全 文 ：６５０－６５７
０４／２０１２
草 业 科 学
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ
２９卷０４期
Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．０４
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毥
后生物
生产层
尖叶胡枝子青贮微生物数量变化及
发酵特性
司丙文１，王宗礼２，孙启忠２，张慧杰１，李 峰２
（１．中国农业科学院研究生院，北京１０００８１；
２．中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特０１００１０）
摘要：以尖叶胡枝子（Ｌｅｓｐｅｄｅｚａ ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ）为原料，对其表面附生的２株乳酸菌（ＬＨ２９、ＬＨ３３）的生化特性、生
长特性、产酸速率进行了研究，经传统鉴定方法及１６ＳｒＲＮＡ分析方法鉴定，ＬＨ２９为戊糖片球菌，ＬＨ３３为植物
乳杆菌；发酵初期戊糖片球菌产酸速率优于植物乳杆菌，发酵中后期后者产酸速率优于前者；将ＳＮＯＷ ＬＡＣＴ－Ｌ
（ＳＬ）和纤维素酶（ＡＣ）２种添加剂添加至尖叶胡枝子中，研究了不同发酵时间微生物数量的动态变化及发酵品
质。发酵初期，各种微生物的数量较青贮原料上的数量有较大的增长，发酵第２天，添加 ＡＣ处理组的乳酸菌数
量最高，ＳＬ＋ＡＣ添加组的乳酸菌的数量显著高于对照组（Ｐ＜０．０５），发酵第３０天，乳酸菌、好氧细菌、酵母菌、霉
菌及大肠杆菌的数量有所减少，大肠杆菌减少更明显；各添加组与对照组相比，氨态氮及丁酸含量显著降低（Ｐ＜
０．０５），乳酸含量明显提高（Ｐ＜０．０５）。通过Ｆｌｉｅｇ青贮饲料评分方案得出直接青贮饲料的发酵品质较差，等级为
劣，而添加ＡＣ及ＳＬ＋ＡＣ处理的青贮饲料发酵品质Ｆｌｉｅｇ等级为优。
关键词：尖叶胡枝子；青贮；乳酸菌；发酵品质
中图分类号：Ｓ５４１＋．５０９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０６２９（２０１２）０４－０６５０－０８
尖叶胡枝子（Ｌｅｓｐｅｄｅｚａ ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ）为豆科
多年生草本状半灌木［１］，广泛分布于我国东北、华
北、西北、西南、华南等地，具有耐干旱、耐贫瘠、抗
寒、病虫害少等特性，是良好的水土保持和防止沙化
的生态型牧草［２］。该牧草茎叶的粗蛋白、氨基酸、粗
纤维等营养成分含量高，年生物量大，又是优良的饲
用牧草。尖叶胡枝子资源丰富，但由于木质化程度
高，适口性差，目前为止尚未得到合理的开发利用。
青贮作为青绿饲料的有效贮藏手段，不仅能有效保
存原料的营养价值，而且通过乳酸发酵能改善适口
性，提高营养价值。然而，尖叶胡枝子含糖量比较
少，缓冲能值高，是一种很难青贮的原料。近年来，
青贮菌剂以及纤维素酶已经广泛应用在难青贮的豆
科牧草中，并得到了良好的效果［３－６］。本研究分析了
尖叶胡枝子表面附生的乳酸菌的种类及其产酸能
力，并通过添加乳酸菌制剂和纤维素酶进一步研究
青贮过程中微生物数量动态变化及青贮发酵品质，
探讨适合尖叶胡枝子青贮的可行方法，为生产应用
提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１青贮原料 ２０１０年７月采自内蒙古赤峰市林
西县良种场人工种植的尖叶胡枝子，取样时期为第
１茬开花期。
１．２青贮添加剂 ＳＮＯＷ ＬＡＣＴ－Ｌ：主要成分为
鼠李糖乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）冻干粉，生
产商为Ｓｎｏｗ Ｂｒａｎｄ Ｓｅｅｄ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｓａｐｐｏｒｏ，Ｊａｐａｎ。
纤维素酶：Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｕｌａｓｅ粉剂，生产商
为 Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａ Ｋａｉｓｈａ Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ。羧甲基
纤维素酶（ＣＭＣａｓｅ），酶活性为２７ ０００Ｕ·ｇ－１；β葡
萄糖苷酶（β－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ），酶活性为７８０Ｕ·ｇ
－１；微
结晶纤维素酶（Ａｖｉｃｅｌａｓｅ），酶活性为７８４Ｕ·ｇ－１；
木聚糖酶（Ｘｙｌａｎａｓｅ），酶活性为１３ ０００Ｕ·ｇ－１。
１．３试验设计 试验设添加乳酸菌（ＳＬ）、纤维素
酶（ＡＣ）、乳酸菌和纤维素酶混合添加（ＳＬ＋ＡＣ）以
＊ 收稿日期：２０１１－０７－１８ 接受日期：２０１１－１１－０７
