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倒提壶(紫草科 Boraginaceae)提取物抗菌活性的初步研究



全 文 :西北林学院学报 2014,30(5):125~128
Journal of Northwest Forestry University
  doi:10.3969/j.issn.1001-7461.2014.05.23
倒提壶(紫草科Boraginaceae)提取物抗菌活性的初步研究
 收稿日期:2013-12-03 修回日期:2014-01-03
 基金项目:国家自然科学基金(31360003);云南省重点学科森林保护学(XKZ200905)。
 作者简介:王芳,女,讲师,博士,研究方向:资源微生物。E-mail:35445230@qq.com
*通信作者:伍建榕,女,教授,研究方向:森林病理学与资源微生物利用。E-mail:wujianrong63@yahoo.com.cn
王 芳,梁 倩,杨建珍,伍建榕*
(西南林业大学 国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室,云南 昆明650224)
摘 要:采用抑菌圈法和抑制菌丝生长速率法,研究倒提壶地上部分醇提物的石油醚相、氯仿相、乙
酸乙酯相和水相4个极性部位对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿
假单胞菌5种细菌及可可葡萄座腔菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、多主棒孢霉和尖孢炭疽菌5种植
物病原真菌的抑制作用。结果表明:不同溶剂提取物的抑菌活性差异较大。石油醚相对5种供试
的细菌菌株均无作用;氯仿相对大肠杆菌和普通变形杆菌具有抑制作用,其最低抑菌质量浓度
(MIC)均为3mg/mL;乙酸乙酯相对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和普通变形杆菌均有不同程度的抑
制作用,其最低抑菌质量浓度(MIC)均为2mg/mL;水相仅对大肠杆菌具有抑制作用,其最低抑菌
质量浓度(MIC)为20mg/mL。氯仿相对腐皮镰刀菌的抑菌作用最强,EC50为1.48mg/mL;乙酸
乙酯相对可可葡萄座腔菌和多主棒孢霉抑菌作用最强,EC50分别为1.78mg/mL和0.63mg/mL;
石油醚相和水相的抑真菌活性相对较弱。石油醚相、氯仿相和水相对供试真菌中的部分菌种具有
促进生长的作用。
关键词:倒提壶;细菌;植物病原真菌;抗菌活性
中图分类号:S763.130.1   文献标志码:A   文章编号:1001-7461(2014)05-0125-04
Anti-microbial Activity of the Extracts fromCynoglossum amabile
WANG Fang,LIANG Qian,YANG Jian-zhen,WU Jian-rong*
(Key Laboratory of State Forestry Administration for Biodiversity Conservation in Southwest China,
Southwest Forestry University,Kunming,Yunnan 650224,China)
Abstract:The aerial part of Cynoglossum amabile was extracted by ethanol.The resultant extract was then
extracted successively by petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,and water.The antimicrobial activi-
ties were examined by using five types of bacteria,such as Escherichia coli,Bacillus subtilis,Proteus vul-
garis,Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa,and the five types of popular plant pathogenic
fungi,Botryosphaeria rhodina,Fusarium oxysporum,Fusarium solani,Corynespora cassiicola and Col-
letotrichum acutatum.The results showed that different extracts had different anti-microbial activities.Pe-
troleum ether extract showed no significant inhibition to 5bacteria.Chloroform extract had inhibition to
E.coli and P.vulgaris,the ethyl acetate extract exhibited inhibition to B.subtilis,E.coli and P.vul-
garis,and the water extract inhibited E.coli.The minimal inhibitory concentration for the chloroform ex-
tract was 3mg/mL,2mg/mL for the ethyl acetate extract,and 20mg/mL for the water extract.
