全 文 ：研究报告
Research Report
水葫芦苗 ISSR-PCR 体系的优化与引物筛选
王建科 1,2 李毅 1 胡延萍 1 石琳 1,2 王钧 1,2 王莉 1*
1 中国科学院西北高原生物研究所, 西宁, 810008; 2 中国科学院大学, 北京, 100049
*通讯作者, wangli@nwipb.cas.cn
摘 要 以改良 CTAB 法提取水葫芦苗基因组 DNA 为模板，利用正交设计试验对影响 ISSR-PCR 反应体
系的 5 个因素(Taq DNA 聚合酶, dNTP, 引物, 模板及 Mg2+)进行了优化筛选。经极差分析和方差分析，最
终建立了水葫芦苗 ISSR-PCR 的最佳反应体系。结果表明，总体积 20µL 的反应体系中各因素浓度分别为：
TaqDNA 聚合酶 0.025U/µL，Mg2+1.5mmol/L，dNTP1.0mmol/L，引物 0.5µmol/L，模板 DNA 1.5ng/µL。通
过筛选得到 10 条扩增条带清晰的 ISSR 引物，并通过梯度 PCR 确定了各引物的最适退火温度。在此基础
上对循环次数进行优化，最终确定最佳循环次数为 40 次。
关键词 水葫芦苗, ISSR-PCR, 正交设计, 体系优化
Optimization of ISSR-PCR Reaction System and Primer Screening
ofHalerpestescymbalaris
Wang Jianke1,2 Li Yi1 Hu Yanping1 Shi Lin1,2 Wang Jun1,2 Wang Li1,*
1 Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining, 810008; 2 University of Chinese Academy of
Sciences, Beijing, 100049
* Corresponding author, wangli@nwipb.cas.cn
Abstract The genome DNA of Halerpestescymbalaris was extracted by the improved CTAB method.The
orthogonal design method was used to the ISSR-PCR system of H. cymbalarisat four levels of five factors (the
concentration of Taq DNA polymerase, dNTPs, primer, template DNA and magnesium ion).The results were
analyzed using the range analysis and variance analysis.A suitable system of the ISSR-PCR reaction of H.
cymbalaris was established which contained 0.025U/µL Taq polymerase,1.5mmol/L magnesium
ion,1.0mmol/LdNTPs,0.5µmol/L primer and 1.5ng/µL template DNA in total 20µL reaction.Ten ISSR primers

项目基金：本研究由青海省科技计划项目(2014-NK-A4-2-1)和国家自然科学基金项目(31300269)共同资助

网络出版时间：2016-12-27 14:29:35
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20161227.1429.002.html
with clear bands were selected.And the annealing temperature of each primer was determined by the gradient
PCR.On these bases, the optimum cycles were determined.The optimum cycles were 40 times.
Keywords Halerpestescymbalaris,ISSR-PCR, Orthogonal design,System optimization
水葫芦苗(Halerpestescymbalaris)为毛茛科碱毛茛属多年生草本植物，多生长于海拔 2200~3900m 的
林下、林缘湿地、河漫滩、河边、沼泽草甸和阴坡的潮湿地中，分布于青海、西藏、甘肃、四川、陕西、
河北、内蒙古、新疆、山东、黑龙江、吉林、辽宁等省区(王文采等, 1980)。水葫芦苗全草可以入药，具有
利水消肿，祛风除湿等功效，是一种重要的湿地经济植物(郭本兆等, 1987, 青海经济植物志, pp.169-170)，
水葫芦苗的生长状况可为湿地健康诊断提供依据(周华坤等, 2004)。目前，对水葫芦苗的研究较少，国内的
报道中仅涉及其生长特性及形态学等方面的研究，而在分子生物学水平上对水葫芦苗的研究国内外未见报
道。ISSR(inter-simple sequence repeats)是一种微卫星基础上的 DNA 分子标记技术，该技术主要扩增两个距
离较近的 SSR 间的序列，现已广泛用于植物的分类学鉴定、基因定位、遗传图谱构建和遗传多样性分析等
方面(杨晶和张广臣, 2013)。本研究利用正交设计方法对水葫芦苗 ISSR-PCR 体系中 5 个因子进行了优化，
以建立最优的 ISSR-PCR 扩增反应体系，并通过优化建立适合水葫芦苗 ISSR-PCR 的最佳反应程序，筛选
得到扩增特异性较高的 ISSR 引物，为进一步利用 ISSR 法对水葫芦苗遗传多样性研究提供理论基础。
1 结果与分析
1.1 水葫芦苗基因组 DNA 提取
获得的基因组 DNA 用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，如图 1 所示，条带清晰无拖尾，说明用改良 CTAB
法提取的 DNA 完整性较好。