基金项目：现代农业产业技术体系（ＣＡＲＳ－３５）建设专项资金；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（中国农业科学院草原研
究所）；内蒙古自治区自然科学基金项目（２０１０ＭＳ０４０２）
作者简介：司丙文（１９７５－），男，黑龙江佳木斯人，在读博士生，研究方向为草地资源保护与利用。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｉｂｉｎｇｗｅｎ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
通信作者：王宗礼 Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｚｏｎｇｌｉ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
０４／２０１２ 草 业 科 学 （第２９卷０４期）
及不添加对照组（Ｃｏｎｔｒｏｌ）４个处理，每个处理３次
重 复。乳 酸 菌 和 纤 维 素 酶 的 添 加 量 分 别 为
０．０００ ５％和０．００１ ５％。
１．４青贮调制 尖叶胡枝子用粉碎机粉碎为２～３
ｃｍ，按照试验设计加入添加剂，添加量以鲜质量为
基础，装入聚乙烯袋，每袋质量约２００ｇ，用真空包装
机抽真空并封口，在室温条件下分别贮藏２、５、１０和
３０ｄ后开封取样，进行微生物计测，青贮６０ｄ分析
青贮的发酵品质、化学成分。
１．５微生物菌数的计测 在超净工作台中将待
测样品开封取样，将样品剪碎，混匀，称取５ｇ于装
有４５ｍＬ无菌水的１００ｍＬ三角瓶中，摇床１８０
ｒ·ｍｉｎ－１，室温振荡３０ｍｉｎ，将此溶液依次稀释
１０～１０９ 倍。用平板培养计数法进行菌数计测。
ＭＲＳ培养基在３７℃厌氧条件下培养４８ｈ，ＢＬＢ、
ＰＤＡ、ＮＡ培养基在３７℃有氧条件下培养４８ｈ后
计数。
１．６乳酸菌生化特性试验与糖发酵试验 选
取从新鲜尖叶胡枝子上分离纯化的２株乳酸菌，进
行温度、耐酸耐盐、葡萄糖产气等生化试验和糖发酵
试验［７－９］，将这２株乳酸菌进行初步鉴定。
１．７乳酸菌１６ＳｒＲＮＡ 基因序列测定及系统
进化分析 对菌株１６ＳｒＲＮＡ 基因片段进行扩
增，引物序列为 ２７ｆ：５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧ－
ＧＣＴＣＡＧ－３′和１ ４９２ｒ：５′－ＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ－
ＴＡＡＣＣ－３′，由上海桑尼生物科技有限公司合成。
ＰＣＲ反应体系（５０μＬ）：Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ Ｆａｓｔ ＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（购自日本株式会社）２５μＬ，引物２７ｆ
和１ ４９２ｒ（２０ｐｍ）各２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ补足至５０μＬ，挑
取培养２４～４８ｈ的乳酸菌单菌落于反应体系中混
匀；ＰＣＲ扩增程序：９４℃５ｍｉｎ，９４℃５０ｓ，５５℃５０
ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，３０个循环后，７２℃１０ｍｉｎ，４℃
保存。ＰＣＲ 扩增产物在１％琼脂糖凝胶上电泳检
测。将ＰＣＲ扩增产物送至上海生工生物工程有限
公司进行正、反测序。序列在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进
行ＢＬＡＳＴ同源性比对，用 Ｍｅｇａ ４．０软件分析菌株
与参考菌种亲缘关系，利用软件中的ｃｌｕｓｔｅｒ Ｗ 方
法构建系统进化树。
１．８产酸速率测定 将分离并鉴定的乳酸菌分
别按３％的接种量传入 ＭＲＳ液体培养基中，３７℃
恒温培养。每隔２ｈ测定不同菌株发酵液 ｐＨ
值［１０］。
１．９生长曲线的测定 用待测菌株２４ｈ的培养
液，以３％的接种量接入 ＭＲＳ液体培养基中，于３７
℃培养箱中培养３６ｈ，每隔２ｈ取一次样品，放于４
℃冰箱中，最后以培养基为空白，在６２０ｎｍ下测定
样品的吸光度值，以培养时间为横坐标，相对应的吸
光值为纵坐标，绘制生长曲线。
１．１０青贮发酵化学成分测定 取青贮样品２０
ｇ，加入１８０ｍＬ去离子水中，搅拌摇匀，放入４℃冰
箱中静置２４ｈ，取出用４层粗纱布过滤到烧杯中，再
用定量滤纸过滤到三角瓶中，再用ｐＨ测定仪（雷磁
ＰＨＳ－３Ｃ）测定滤液ｐＨ 值；采用滴定法测定青贮原
料的缓冲能［１１］；采用苯酚－次氯酸钠比色法测定氨
态氮（ＮＨ３－Ｎ）含量［１２］；采用烘箱干燥法测定干物质
（ＤＭ）含量；采用凯氏定氮法测定粗蛋白质（ＣＰ）含
量［１３］；采用范氏洗涤纤维法测定中性洗涤纤维
（ＮＤＦ）、酸性洗涤纤维（ＡＤＦ）含量［１４］；采用蒽酮－硫
酸比色法测定可溶性碳水化合物（ＷＳＣ）含量［１５］；使
用ＳＨＩＭＡＤＺＥ－１０Ａ型高效液相色谱仪检测滤液中
的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量［１６］。青贮饲料品质评