Key words:Cynoglossum amabile;bacteria;plant pathogenic fungi;anti-microbial activity
  植物抗菌作用是指一种植物的提取物在体外能
抑制防止微生物生长繁殖或具有杀灭作用[1]。随着
人们生活水平的提高和环保意识的增强,从植物中
寻找杀菌、抑菌活性物质,越来越受到人们的重视。
植物源活性物质易降解,造成环境污染和毒性残留
问题较小[2],因此,充分利用我国丰富的植物资源,
研究开发高效、无毒或低毒的广谱杀菌剂具有重要
的意义。倒提壶(Cynoglossum amabile)属紫草科
琉璃草属,多年生草本,分布于我国云南、贵州、广
东、广西、新疆等地[3]。倒提壶全草入药,其味苦,性
凉,有清热利湿、散瘀止血、止咳、镇痛之功效,是我
国布依族常用治疗疟疾、肝炎、痢疾、咳嗽、风湿性关
节炎、支气管炎、膀胱炎、尿道炎等症的药物[4-5]。倒
提壶全草含有多种化学成分,如生物碱类、甾体类、
苷类、三萜类、有机酸类化合物等成分[6],但关于该
植物化学成分抗菌活性方面的相关报道尚少。本试
验对倒提壶4种溶剂提取物的抑菌活性进行了初步
研究,为进一步探讨该植物的科学利用提供一定的
理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
倒提壶(C.amabile)于2013年6月19日采自
云南省昆明市西南林业大学校园内,经西南林业大
学林学院杜凡教授鉴定为紫草科(Boraginaceae)琉
璃草属(Cynoglossum),干燥倒提壶全草粉碎备用。
1.2 供试菌种
供试的菌种包括5种细菌和5种植物病原真
菌。其中5种供试细菌为:大肠杆菌(Escherichia
coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、普通变形杆
菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphylo-
coccus aureus)和 铜 绿 假 单 胞 菌 (Pseudomonas
aeruginosa);5种供试真菌为:可可葡萄座腔菌
(Botryosphaeria rhodina)、尖孢镰刀菌(Fusarium
oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、多主
棒孢霉 (Corynespora cassiicola)和尖孢炭疽菌
(Colletotrichum acutatum)。菌种均由西南林业大
学植物病理学实验室提供。
1.3 培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基:蛋白胨10g、牛肉膏
3g、氯化钠5g和琼脂18~20g,蒸馏水定容到
1 000mL,pH7.0~7.2。牛肉膏蛋白胨液体培养
基:除不加琼脂外,与牛肉膏蛋白胨固体培养基配制
方法相同。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃
薯200g,葡萄糖20g,琼脂18~20g。
1.4 倒提壶提取样品的制备
取干燥倒提壶全草粉碎样品812g,用80%的
乙醇提取,在50℃水浴下回流提取3次,每次1h。
得浸膏101.8g(得率为12.5%)。再将浸膏加适量
水,用石油醚萃取得浸膏22g,接着用氯仿萃取得浸
膏0.8g,最后用乙酸乙酯萃取得浸膏2g,最后蒸干
水相得77g。
1.5 抑细菌活性试验
菌种活化:将供试的5株细菌菌株接种于牛肉
膏蛋白胨固体培养基斜面,37℃过夜培养。
菌悬液制备:在5个装有100mL牛肉膏蛋白
胨液体培养基的三角瓶中各接种一环活化供试菌
株,于37℃培养18h,制得初始菌悬液。用无菌生
理盐水采用梯度稀释法制成 10-1、10-2、10-3、
10-4、10-5、10-6 6 个浓度梯度的菌悬液;选取
10-5、10-6 2个梯度各取200μL分别涂布平板,于
37℃倒置培养18h后计数。根据培养结果,挑选合
适浓度的菌悬液作为供试菌悬液。
抑菌圈法[7]:每个培养皿倒入大约20mL牛肉
膏蛋白胨琼脂培养基制成平板,待培养基凝固以后,
分别加入5种菌悬液(大肠杆菌:7.7×106 CFU/
mL,枯草芽孢杆菌:3.5×106 CFU/mL,普通变形
杆菌:1.9×106 CFU/mL,铜绿假单胞菌:5.5×106
CFU/mL,金黄色葡萄球菌:4.8×106 CFU/mL)各
200μL,用无菌玻璃刮涂布均匀。取直径6mm的
无菌滤纸片,放入倒提壶提取物的水相(0.19g/
mL)、乙酸乙酯相(0.04g/mL)、石油醚相(0.28g/
mL)和氯仿相(0.037g/mL)溶液中充分浸泡,以生
理盐水作对照,取出后放在含菌平板上,每皿1片对
照,每个浓度平行作2皿,37℃倒置培养18~24h
后,分别测量各样品的抑菌圈直径(mm),即为测量