图 1 水葫芦苗基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳
注: 1~10 分别为不同水葫芦苗个体
Figure 1 Electrophoresis on agarose gel of genomic DNA of Halerpestescymbalaris
Note: Lanes 1~10 represent the individuals of Halerpestescymbalaris
用 NanoDrop 2000c 微量分光光度计测得 DNA 溶液浓度在 200ng/µL 左右，OD260/OD280 比值在 1.8~2.0
之间，说明 DNA 样品杂质较少，可以用于后期的 ISSR-PCR 扩增反应。
1.2 ISSR-PCR 正交试验结果分析
ISSR-PCR 正交试验结果如图 2 所示，不同处理结果之间有明显差异，对其进行评分后，选择最佳体
系。依据评分结果计算每因素同水平下的评分之和 T 及每因素同水平下的评分的平均值 Ai，对每一因素不
同水平间进行极差分析(表 1)。极差 R 的大小表示该因素对结果的影响程度。R 值越大，该因素的影响越
显著，反之亦然。各因素极差值依次为：dNTP>引物>Taq DNA 聚合酶>模板 DNA>Mg2+，所以在本试验中
对扩增条带特异性影响最大的因素是 dNTP。对正交试验结果进行方差分析(表 2)，结果表明，dNTP 浓度
对应的 F 值(P<0.05)最大，说明其对体系的影响作用最强；其他因素对反应体系的影响依次为：引物>Taq
DNA 聚合酶>模板 DNA 浓度>Mg2+浓度，但后四个因素对反应体系的影响均未达到显著水平。
经过方差分析可知，只有 dNTP 这一因素对扩增结果的影响达到了显著水平，所以依据极差分析平均
值 Ai 的大小选择每一因素的最佳水平，最大平均值所对应的水平即为该因素的最佳水平。
由图 3 关系波动曲线可知，Taq DNA 聚合酶对扩增结果的影响不明显，但是，当 Taq 酶量过高时会使
电泳条带背景过深，不利于分析，所以 Taq 酶在 0.025 U/µL 时体系反应效果最佳，因此选择 0.025 U/µL
水平为最佳反应水平。从关系曲线的波动幅度可知，随着镁离子浓度的增加扩增效果呈下降趋势，选择最
大平均值对应的水平作为最佳反应水平，所以在本试验反应体系中 Mg2+的最佳反应水平为 1.5 mmol/L。
dNTP 在 0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L 三个水平之间差异显著，1.0 mmol/L 和 1.25 mmol/L 之间
差异不显著。当 dNTP 浓度在 0.5 mmol/L~1.0 mmol/L 时，结果呈上升趋势，当浓度继续增大时逐步下降。
所以选择 dNTP 的最佳浓度为 1.0mmol/L。
引物在四水平之间差异均不显著，但从关系曲线可以看出当引物浓度增大时扩增效果会增强，但引物
浓度太大会导致非特异性扩增增加，且扩增条带模糊，所以选择最适引物浓度为 0.5 µmol/L。
模板 DNA 在各水平之间差异不显著，随着浓度增加扩增效果降低，在 1.5 ng/µL 和 2.0 ng/µL 条件下
扩增结果差别不大，所以选择 2.0 ng/µL 为模板 DNA 的最佳量。所以在本实验 ISSR-PCR 最佳反应体系中，
各因素浓度分别为：TaqDNA 聚合酶 0.025 U/µL，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.1 mmol/L，引物 0.5 µmol/L，
模板 DNA 1.5 ng/µL。