价采用弗氏Ｆｌｉｅｇ评分法［１７－１８］。
１．１１数据分析 基础数据整理用Ｅｘｃｅｌ软件，用
ＳＡＳ（１２．０版）软件程序对数据进行方差分析。
２ 结果与分析
２．１分离乳酸菌生化鉴定 从新鲜尖叶胡枝子
材料中分离出２株乳酸菌，分别编号为 ＬＨ２９和
ＬＨ３３，显微镜观察发现ＬＨ２９为球菌，ＬＨ３３为杆
菌。对这２株乳酸菌进行生化试验（表１）和糖发酵
试验（表２）。菌株ＬＨ２９革兰氏阳性，过氧化氢酶
阴性，发酵葡萄糖不产气，属同型乳酸发酵类型，４５
℃生长，可发酵葡萄糖、木糖、果糖、熊果甘、核糖、海
藻糖，不能发酵山梨醇，与戊糖片球菌发酵特性相
似，故将ＬＨ２９初步鉴定为戊糖片球菌（Ｐｅｄｉｏｃｏｃ－
ｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）［１９］。菌株ＬＨ３３革兰氏阳性，能够
发酵苦杏仁甙、纤维二糖、七叶灵、果糖、葡萄糖、麦
芽糖、乳糖、甘露糖、甘露醇、蜜二糖、棉籽糖、核糖、
山梨醇、蔗糖和海藻糖，不能发酵鼠李糖，与植物乳
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ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．０４） ０４／２０１２
表１ 分离菌株生理生化特性
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ
特性
Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ
菌株编号Ｓｔｒａｉｎｓ Ｎｏ．
ＬＨ２９ ＬＨ３３
形状Ｓｈａｐｅ 球形Ｃｏｃｃｕｓ 杆状Ｒｏｄ
革兰氏染色Ｇｒａｍ ｓｔａｉｎ ＋ ＋
过氧化氢酶反应Ｃａｔａｌａｓｅ － －
发酵类型Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ 同型 Ｈｏｍｏ 同型 Ｈｏｍｏ
生长温度
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ／℃
４ ｗ ｗ
１０ ＋ ＋
４０ ＋ ＋
４５ ＋ ＋
ｐＨ值
ｐＨ ｖａｌｕｅ
３．０ ｗ ｗ
３．５ ｗ ＋
４．０ ＋ ＋
４．５ ＋ ＋
５．０ ＋ ＋
７．０ ＋ ＋
７．５ ＋ ＋
８．０ ＋ ｗ
含盐量
ＮａＣｌ／％
３．０ ＋ ＋
６．５ ＋ ＋
注：＋为阳性，ｗ为弱阳性，－为阴性。下同。
Ｎｏｔｅ：＋ｍｅａｎｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ；－ｍｅａｎｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ；ｗ ｍｅａｎｓ ｗｅａｋｌｙ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
杆菌发酵特性相似，故将ＬＨ３３初步鉴定为植物乳
杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）。
２．２分离菌株１６ＳｒＲＮＡ 基因序列分析 菌
株ＬＨ２９和ＬＨ３３经ＰＣＲ扩增所获得的１６ＳｒＲＮＡ
基因部分序列长度分别为１ ４８１和１ ４７４ｂｐ。在
ＧｅｎＢａｎｋ中进行１６ＳｒＲＮＡ基因同源性序列比对，
结果显示，分离菌株 ＬＨ２９与多株Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ
菌株的１６ＳｒＲＮＡ基因序列相似性均达９９％，与菌
株Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＭＪＫ７（登录号ＡＢ４９４７２２．１）的同
源性达１００％；经比对菌株ＬＨ３３与多株Ｌ．ｐｌａｎｔａ－
ｒｕｍ菌株的１６ＳｒＲＮＡ 基因序列相似性均超过
９９％，利用 ＭＥＧＡ４．０软件将分离菌株与部分参考
菌株（表３）基于１６ＳｒＲＮＡ基因序列构建系统发育
树（图１），结合菌株形态学及生化特性，可将菌株
ＬＨ２９和ＬＨ３３分别鉴定为戊糖片球菌和植物乳杆
菌。
２．３分离菌株产酸速率和生长速度比较 菌
株ＬＨ２９和ＬＨ３３是从新鲜的尖叶胡枝子上分离的
两株乳酸菌，它们的产酸能力和生长速度对青贮品
质有很大影响。比较ＬＨ２９和ＬＨ３３的产酸速率
（图２）发现，０～４ｈＬＨ２９的ｐＨ值下降的速度略快
于ＬＨ３３，而ＬＨ３３在发酵６～１２ｈｐＨ值下降趋势
比ＬＨ２９更为明显，ＬＨ３３和ＬＨ２９在发酵１２ｈ后
的ｐＨ值分别达到４．２和４．４。
菌株ＬＨ２９和ＬＨ３３生长迅速，几乎观察不到
迟缓期（图３），很快进入对数生长期（２～８ｈ），１０ｈ
后生长趋于平缓，进入生长稳定期，培养到３６ｈ未
见到衰退期。比较而言，对数生长时期ＬＨ２９生长
速度较ＬＨ３３快，对应产生乳酸较多，ｐＨ值下降较
快；而进入生长稳定期后，菌株ＬＨ３３的吸光值高于
ＬＨ２９，同时对应的ＬＨ３３的ｐＨ值也要低于ＬＨ２９。