直径减去6mm滤纸片直径。数据采用Excel 2007
软件进行计算和处理。
最低抑菌浓度(MIC)法:根据上述试验结果,
对具有明显抑菌圈的样品进行 MIC值的测定。对
倒提壶提取物的样品分别进行倍比梯度稀释,取稀
释后的样品1mL,分别加入到灭菌的19mL培养
基中,混匀,制成平板。待培养基凝固以后,分别加
入上述5种菌悬液,各200μL,菌悬液的浓度为10

CFU/mL,涂布于平板,于37℃倒置培养18~24h,
观察细菌生长情况,以完全无菌生长的浓度作为供
试样品溶液的 MIC值。
1.6 抑真菌活性试验
采用抑菌丝生长速率法[8]。将倒提壶提取物配
成一定的浓度,取1mL,然后加入到19mL灭菌后
冷却至50℃的PDA培养基中,充分摇匀,并以等体
积的生理盐水加入到PDA培养基中作对照,然后
倒入直径为90mm培养皿内制成平板,备用。待培
养基凝固以后,在每个培养基上接入已制备好的供
621 西北林学院学报 30卷 
试病原真菌菌饼(直径为6mm),菌丝面向下,每个
处理设3个重复,置28℃下恒温箱培养4d后,用十
字交叉法测量菌落的2个直径,取其平均值作为代
表菌落的直径,用下式求出抑菌率:菌落净生长直径
(mm)=测量直径-6,抑菌率=(对照菌落直径-
处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。数据采用
Excel 2007软件进行计算和处理。
真菌半抑菌浓度(EC50)的测定[9]。将倒提壶提
取物中抑菌活性较好的样品,用无菌水稀释成2、4、
8倍和16倍等浓度梯度的溶液,按上述方法测定各
浓度下的菌落直径,计算抑菌率。将抑制率转换为
几率值,浓度转换为对数形式,以浓度对数(X)为横
坐标,抑制率的几率值(Y)为纵坐标,作毒力曲线,
得毒力方程和EC50值。以EC50作为衡量样品对不
同植物病原真菌生长抑制活性大小的指标。
2 结果与分析
2.1 抑细菌活性
试验表明,倒提壶的石油醚相对5种供试细菌
菌株均无作用;氯仿相(37mg/mL)对大肠杆菌和
普通变形杆菌具有抑制作用,其抑菌圈平均直径分
别为3.8mm和2.8mm,最低抑菌浓度均为3mg/
mL(表1);乙酸乙酯部分(40mg/mL)对大肠杆菌、
枯草芽孢杆菌和普通变形杆菌的抑菌圈平均直径为
2.9、2.9mm和3.5mm,最低抑菌浓度均为2mg/
mL;水溶物部分(190mg/mL)仅对大肠杆菌具有
抑制作用,其抑菌圈平均直径为3.3mm,最低抑菌
浓度为20mg/mL(表1)。
表1 倒提壶提取物的抑细菌作用
Table 1 Anti-bacterial activitives of the extracts fromC.amabile
供试菌种
抑菌直径/mm
氯仿相 乙酸乙酯相 水相 空白
最小抑菌质量浓度/(mg·mL-1)
氯仿相 乙酸乙酯相 水相
大肠杆菌(E.coli) 3.8±0.4  2.9±0.2  3.3±0.1 - 3  2  20
枯草芽孢杆菌(B.subtilis) - 2.9±0.1 - - - 2 -
普通变形杆菌(P.vulgaris) 2.8±0.2  3.5±0.2 - - 3  2 -
  注:“-”表示提取物对供试菌株无抑制作用。
2.2 抑真菌活性
倒提壶地上部分的提取物在2mg/mL的质量
浓度下(表2),对5种植物病原真菌的影响不同,并
存在一定的差异。乙酸乙酯相对可可葡萄座腔菌和
多主棒孢霉抑菌作用最好,抑菌率分别为54.7%和
62.1%,对其他3种植物病原真菌的抑制作用不明
显。氯仿相对腐皮镰刀菌的抑制作用最好,抑菌率
达到55.0%,对其他4种病原菌也没有明显的抑制
作用。同一溶剂提取物对不同种植物病原菌的抑制
效果也有明显的差别,除乙酸乙酯相氯仿相对供试
的5种植物病原真菌有抑制作用外,石油醚相和氯
仿相都对供试的5种植物病原真菌中的3种有抑制
活性,水相对供试的5种植物病原真菌中的2种有
抑制活性。不同溶剂提取物对同一植物病原真菌的
作用也存在差异。对于可可葡萄座腔菌和多主棒孢
霉,乙酸乙酯相的抑菌效果最好,抑菌率分别为
54.7%和62.1%,对于腐皮镰刀菌,氯仿相的抑菌
效果最好,抑菌率可达到55.0%。石油醚相、氯仿
相和水相对供试真菌中的部分菌种具有促进生长的
作用,其原因可能是粗提物在低浓度时促进生长的
因子起主要作用,具有抑菌活性的物质的作用由于
含量过低而没有明显的作用[10]。
表2 倒提壶提取物对5种植物病原真菌的抑制作用
Table 2 Inhibition effect of extracts from the C.amabile on 5types of pathogenic fungi
供试样品
/(2mg·mL-1)
抑菌率/%
可可葡萄座腔菌 尖孢镰刀菌 腐皮镰刀菌 多主棒孢霉 尖孢炭疽菌
石油醚相 -21.6±1.4  2.8±0.8 -40.0±1.0  7.2±0.3  9.8±1.1
