玉米芯栽平菇的配方及配套技术研究.食
用菌 , 1995 , (4):25～ 26
3　姚占芳 , 吴云汉等.木屑发酵料的制备工艺与香菇开
放式栽培.中国食用菌 , 1993, (1):22～ 24
4　周玉麟.平菇栽培高产因子剖析.中国食用菌 , 1994 ,
(3):38～ 39
5　方伟庆.培养料中水和气的物理性探讨.食用菌 ,
1991, (3):27
　　(上接第 7页)
2　郭美英.金针菇栽培.福州:福建科学技术出版社 ,
1996 , 37～ 69
3　刘作喜编著.食用菌栽培学.哈尔滨:黑龙江科学技
术出版社 , 1996 , 109～ 129
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糖产量的测定.黑龙江大学自然科学学报 , 1996 , 127
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5　黄日明 , 陈国醒等著.食用菌育种栽培加工技术.长
沙:湖南科学技术出版社 , 1990 , 1～ 41
6　刘作喜等.微生物电极快速测定菌类浓度的研究.黑
龙江大学自然科学学报 , 1997, 113～ 115
7　H.J.科恩著.王文译.生物学染色剂.北京:科学出
版社 , 1958 , 79～ 268
Studies on the Breeding of Mushrooms by Means of Inactivated Protoplast Fusion
Liu Zuoxi , Hao Zhenjun , LiuWei , Xu Qinglan
(Biology Department Heilongjiang , Universi ty Harbin 150080)
Zhao Hua
(Applied Physics Deparpment of Harbin Institute of Technology)
Abstract:Fusion strains have been obtained by means of high temperature(30℃) selection after fusion between the
inactivated protoplasts of Flummulima subnudus(Fr.)Sing dicargons and living protoplasts of Flammulina velutipes (Fr.)
Sing, dicargons Fusion among fusion strains snd their parents morphology and amino acid content of hypha , and fruiting
bodies morphology of fusion strains are different from of their parents.
Key words:Flammulina subnudus(Fr.)Sing;Flammulina velutipes(Fr.)Sing;Inactivated protoplast;Fusion
12 中国食用菌　EDIBLE FUNGI OF CHINA　　　　　　　Vol.18 , No.5