表２ 分离株菌的糖发酵结果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｕｇａｒｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ
发酵产物
Ｆｅｒｍｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
ＬＨ２９ ＬＨ３３
甘油 Ｇｌｙｃｅｒｉｎ － －
Ｄ－阿拉伯糖 Ｄ－Ａｒａｂｉｎｏｓｅ － ＋
Ｌ－阿拉伯糖Ｌ－Ａｒａｂｉｎｏｓｅ ＋ ＋
核糖 Ｒｉｂｏｓｅ ＋ ＋
Ｄ－木糖 Ｄ－Ｘｙｌｏｓｅ ＋ －
Ｌ－木糖Ｌ－Ｘｙｌｏｓｅ － －
葡萄糖 Ｇｌｕｃｏｓｅ ＋ ＋
果糖Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ＋ ＋
甘露糖 Ｍａｎｎｏｓｅ ＋ ＋
山梨糖Ｓｏｒｂｏｓｅ － ＋
鼠李糖 Ｒｈａｍｎｏｓｅ － －
甘露醇 Ｍａｎｎｉｔｏｌ ＋ ＋
山梨醇Ｓｏｒｂｉｔｏｌ － ＋
苦杏仁甙 Ａｍｙｇｄａｌｉｎ ＋ ＋
熊果苷 Ａｒｂｕｔｉｎ ＋ ＋
七叶灵 Ｅｓｃｕｌｉｎ ＋ ＋
纤维二糖Ｃｅｌｏｂｉｏｓｅ ＋ ＋
麦芽糖 Ｍａｌｔｏｓｅ ＋ ＋
乳糖Ｌａｃｔｏｓｅ － ＋
蜜二糖 Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ － ＋
蔗糖Ｓｕｃｒｏｓｅ － ＋
海藻糖Ｆｕｃｏｓｅ ＋ ＋
松三糖 Ｍｅｌｅｚｉｔｏｓｅ － ＋
棉籽糖 Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ － ＋
淀粉Ｓｔａｒｃｈ － －
葡萄糖酸盐 Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ｗ ＋
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０４／２０１２ 草 业 科 学 （第２９卷０４期）
图１ 分离菌株１６ＳｒＲＮＡ序列系统进化树
Ｆｉｇ．１ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ １６ＳｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ
图２ 分离株菌产酸速率曲线
Ｆｉｇ．２ Ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ
ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ
图３ 分离株菌生长曲线
Ｆｉｇ．３ Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ
ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ
表３ 构建系统进化树的乳酸菌参考菌株
Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ
菌种名称
Ｎａｍｅ
菌株号
Ｃｏｄｅ
序列注册号
ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．
屎肠球菌Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＬＭＧ １１４２３ ＡＪ３０１８３０
耐久肠球菌Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｄｕｒａｎｓ ＤＳＭ ２０６３３ ＡＪ２７６３５４
戊糖片球菌Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ ＤＳＭ ２０３３６ ＡＪ３０５３２１
乳酸片球菌Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ ＤＳＭ ２０２８４ ＡＪ３０５３２０
植物乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＪＣＭ １１４９ ＨＭ１６２４１７
布氏乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ＤＳＭ ２００５７ Ｍ５８８１１
短乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＡＴＣＣ １４８６９ Ｍ５８８１０
弯曲乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ＤＳＭ ２００１９ ＡＭ１１３７７７
草乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ＤＳＭ ２０７１９ ＡＭ１１３７７８
干酪乳杆菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ ＡＴＣＣ ３９３ ＡＦ４６９１７２
乳眀串珠菌Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｌａｃｔｉｓ ＪＣＭ ６１２３ ＡＢ０２３９６８