图 2 ISSR-PCR 正交试验电泳(引物为 UBC825)
注: 1~16: 处理序号(见表 4); M1: 100 bp 标准分子量参照物; M2: 200 bp 标准分子量参照物
Figure 2 Results of electrophoresis for ISSR-PCR orthogonal design (UBC825 Primer)
Note: 1~16: Numbers are showed in table 4; M1: 100 bp molecular ladder; M2: 200 bp molecular ladder
表 1 水葫芦苗正交试验极差分析
Table 1 Results of rangeanalysis of orthogonal design of Halerpestescymbalaris
参数
Parameter
Taq 酶
Taq polymerase
镁离子
Mg2+

dNTPs

引物
Primer
模板 DNA
Template DNA
T1 362.67 322.33 272.27 344.17 324.33
T2 304.67 309.66 250.17 275.67 323.60
T3 284.50 306.67 368.67 267.26 288.50
T4 289.93 303.11 350.66 54.67 305.34
A1 30.2225 26.8608 22.6892 28.6808 27.0275
A2 25.3892 25.8050 20.8475 22.9725 26.9667
A3 23.7083 25.5558 30.7225 22.2717 24.0417
A4 24.1608 25.2592 29.2217 29.5558 25.4450
R 6.5142 1.6017 9.8750 7.2842 2.9858
注: T1~T4 为每一因素同一水平下的总和; A1~A4 为每一因素同一水平下的平均值; R 为极差
Note: T1~T4: Sum of every factor under the same level; A1~A4: Mean of every factor under the same level; R: Range
1.3 引物筛选及最适退火温度
在最佳反应体系基础上，分别使用 100 条引物(UBC801~UBC900)对水葫芦苗样本进行扩增，从中选出
扩增条带清晰，多态性丰富的 10 条引物用于后续水葫芦苗遗传多样性分析，引物编号及序列见表 3。
退火温度影响水葫芦苗 ISSR-PCR 的扩增结果。如图 4 所示，以引物 UBC873 和 UBC887 为例，当退火温
度较低时，扩增条带较多但条带模糊，背景较深，扩增特异性不好；当温度较高时，条带较弱，扩增效率
不高，当退火温度在 51.8℃时，两条引物的扩增条带清晰，结果多态性较好，所以这两条引物最适退火温
度都为 51.8℃。其他引物最适退火温度见表 3。


表 2 水葫芦苗 ISSR 各因素方差分析
Table 2 Analysis of variance for factors of ISSR in Halerpestescymbalaris
变异来源
Source
平方和
SS
自由度
df
均方
MS
F 值
F value
P-值
P value
Taqpolymerase 321.2341229 3 107.078041 1.4015 0.2603
Mg2+ 17.49352292 3 5.831174306 0.0763 0.9723
dNTPs 841.4835896 3 280.4945299 3.6714 0.0222
Primer 513.9559229 3 171.318641 2.2424 0.1024
Template DNA 72.7909000 3 24.263600 0.3176 0.8126
Error 2444.8256 32 76.4008









图 3 水葫芦苗 ISSR-PCR 各因素浓度与评分结果均值的关系曲线
Figure 3 Curve between concentration and the mean value of factors for Halerpestescymbalaris











1.4 循环次数筛选以及最佳反应体系验证
以 UBC825 为引物，以筛选到的体系进行扩增，扩增循环次数分别设置为：25×，30×，35×，40×，
45×，对水葫芦苗 DNA 进行扩增，由于在 35×~45×循环之间扩增结果差别不明显，继续以 36×，38×，40×，
42×，44×循环次数进行细筛，结果如图 5 所示，在 40 次循环时扩增结果最好，条带清晰，背景较浅，作
为最佳循环次数。随机选取两个引物以最佳反应体系对水葫芦苗不同样本进行 ISSR-PCR 扩增，结果如图
表 3 筛选到的引物序列及其最适退火温度
Table 3 Sequences and annealing temperature of each selected primer
引物
Primer
序列
Sequences(5´3´)
最适退火温度(℃)
Annealing temperature( )℃
808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 53.8
810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 50.2
811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 55.5
825 ACACACACACACACACT 52.2
826 ACACACACACACACACC 56.8
853 TCTCTCTCTCTCTCTCRT 54.5
864 ATGATGATGATGATGATG 49.4
873 GACAGACAGACAGACA 51.8
887 DVDTCTCTCTCTCTCTC 51.8
891 HVHTGTGTGTGTGTGTG 50.4
注: D=(A,G,T); H=(A, G, T); R=(A,G); V=(A,C,G)