氯仿相 -15.1±2.2 -8.0±1.2  55.1±1.5  25.4±0.8  29.3±2.2
乙酸乙酯相 54.7±0.9  12.0±2.0  23.2±1.3  62.1±2.5  15.9±2.3
水相 -18.0±1.3 -9.8±1.5 -7.4±1.0  6.0±0.6  3.7±0.7
  注:“-”为对照组菌落直径小于处理组菌落直径,粗提物对植物病原真菌表现出促进生长作用。
  由上述试验可知,石油醚相和氯仿相对3种植
物病原菌、乙酸乙酯相对5种病原菌,水相对2种植
物病原菌有抑菌活性,且各样品的抑菌菌种不同。
为了考察各提取物对相关病原菌的抑菌活性大小,
进行了毒力测定,结果见表3。乙酸乙酯相对可可
葡萄座腔菌和多主棒孢霉抑菌作用最强,EC50分别
为1.78mg/mL和0.63mg/mL。氯仿相对腐皮镰
刀菌的抑菌作用最强,EC50为1.48mg/mL。石油
醚相和水相的抑菌活性相对较弱。此外,从毒力回
归曲线可以看出,不同质量浓度的各样品对植物病
721第5期 王 芳 等:倒提壶(紫草科Boraginaceae)提取物抗菌活性的初步研究
原菌的抗菌活性和浓度呈正相关性,即各样品对植 物病原菌的毒力随着浓度的增高而增强。
表3 倒提壶提取物对植物病原菌菌丝生长抑制的毒力测定结果
Table 3 Virulence of extract from the Cynoglossum amabile on different pathogenic fungi
供试样品 供试菌种 毒力曲线 相关系数(R2) EC50/(mg·mL-1)
石油醚相
尖孢镰刀菌(F.oxysporum) y=1.322 0x+2.677  0.964 5  57.17
多主棒孢霉(C.cassiicola) y=0.846 6x+3.282 3  0.981 6  106.89
尖孢炭疽菌(C.acutatum) y=0.455 4x+3.564 3  0.996 7  1 421.06
氯仿相
腐皮镰刀菌(F.solani) y=0.962 6x+4.835 3  0.970 8  1.48
多主棒孢霉(C.cassiicola) y=0.485 1x+4.192 2  0.990 8  46.26
尖孢炭疽菌(C.acutatum) y=0.501 5x+4.305 1  0.987 7  24.30
乙酸乙酯相
可可葡萄座腔菌(B.rhodina) y=0.964 8x+4.758 3  0.983 4  1.78
尖孢镰刀菌(F.oxysporum) y=2.115 8x+3.323 0  0.964 2  6.20
腐皮镰刀菌(F.solani) y=1.040 3x+4.084 7  0.952 8  7.54
多主棒孢霉(C.cassiicola) y=0.714 7x+5.143 8  0.973 7  0.63
尖孢炭疽菌(C.acutatum) y=1.110 3x+3.786 5  0.968 5  12.39
水相
多主棒孢霉(C.cassiicola) y=0.465 7x+3.309 0  0.954 4  4 276.54
尖孢炭疽菌(C.acutatum) y=1.007 8x+2.947 3  0.943 2  108.85
3 结论与讨论
对倒提壶粗提物进行了抗菌活性研究,发现其
对供试的部分细菌和真菌均具有很好的抑菌作用,
因此值得对其进行进一步的分离研究。目前,具有
抗菌活性的植物种类很多,李玉平[11]等发现天名精
属、蒿属、苍耳属、旋覆花属植物都有较强的抑菌活
性,柴卫利[12]等发现僵蚕醇提对3种供试林木病原
菌物具有较好的抑制作用,庄世宏[13]等对超临界
CO2 流体提取的小花假泽兰全株精油进行了抑菌
活性测定,结果表明其对小麦赤霉病菌和小麦纹枯
病菌菌丝生长的抑制效果较明显。鉴于不同植物,
乃至同种植物的不同部位对细菌或植物病原真菌都
可能会具有不同的抗菌活性,因此,从植物中筛选抗
菌活性物质还有待做更细致的研究,以充分挖掘植
物资源的潜力。
通过对倒提壶这种草本植物的抗菌活性研究发
现,倒提壶提取物的氯仿相和乙酸乙酯相的抑菌效
果均较好,氯仿相对细菌中的普通变形杆菌和真菌
中的腐皮镰刀菌的抑菌活性最好,乙酸乙酯相对细
菌中的大肠杆菌及枯草芽孢杆菌和真菌中多主棒孢
霉的的抑菌活性最好,可以选用这些菌作为活性追
踪的目标菌,为从中分离主要抑菌活性先导化合物
指明方向。此外,对于植物源杀菌剂而言,有的在离
体条件下没有活性,但在活体植物上则表现出极强
的抑菌活性[14],正如乙膦铝、三环唑、喀瘟唑等只在
活体上表现活性[15]。本试验仅初步进行了倒提壶
全草的离体试验,关于活体试验、植物不同部位的有
效抑菌成分的分离纯化及抑菌、促菌活性物质比例
变化不同对细菌和植物病原真菌的作用机制有待进
一步研究。
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