融合魏斯氏菌Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｃｏｎｆｕｓａ ＪＣＭ １０９３ ＡＢ０２３２４１
类肠膜魏斯氏菌Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＮＲＩＣ １５４２ ＡＢ０２３２３８
枯草芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＤＯ １７６９ Ｘ６０６４６
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表４ 尖叶胡枝子青贮发酵过程中微生物数量的变化
Ｔａｂｌｅ ４ Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｆｌｏｒａ ｉｎ Ｌ．ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ ｓｉｌａｇｅｓ ｌｏｇ ｃｆｕ·ｇ－１
处理区
Ｔｒｅａｍｅｎｔ
乳酸菌Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ
第２天
Ｔｈｅ ２ｎｄ ｄａｙ
第５天
Ｔｈｅ ５ｔｈ ｄａｙ
第１０天
Ｔｈｅ １０ｔｈ ｄａｙ
第３０天
Ｔｈｅ ３０ｔｈ ｄａｙ
好氧细菌Ａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ
第２天
Ｔｈｅ ２ｎｄ ｄａｙ
第５天
Ｔｈｅ ５ｔｈ ｄａｙ
第１０天
Ｔｈｅ １０ｔｈ ｄａｙ
第３０天
Ｔｈｅ ３０ｔｈ ｄａｙ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ７．６１ｃ ７．２６ｂ ７．９６ａ ７．５５ａ ８．１３ｂ ８．９５ａ ７．８９ａ ８．００ａ
ＳＬ ７．６６ｂｃ ７．６２ａｂ ７．８０ａ ７．５７ａ ８．７０ａｂ ８．７４ｂ ７．９９ａ ７．９４ａ
ＡＣ ９．１８ａ ６．７４ｃ ７．９４ａ ７．４１ａ ９．３０ａ ９．０８ａ ８．１８ａ ７．６３ａｂ
ＳＬ＋ＡＣ ７．８２ｂ ７．８１ａ ７．８５ａ ７．５４ａ ８．１８ｂ ９．００ａ ８．０４ａ ７．４８ｂ
处理区
Ｔｒｅａｍｅｎｔ
酵母菌和霉菌Ｙｅａｓｔｓ ａｎｄ ｍｏｌｄｓ
第２天
Ｔｈｅ ２ｎｄ ｄａｙ
第５天
Ｔｈｅ ５ｔｈ ｄａｙ
第１０天
Ｔｈｅ １０ｔｈ ｄａｙ
第３０天
Ｔｈｅ ３０ｔｈ ｄａｙ
大肠杆菌Ｃｏｌｏｎ ｂａｃｉｌｕｓ
第２天
Ｔｈｅ ２ｎｄ ｄａｙ
第５天
Ｔｈｅ ５ｔｈ ｄａｙ
第１０天
Ｔｈｅ １０ｔｈ ｄａｙ
第３０天
Ｔｈｅ ３０ｔｈ ｄａｙ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ８．５４ｃ ８．７４ａ ８．３９ａ ７．８９ａｂ ８．００ｂ ８．６５ｃ ７．９４ｃ ５．７０ａ
ＳＬ ８．８５ｂ ９．０８ａ ８．２２ａｂ ８．０４ａ ８．０８ｂ ８．８８ｂｃ ８．０４ｂｃ ３．６５ｃ
ＡＣ ９．９８ａ ９．０２ａ ８．２２ａｂ ７．７３ｂ ９．８５ａ ９．２９ａ ８．４４ａ ４．７０ｂ
ＳＬ＋ＡＣ ８．１１ｄ ８．９５ａ ８．０４ｂ ７．８８ａｂ ８．０８ｂ ９．００ａｂ ８．１５ｂ ３．５４ｃ
注：表中同列不同小写字母表示平均数差异显著（Ｐ＜０．０５）。下同。
Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒ ｃａｓｅ ｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｍｅａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０．０５ｌｅｖｅｌ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
在设定的试验条件下，菌株ＬＨ３３的生长情况和产
酸能力比ＬＨ２９要好。
２．４青贮过程中微生物数量的变化 自然条
件下生长的饲草表面附生着大量微生物，试验测得
每克尖叶胡枝子上附生的乳酸菌数量为３．７０ｃｆｕ，
好氧细菌为５．６０ｃｆｕ，酵母菌与霉菌为６．６５ｃｆｕ，大
肠杆菌为３．９０ｃｆｕ，乳酸菌的数量远少于霉菌、酵
母、好氧细菌以及大肠杆菌的数量，原料表面附生的
乳酸菌数均未达到良好发酵所需的１０５ｃｆｕ·ｇ－１的最
低水平［２０］。尖叶胡枝子发酵过程中微生物数量的
动态变化如表４所示，在发酵第２天，添加ＡＣ处理
组的乳酸菌数量最多，ＳＬ＋ＡＣ添加组的乳酸菌的
数量显著高于对照组（Ｐ＜０．０５）；第５天，ＡＣ添加
组乳酸菌数量下降很快，显著低于其他添加组及对
照组（Ｐ＜０．０５）；在第１０天至第３０天，乳酸菌数量
无明显变化，维持在１０７～１０８ ｃｆｕ·ｇ－１，各组间无显
著性差异（Ｐ＞０．０５）。好氧细菌在发酵的第２天和
第５天数量较多，后缓慢下降，第３０天，ＳＬ＋ＡＣ添
加组好氧细菌数量显著低于对照和ＳＬ添加组（Ｐ＜
０．０５）。酵母菌和霉菌在发酵的第２天，ＡＣ添加组
数量最多，显著高于其他组（Ｐ＜０．０５），以后数量逐