6 所示，扩增条带清晰，多态性丰富，说明筛选到的最优体系稳定，重复性好，可以用于后续试验。





图 4 UBC873 和 UBC887 退火温度试验结果
注: 1~8 泳道为 UBC873; 9~16 泳道为 UBC887; M1: 100 bp 标准分子量参照物; M2: 100 bp 标准分子量参照物
Figure 4The annealing temperature of UBC873 and UBC 887
Note: Lanes 1~8 represent the UBC873; Lanes 9~16 represent the UBC887; M1:100bp molecular ladder; M2:200bp molecular
ladder





图 5 ISSR-PCR 循环次数筛选(引物为 UBC825)
注: 1~5 泳道的循环次数分别为 36, 38, 40, 42, 44; M1:100bp 标准分子量参照物; M2: 100bp 标准分子量参照物
Figure 5 Results of cycle times for ISSR-PCR (UBC825 Primer)
Note: Lanes 1~5 represent the cycle times of 36,38,40,42,44; M1:100bp molecular ladder; M2:200bp molecular ladder






图 6 引物 UBC887 对水葫芦苗不同个体 ISSR-PCR 扩增的结果
注: 1~16 为不同的水葫芦苗个体; M1:100bp 标准分子量参照物; M2: 100bp 标准分子量参照物
Figure 6The application results of Halerpestescymbalaris by UBC887
Note: Lanes 1~16 represent the individuals of Halerpestescymbalaris; M1:100bp molecular ladder; M2:200bp molecular ladder
2 讨论
ISSR 是一种显性遗传标记，由于其操作简单，多态性较好及成本低等优点，已被广泛用药用植物遗传
多样性分析及遗传图谱建立等方面的研究(Qi et al., 2015)。目前关于 ISSR-PCR 反应体系优化方面的报道多
采用单因素试验优化选择(罗海燕和陈业渊, 2007; 刘欢等, 2010; 李瑞等, 2012)，过程复杂，且并未考虑到
各因素之间的交互作用，这可能使得最终结果与最佳反应体系之间存在差异。本试验用正交设计法对水葫
芦苗 ISSR-PCR 体系进行了优化，结果证明，不同的正交体系组合对水葫芦苗 ISSR-PCR 扩增结果具有较
大影响。极差分析和方差分析结果皆显示体系中不同 dNTP 浓度对水葫芦苗 ISSR-PCR 扩增结果具有显著
影响，为主要因素。这与华扁穗草 ISSR-PCR 体系的优化的研究结果一致(包蕊等, 2014)。体系中 Mg2+浓度
会影响 TaqDNA 聚合酶的活性，而 Taq 酶对扩增结果的特异性和扩增速率有较大影响，引物浓度直接影响
扩增产量和错配概率，所以对每种因素选择合适的浓度对扩增结果具有很大的影响，而模板 DNA 量的许
可范围较大，在不同水平上对扩增产物的多态性影响不显著，只影响扩增产量(Xing et al., 2015)。在本研究
中，四个因素对扩增结果的影响大小依次为：dNTP>引物>Taq DNA 聚合酶>模板 DNA>Mg2+，这与穆立蔷
等对紫椴(穆立蔷等, 2006)的研究结果一致。其中 dNTP 浓度对扩增结果有显著影响，而模板 DNA 对扩增
结果的影响并不显著，这与廖丽等对夏枯草 ISSR-PCR 体系(廖丽和郭巧生, 2009)的研究结果一致。Mg2+
浓度、Taq DNA 聚合酶量及引物浓度这 3 个因素对水葫芦苗 ISSR-PCR 扩增结果的影响并不显著，这与紫
云英及果梅等植物(桂腾琴等, 2009; 孙清信等, 2012)中的研究结果不同，这可能是由于物种差异造成的。
循环次数决定着 ISSR-PCR 的扩增效率，循环次数过多会使非特异性产物增加，降低 ISSR-PCR 扩增
特异性；循环次数过少，则会导致扩增产量降低。在本研究中对扩增程序中的循环次数进行了优化，证明
不同的循环次数对扩增结果有明显影响，筛选得到最佳循环次数为 40 次，从而建立了扩增程序。
退火温度也是影响水葫芦苗 ISSR-PCR 扩增结果的重要因素，较低的退火温度可以提高扩增反应的敏
感性，但扩增特异性较差；较高的退火温度可以提高扩增特异性，但扩增效率较差，所以选择合适的退火
温度就尤为重要。本试验梯度 PCR 结果显示不同引物的最适退火温度不同。同一引物在不同物种中的退火
温度可能不同，为了保证实验的可靠性，应该对所用引物的退火温度进行逐一筛选。
本研究利用五因素四水平正交试验方法，对影响水葫芦苗 ISSR-PCR 扩增反应的 5 个因素进行了优化