渐减少，在发酵第３０天，ＳＬ添加组酵母菌和霉菌数
量显著高于ＡＣ添加组。大肠杆菌数量在发酵最初
几天数量较多，在发酵第３０天，各处理组大肠杆菌
数量从１０８ ｃｆｕ左右迅速下降为１０４ ｃｆｕ左右，对照
组的大肠杆菌数量显著高于其他添加组（Ｐ＜
０．０５）。
２．５尖叶胡枝子青贮发酵品质 尖叶胡枝子青
贮发酵品质结果显示（表５），与对照相比，添加ＳＬ
和ＳＬ＋ＡＣ处理的ｐＨ 值显著低于对照组（Ｐ＜
０．０５），添加ＡＣ处理的ｐＨ 值也低于对照组，但差
异不显著（Ｐ＞０．０５）；添加ＳＬ、ＡＣ及ＳＬ＋ＡＣ处理的
乳酸含量均显著增加（Ｐ＜０．０５）；添加ＡＣ及ＳＬ＋ＡＣ
处理的乙酸含量显著低于对照组（Ｐ＜０．０５）；添加
ＡＣ处理的丙酸生成量显著高于对照及其他处理，
ＳＬ＋ＡＣ处理丙酸的生成量最少；对照组的丁酸含量
显著高于其他处理（Ｐ＜０．０５）；添加ＳＬ和ＳＬ＋ＡＣ
处理的总酸含量显著高于对照组和添加ＡＣ组（Ｐ＜
０．０５）；对照组的氨态氮含量最高，添加ＳＬ＋ＡＣ处理
的氨态氮含量显著低于ＳＬ和ＡＣ处理组。
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０４／２０１２ 草 业 科 学 （第２９卷０４期）
表５ 尖叶胡枝子青贮饲料的发酵品质
Ｔａｂｌｅ ５ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌ．ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ ｓｉｌａｇｅｓ
处理
Ｔｒｅａｍｅｎｔ
ｐＨ值
ｐＨ ｖａｌｕｅ
乳酸
ＬＡ／％
乙酸
ＡＡ／％
丙酸
ＰＡ／％
丁酸
ＢＡ／％
总酸
ＴＡ／％
氨态氮∶总氮
ＡＮ∶ＴＮ／％
Ｃｏｎｔｒｏｌ ５．５０ａ ０．８５ｂ １．０６ａ ０．０５ｂ ０．１２ａ ２．０８ｂ ５．０８ａ
ＳＬ ５．２４ｂ １．６５ａ ０．８８ａｂ ０．０３ｂｃ ０．０３ｂ ２．５１ａ ４．２２ｃ
ＡＣ ５．４１ａｂ １．５２ａ ０．５４ｂ ０．１１ａ ０．０３ｂ ２．２０ｂ ４．６１ｂ
ＳＬ＋ＡＣ ５．２１ｂ １．７０ａ ０．６７ｂ ０．０１ｃ ０．０１ｂ ２．３９ａ ３．６８ｄ
２．６尖叶胡枝子青贮饲料化学成分 尖叶胡
枝子青贮饲料化学成分（表６）显示，各处理组的干
物质含量无显著差异（Ｐ＞０．０５）；ＳＬ、ＡＣ及ＳＬ＋
ＡＣ处理的可溶性碳水化合物含量显著高于对照
（Ｐ＜０．０５）；各添加组的中性洗涤纤维含量显著低
于对照组（Ｐ＜０．０５）；添加 ＡＣ处理的酸性洗涤纤
维含量显著低于对照及其他处理（Ｐ＜０．０５）；添加
ＳＬ处理的粗蛋白含量与添加 ＡＣ处理无显著差异
（Ｐ＞０．０５），但显著高于对照及ＳＬ＋ＡＣ处理（Ｐ＜
０．０５）；ＳＬ＋ＡＣ处理的粗脂肪含量显著高于对照和
其他处理。
２．７青贮品质评价 对照组中乙酸占总酸的比
表６ 尖叶胡枝子青贮饲料的化学成分
Ｔａｂｌｅ ６ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌ．ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ ｓｉｌａｇｅｓ ％
处理
Ｔｒｅａｍｅｎｔ
干物质
ＤＭ
可溶性碳水化合物
ＷＳＣ
中性洗涤纤维
ＮＤＦ
酸性洗涤纤维
ＡＤＦ
粗蛋白
ＣＰ
粗脂肪
ＥＦ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ３４．６ａ １．０１ｃ ６０．４３ａ ５１．０８ａ １３．９０ｂ １．９０ｂ
ＳＬ ３３．９ａ １．１２ｂ ５７．５３ｃ ４７．１０ｂ １４．８７ａ １．９８ｂ
ＡＣ ３４．０ａ １．３０ａ ５９．０１ｂ ４５．１１ｃ １４．１０ａｂ ２．１２ｂ
ＳＬ＋ＡＣ ３５．５ａ １．２８ａ ５９．０６ｂ ４７．７６ｂ １３．７０ｂ ２．５５ａ
例高于５０％，表现为乙酸发酵类型。而添加剂处理
组中乳酸占总酸的比例均高于６０％，表现为乳酸发
酵类型（表７）。
根据弗氏Ｆｌｉｅｇ评分法和各种有机酸占总酸的
比例，对各处理的青贮品质进行评分（表８），对照组
的青贮品质为劣，ＳＬ处理组为良，ＡＣ处理组和
ＳＬ＋ＡＣ处理组得分为优。
３ 讨论
自然环境下，不同作物上附生的乳酸菌无论从
表７ 尖叶胡枝子青贮有机酸占总酸比例
Ｔａｂｌｅ ７ Ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｏｔａｌ ａｃｉｄ ｏｆ
Ｌ．ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ ｓｉｌａｇｅｓ ％
处理
Ｔｒｅａｍｅｎｔ
乳酸／总酸
ＬＡ／ＴＡ
乙酸／总酸
ＡＡ／ＴＡ
丙酸／总酸
ＰＡ／ＴＡ
丁酸／总酸
ＢＡ／ＴＡ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ４０．８７ ５０．９６ ２．４０ ５．７７
ＳＬ ６５．７４ ３１．８７ １．２０ １．２０
ＡＣ ６９．０９ ２４．５５ ５．００ １．３６
ＳＬ＋ＡＣ ７１．１３ ２８．０３ ０．４２ ０．４２
表８ 尖叶胡枝子青贮饲料的Ｆｌｉｅｇ评价
Ｔａｂｌｅ ８ Ｆｌｉｅｇ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ．ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ ｓｉｌａｇｅｓ
处理
Ｔｒｅａｍｅｎｔ
乳酸得分
Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｇｒａｄｅ
乙酸得分
Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｇｒａｄｅ
丁酸得分
Ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｇｒａｄｅ
总分
Ｔｏｔａｌ ｇｒａｄｅ
等级
Ｒａｎｋ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ８ １ １５ ２４ 劣ｉｎｆｅｒｉｏｒ
ＳＬ ２０ １０ ５０ ８０ 良ｇｏｏｄ
ＡＣ ２４ １５ ５０ ８９ 优ｅｘｃｅｌｅｎｔ
ＳＬ＋ＡＣ ２５ １３ ５０ ８８ 优ｅｘｃｅｌｅｎｔ
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ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．０４） ０４／２０１２
种类上还是数量上都是不同的，其种类和数量对青
贮的发酵品质有较大的影响。本研究从新鲜的尖叶
胡枝子上分离出２株乳酸菌，分别是戊糖片球菌和
植物乳杆菌。从这２株菌的生长曲线及产酸速率曲
线上看，戊糖片球菌在青贮发酵初期生长速度及产
酸速率优于植物乳杆菌，在发酵中后期植物乳杆菌
表现更好。植物乳杆菌产酸能力强、生长速度快，适
合作青贮饲料乳酸菌添加剂的菌种。研究表明，青
贮饲料发酵初期，片球菌起着非常重要的作用［２１］。
实际应用情况表明，由于不同乳酸菌菌株在青贮过
程中起的作用不同，单独使用一种菌株有时并不能
达到让人满意的青贮效果，乳酸菌青贮添加剂通常
都是植物乳杆菌和其他菌种结合组成的混合物，一
般情况下，选用乳酸球菌，乳酸球菌在发酵初期繁殖
旺盛，乳酸杆菌则在发酵的整个过程中起到了主导
作用。
青贮原料发酵开始后，由于各种微生物利用原
料中的糖分生长繁殖，数量较青贮原料上的有较大
的增长，在尖叶胡枝子发酵过程中，添加纤维素酶处
理的乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌、大肠杆菌在
发酵最初都保持较高数量，这可能与原料用粉碎机
粉碎及纤维素酶可破坏青贮料细胞壁使其内容物流
出［２２］，为各类微生物生长提供充足底物有关系。到
发酵后期，由于乳酸菌利用可溶性糖发酵，降低了
ｐＨ值，抑制了酵母菌和霉菌、大肠杆菌的生长，其
数量下降很快，同时乳酸菌的数量也有一定减少。
从试验结果看，直接青贮ｐＨ值较高，氨态氮及
丁酸生成量较多，乳酸含量少，Ｆｌｉｅｇ青贮饲料评分
等级为劣，这可能是由于尖叶胡枝子属于豆科牧草，
缓冲能较高，可溶性碳水化合物含量较少，未能达到
调制优质青贮饲料所需要的８％～１０％含量［２３］，同
时原料草表面附着乳酸菌数量很少，且不良菌种（酵
母菌、霉菌和好氧细菌等）的数量远高于乳酸菌的数
量。本试验选用的２种添加剂因其主要成分为乳酸
菌和纤维素酶，保证了青贮发酵初期发酵所需的足
够乳酸菌数量及可溶性糖含量，并通过乳酸菌发酵
产生大量乳酸降低了ｐＨ 值，抑制了不良微生物的
活动，提高了粗脂肪含量，降低了粗蛋白降解，减少
了发酵过程中营养物质的损失，改善了青贮饲料的
发酵品质。
４ 结论
从新鲜尖叶胡枝子原料中分离出２株乳酸菌，
一株为植物乳杆菌，另一株为戊糖片球菌。在发酵
初期戊糖片球菌产酸速率优于植物乳杆菌，在发酵
中后期后者产酸速率优于前者。
在尖叶胡枝子青贮过程中，纤维素酶添加组的
乳酸菌数量在贮藏后第２天达到最大值，其他组在
第１０天达到最大值，然后缓慢下降，发酵第３０天，
乳酸菌的数量维持在１０７ ｃｆｕ左右，好氧细菌、酵母
菌、霉菌及大肠杆菌的数量也有所减少，大肠杆菌减
少更明显。
添加剂处理组与对照组相比，ｐＨ值、氨态氮及
丁酸含量显著降低（Ｐ＜０．０５），乳酸含量明显提高
（Ｐ＜０．０５），发酵品质好于对照，其中添加纤维素酶
及乳酸菌和纤维素酶混合添加处理的青贮饲料发酵
品质Ｆｌｉｅｇ等级为优。
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ｅｎｓｉｌｉｎｇ Ｌｅｓｐｅｄｅｚａ ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ
ＳＩ Ｂｉｎｇ－ｗｅｎ１，ＷＡＮＧ Ｚｏｎｇ－ｌｉ ２，ＳＵＮ Ｑｉ－ｚｈｏｎｇ２，Ｚｈａｎｇ Ｈｕｉ－ｊｉｅ１，Ｌｉ Ｆｅｎｇ２