筛选，并通过极差分析和方差分析，对实验结果进行了统计学对比分析，最终得到水葫芦苗 ISSR-PCR 的
最佳反应体系，即 20 µL 反应体系中，各因素浓度分别为：Taq DNA 聚合酶 0.025 U/µL，Mg2+ 1.5 mmol/L，
dNTP 0.1 mmol/L，引物 0.5 µmol/L，模板 DNA 1.5 ng/µL。通过优化筛选得到水葫芦苗 ISSR-PCR 反应的
最佳循环次数为 40 次。从 100 条引物中筛选到条带清晰稳定的 10 条 ISSR 引物，并确定了各条引物的最
适退火温度；通过对不同水葫芦苗 DNA 样本的扩增结果，证明筛选得到的扩增体系和程序的稳定可靠，
可用于后续水葫芦苗 ISSR-PCR 扩增和遗传多样性分析方面的研究。
3 材料和方法
3.1 材料
水葫芦苗样品于 2012 年 8 月 21 日采自青海省大通县黑泉水库(37°14´39.9´´N/101°27´36.1´´E)，用硅胶
快速干燥后置于-20℃冰箱中保存备用。
ISSR 通用引物使用加拿大哥伦比亚大学(University of British Columbia)提供的序列，由上海生物工程
技术服务有限公司合成。Taq DNA 聚合酶，dNTP，DNA ladder 均购自 TaKaRa 宝生物工程(大连)有限公司。
3.2 水葫芦苗基因组 DNA 提取
水葫芦苗总 DNA 提取采用改良 CTAB 法(Panet al., 2006)，以 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度，利
用 NanoDrop 2000c 微量紫外分光光度计测定其浓度。
3.3 ISSR-PCR 反应体系的优化
用 L16(45)正交试验设计方法对 ISSR-PCR 扩增的 5 个因素(TaqDNA 聚合酶, dNTP,模板 DNA, 引物及
Mg2+)进行了优化筛选。设计见表 4，共 16 个处理，每个处理 3 个技术重复，实验重复三次。以
UBC825(5´-ACACACACACACACACT-3´)为引物，反应体系总体积为 20 µL，扩增程序为：94℃预变性 5min；
94℃变性 20s、53℃复性 60s、72℃延伸 80s，37 个循环；72℃延伸 6min 及 4℃保存(胡延萍等, 2010)。在 1×TAE
电泳缓冲液、4V/cm 电压条件下，用 1.2%琼脂糖凝胶(含 0.5 ng/mL EB)，以 10 µL 上样量对水葫芦苗 PCR
产物电泳检测，ChemiDocTM MP 凝胶成像系统(Bio-Rad, USA)观察电泳结果。
对 16 个处理进行评定，按照亮度、清晰度、条带数以及重复性对条带进行打分，亮度、清晰度和重
复性 3 个评分点最高等级为 10 分，最低为 0 分；条带数评分时，每条带 1 分。每个处理计算总分，三次
技术重复求均值，作为一个处理的评分结果。对评分结果用 DPS 7.05 统计软件进行分析。
表 4 水葫芦苗五因素四水平正交试验设计
Table 4Orthogonal design of L16(45) forHalerpestescymbalaris
编号
No.
TaqDNA 聚合酶(U/µL)
Taqpolymerase(U/µL)
Mg2+(mmol/L) dNTP(mmol/L) 引物(µmol/L)
Primer(µmol/L)
模板 DNA(ng/µL)
Template DNA(ng/µL)
1 0.025 1.50 0.050 0.2 1.5
2 0.025 1.65 0.075 0.3 2.0
3 0.025 1.80 0.100 0.4 2.5
4 0.025 1.95 0.125 0.5 3.0
5 0.030 1.50 0.075 0.4 3.0
6 0.030 1.65 0.050 0.5 2.5
7 0.030 1.80 0.125 0.2 2.0
8 0.030 1.95 0.100 0.3 1.5
9 0.040 1.50 0.100 0.5 2.0
10 0.040 1.65 0.125 0.4 1.5
11 0.040 1.80 0.050 0.3 3.0
12 0.040 1.95 0.075 0.2 2.5
13 0.050 1.50 0.125 0.3 2.5
14 0.050 1.65 0.100 0.2 3.0
15 0.050 1.80 0.075 0.5 1.5
16 0.050 1.95 0.050 0.4 2.0
3.4ISSR-PCR 循环次数筛选
在最佳反应体系基础上，以筛选的引物进行 PCR 扩增，设置不同循环次数(25×, 30×, 35×, 40×, 45×)进
行初步筛选，在相似结果的循环之间设置小梯度进行细筛，扩增产物用 1.2%琼脂糖凝胶检测，选择扩增条
带特异性最好的循环次数。
3.5 ISSR-PCR 引物筛选及退火温度试验
以最优体系对水葫芦苗 DNA 进行扩增，从 UBC801-UBC900 100 条引物中筛选出扩增结果多态性与稳
定性较好的引物，并对筛选出的引物进行退火温度试验，筛选出各个引物的最佳退火温度。以 UBC873 和
UBC887为例，以梯度PCR模式，在每个引物Tm值上下浮动3~5℃的范围设置8个梯度(49℃, 49.5℃, 50.4℃,
51.8℃, 53.5℃, 54.8℃, 55.6℃, 56℃)，温度梯度由仪器随机生成，扩增程序如正交设计试验程序。
3.6 ISSR-PCR 反应体系验证
用 UBC891(5´-AGTACGAGTTGTGTGTGTGTGTG-3´)引物对水葫芦苗不同个体进行 ISSR-PCR 扩增，
对筛选出的最优体系进行稳定性检验。
作者贡献
王建科是本研究的试验设计和试验研究的执行人，并负责数据分析和论文撰写；李毅、胡延萍、石琳
及王钧参与实验材料的收集及前处理等工作；王莉是本研究的通讯作者，主要负责试验方案的构思、论文
修改及最后审阅。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由青海省科技计划项目(2014-NK-A4-2-1)和国家自然科学基金项目(31300269)共同资助。
参考文献
Bao R., Hu Y.P., Wang L., Xu R.H. and Li Y., 2014, Optimization of ISSR-PCR and primer screening for Blysmus sinocompressus,
Zhongguo Caodi Xuebao (Chinese Journal of Grassland), 36(6): 46-52 (包蕊, 胡延萍, 王莉, 旭荣花, 李毅, 2014, 华扁穗
草 ISSR-PCR 反应体系优化及引物筛选, 中国草地学报, 36(6): 46-52)
Gui T.Q., Sun M., Qiao A.M. and Wang X.Y., 2009, Optimization of an ISSR reaction system of Japanese apricot(Prunus mume)
based on orthogonal design, Guoshu Xuebao (Journal of Fruit Science), 26(1): 108-112 (桂腾琴, 孙敏, 乔爱民, 王心燕, 2009,
正交设计优化果梅 ISSR 反应体系, 果树学报, 26(1): 108-112)
Hu Y.P., Xie X.L., Wang L., Yang J. and Li Y., 2010, Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction conditions for Rheum
tanguticum, Guangxi Zhiwu (Guihaia), 30(1): 112-116 (胡延萍, 谢小龙, 王莉, 杨建, 李毅, 2010, 唐古特大黄 ISSR-PCR 反
应条件的优化, 广西植物, 30(1): 112-116)
Li R., Chen S.Y., Ning D.L., Li Y.J. and Mao Y.L., 2012, Optimization of ISSR-PCR reaction system and primer selection for Olea
euyopaea, Anhui Nongye Kexue (Journal of Anhui Agri. Sci.),40(10): 5797-5799 (李瑞, 陈少瑜, 宁德鲁, 李勇杰, 毛云玲,
2012, 油橄榄 ISSR-PCR 反应体系优化与引物筛选, 安徽农业科学, 40(10): 5797-5799)
Liao L. and Guo Q.S., 2009, Estabilishment of ISSR marker technology and optimization of its system in Prunella vularis,
Zhongcaoyao (Chinese Traditional and Herbal Drugs), 40(7): 1131-1135 (廖丽, 郭巧生, 2009, 夏枯草 ISSR 分子标记技术
的建立与体系优化, 中草药, 40(7): 1131-1135)
Liu H., Mu P., Zhao G.Q. and Sun L.K., 2010, Preliminary establishment and optimization of ISSR reaction system for Oat,
Zhongguo Caodi Xuebao (Chinese Journal of Grassland),32(4): 80-85 (刘欢, 慕平, 赵桂琴, 孙丽坤, 2010, 燕麦 ISSR反应体
系的建立与优化, 中国草地学报, 32(4): 80-85)