（１．Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｇｒａｓｓｌａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＡＡＳ，Ｈｏｈｈｏｔ ０１００１０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ（ＬＡＢ）ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ Ｌｅｓｐｅｄｅｚａ ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ，ａｎｄ
Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ（ＬＨ２９﹚ａｎｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｉｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＬＨ３３）ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ １６ＳｒＲＮＡ ｍｅｔｈ－
ｏｄ ａｎｄ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｃｉｄ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＬＨ２９ｗａｓ
ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＬＨ３３ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｅｎｓｉｌｉｎｇ，ｂｕｔ ｔｈｅ ＬＨ３３ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ＬＨ２９ｉｎ ｔｈｅ ｌａｔｅｒ
ｓｔａｇｅｓ．ＳＮＯＷ ＬＡＣＴ－Ｌ（ＳＬ）ａｎｄ Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ＡＣ）ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ ｔｏ Ｌ．ａ ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ
ｓｉｌａｇｅ．Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ，ＬＡＢ ｉｎ ＳＬ＋ＡＣ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｗａｓ ｂｉｇｇｅｒ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ
ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉｌａｇｅ（ＣＫ）ａｆｔｅｒ ｔｗｏ ｄａｙｓ ｏｆ ｅｎｓｉｌｉｎｇ（Ｐ＜０．０５）．Ｏｎ ｔｈｅ ｔｈｉｒｔｉｅｔｈ ｄａｙ，ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ａｅｒｏｂｉｃ
ｂａｃｔｅｒｉａ，ｙｅａｓｔｓ，ｍｏｌｄｓ ａｎｄ Ｅ．ｃｏｌｉ ｉｎ ａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｅｃｌｉｎｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜
０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＣＫ，ａｌ ｔｈｅ ｓｉｌａｇｅｓ ｗｉｔｈ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｌｏｗｅｒ ｐＨ，ＮＨ３－Ｎ，ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ ｓｉｌａｇｅ ｑｕａｌｉｔｙ
ｗａｓ ｇｒａｄｅｄ ｂａｓｉｎｇ ｏｎ Ｆｌｉｅｇ ｓｃｏｒｅ：ＡＣ＞ＳＬ＋ＡＣ＞ＳＬ＞ＣＫ．Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ Ｆｌｉｅｇ ｐｏｉｎｔ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ
ｔｅｓｔｓ ｗｉｔｈ ＡＣ ａｎｄ ＳＬ＋ＡＣ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｅｓｐｅｄｅｚａ ｈｅｄｙｓａｒｏｉｄｅｓ；ｓｉｌａｇｅ；ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｑｕａｌｉｔｙ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＷＡＮＧ Ｚｏｎｇ－ｌｉ Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｚｏｎｇｌｉ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
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