Luo H.Y., and Chen Y.Y., 2007, Optimization and application of ISSR reaction system in wild Lychee(Litchi chinensis Sonnerat),
Redai Nongye Kexue (Chinese Journal of Tropical Agriculture), 27(1): 19-24 (罗海燕, 陈业渊, 2007, 海南野生荔枝 ISSR 反
应体系优化及应用, 热带农业科学, 27(1): 19-24 )
Mu L.Q., Liu Y.N., Feng F.J. and Yang G.T., 2006, Estabilish and optimization of ISSR-PCR reaction system for Tilia amurensis,
Linye Kexue (Scientia Silvae Sinicae), 42(6): 26-31 (穆立蔷, 刘赢男, 冯富娟, 杨国婷, 2006, 紫椴 ISSR-PCR 反应体系的
建立与优化, 林业科学, 42(6): 26-31)
Pan H., Yang C.P., Wei Z.G. and Jiang J., 2006, DNA extraction of birch leaves by improved CTAB method and optimization of its
ISSR system, Journal of Forestry Research , 17(4): 298-300
QiS.S., Fan Y., Gong Z.N., Yan S.Z., Zhao B.T. and Chen S.L., 2015, Genetic diversity of Shiraia bambusicola from East China
assessed using ISSR markers, Biochemical Systematics and Ecology, 59: 7
Sun Q.X., Chen J. and Lin X.J., 2012, Optimization of ISSRs primer and PCR reaction system for Astragalus sinicus L., Zhiwu
Yichuan Ziyuan Xuebao (Journal of Plant Genetic Resources), 13(5): 870-878 (孙清信, 陈坚,林新坚, 2012, 紫云英 ISSR引物
的筛选及 PCR 反应体系的优化, 植物遗传资源学报, 13(5): 870-878)
Wang W.C., Liu L., Wang S.X., Zhang M.L., Ding Z.Z., Lin P.P. and Fang M.Y., eds, 1980, Flora of China, Science Press, Beijing,
China, pp.335-336 (王文采, 刘亮, 王蜀秀, 张美玲, 丁志遵, 凌苹苹, 方明渊, 编著, 1980, 中国植物志, 科学出版社, 中
国, 北京, pp.335-336)
Xing C., Tian Y., Guan F. and Meng F.J., 2015, Evaluation of genetic diversity in Amygdalus mira (Koehne) Ricker using SSR and
ISSR markers, Plant Syst. Evol., 301: 1055-1064
Yang J. and Zhang G.C., 2013, Optimization of ISSR-PCR reaction system and its verification in common bean, Fenzi Zhiwu
Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 11(4): 6111-6616 (杨晶, 张广臣, 2013, 菜豆 ISSR-PCR 体系的优化与验证, 分子植物
育种, 11(4): 6111-6616)
Zhou H.K., Zhou L., Zhao X.Q., Liu W.,Li Y.N. and Zhao L., 2004, Study of growing characteristics of Halerpestes
Cymbalaris,Xibei Zhiwu Xuebao (Acta. Bot. Boreal. Occident. Sin.),24(10):1798-1804 (周华坤, 周立, 赵新全, 刘伟, 李英
年, 赵亮, 2004, 水葫芦苗(Halerpestes cymbalaris)的生长特征研究, 西北植物学报, 24(10):1798-1804)