全 文 ：蒋向辉 ,佘朝文 ,许　栋 ,等.浏阳朝天椒的 ITS序列分析及分类地位研究 [ J] .江苏农业科学 , 2010(4):36-37, 88.
浏阳朝天椒的 ITS序列分析及分类地位研究
蒋向辉 1, 2, 3 , 佘朝文 1, 2, 3 , 许　栋 1 , 张青桦1 , 朱　超 1
(1.怀化学院生命科学系 ,湖南怀化 418008;2.怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室 ,湖南怀化 418008;
3.怀化学院湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室,湖南怀化 418008)
　　摘要:对浏阳朝天椒(Capsicumfurtescensvar.Liuyang)rDNA的 ITS序列进行了 PCR扩增和克隆测序 , 用 DNA-
MAN软件对浏阳朝天椒 ITS序列进行了分析 ,将浏阳朝天椒及其近缘种进行聚类分析。结果为:(1)浏阳朝天椒 ITS
序列长 719 bp, G+C含量为 51.3%。(2)将浏阳朝天椒与其他 3种辣椒和同科不同属的 3种枸杞及 3种烟草的 rDNA
的 ITS序列进行比较 ,发现其与辣椒 Capsicumeximium及 C.lyciant的 ITS序列同源性较低 , 与辣椒 C.baccatu的 ITS
序列差异较小 ,相似性达 78.3%,可认为浏阳朝天椒与 C.baccatu亲缘关系近 , 可归为一类。研究认为 , ITS序列在近
缘类群间的系统学研究 、居群进化学研究及品种鉴定上具有较大的应用潜力。
　　关键词:辣椒;朝天椒;ITS序列;克隆;系统学;分类
　　中图分类号:Q943　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)04-0036-02
收稿日期:2009-10-26
基金项目:湖南省科研计划重点项目(编号:2009FJ2008);湖南省教
育厅资助项目(编号:09C755);民族药用植物资源研究与利用湖
南省重点实验室项目(编号:SYSXM200909)。
作者简介:蒋向辉(1974—),男 ,湖南安化人 ,硕士 ,讲师 ,主要从事植
物遗传与育种研究。 E-mail:jxfei789@ 163.com。
通信作者:佘朝文 ,博士 ,教授。 E-mail:shechaowe@tom.com。
　　辣椒为茄科辣椒属(Capsicum)植物 , 1年生草本 ,别名番
椒 、海椒 、辣子 、辣角 、秦椒等 。辣椒具有极高的食用价值 ,果
实中含多种维生素 ,其中维生素 C的含量在蔬菜中居第 1位 ,
每 100g鲜重果实含量为 150 ～ 200 mg[ 1 ] 。辣椒及辣椒粉是
中国的重要出口产品 ,其中朝天椒品种在出口干椒中占有相
对大的比重 。浏阳朝天椒 (Capsicumfurtescensvar.Liuyang)
产于我国湖南省浏阳市 ,在湖南省内种植较广 ,因其口感好 、
辣味足而深受湖南人民的喜爱 。本研究运用分子生物学的方
法对浏阳朝天椒的 rDNA的 ITS序列进行测序 ,并与其他广
栽辣椒品种亲缘关系进行比较 ,一方面为浏阳朝天椒栽培种
的准确分类提供依据 ,另一方面为辣椒品种的进一步改良提
供参考 。
1　材料与方法
1.1　材料
浏阳朝天椒品种 ,来自湖南省浏阳市农家品种 。
1.2　ITS的 PCR扩增
本试验采用改进的 CTAB法提取浏阳朝天椒嫩叶片中的
基因组 DNA[ 2] 。 PCR扩增 ,引物采用 Bruns等 [ 3]设计的 ITS
通用引物 ITS4和 ITS5 ,序列如下 , ITS4:5′-TCCTCCGCTTAT-
TGATATGC-3′;ITS5:5′-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3′。
反应程序为:95 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 45 s, 55 ℃退火
45 s, 72℃延伸 45s, 35个循环;72 ℃后延伸 10min。 PCR反
应体系:DNA(30 ～ 50 ng/μL)2.0 μL, 10×Bufer(25mmol/L)
1.2 μL, Mg2 +(25 mmol/L)0.75 μL, TaqDNApolymerase
(2 U/μL)0.4 μL, dNTP混合物 (10 mmol/L)0.4 μL, Primer
F(ITS5)(10 μmol/L) 0.375 μL, PrimerR(ITS4)
(10μmol/L)0.375μL, ddH2O19.95 μL。
1.3　PCR产物的克隆 。
由湖南大学提供的大肠杆菌(E.coil)菌株 DH5α制备感
受态细胞 ,用纯化的 PCR产物与购买的 pMD18-T质粒及连
接酶构建重组质粒(16 ℃)。将重组质粒转入感受态细胞中 。
重组质粒的提取与酶切鉴定:用购自上海生化工程技术服务
公司的试剂盒提取重组质粒 ,进行酶切鉴定后送往上海生化
工程技术服务公司测序 。
1.4　系统发育分析
从 NCBI数据库下载浏阳朝天椒近缘种 ITS序列 , 用
MEGA4.0软件对浏阳朝天椒与其近缘种进行系统发育分析 。
2　结果与分析
2.1　PCR扩增及产物纯化
以提取的植物基因组 DNA为模板按照 ITS扩增体系扩
增 ITS序列(包括 5.8S)。据图 1可知 ,浏阳朝天椒的 PCR扩
增产物长度约 750bp,并且条带清晰 ,无杂带 。
2.2　ITS序列分析
浏阳朝天椒 ITS序列在 NCBI上的登录号为 GQ182976。
将浏阳朝天椒的 ITS序列与其他 3种辣椒属栽培种及同属茄
科的枸杞和烟草栽培种进行序列分析比较(表 1)。从表 1可
以看出 ,浏阳朝天椒的 ITS序列长度为 719 bp, G+C含量为
51.3%。其中 ITS1序列长度为 246 bp, G+C含量为 43.0%;
ITS2序列长度为 226 bp, G+C含量为 50.9%。同属辣椒属
的几种栽培种比较 , ITS序列长度从 637bp到 742bp不等 ,相
—36— 江苏农业科学　2010年第 4期DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.04.111
差 105 bp, 长度变异为 14.2%, G+C含量为 44.3% ～
51.3%。从单一长度来看 , ITS1序列长度 243 ～ 320bp,变异长
度为 24.6%, G+C含量为 41.3% ～ 49.4%。 ITS2序列长度
为 224 ～ 227bp,变异长度为 0.01%, G+C含量为 45.1% ～
50.9%。再将浏阳朝天椒和其他 2个同科不同属的 6个种比
较 ,可以看出 ,浏阳朝天椒在 ITS序列长度上比枸杞属的长 ,
但是短于烟草属 , G+C含量相差不大 。
表 1　各类群 ITS序列长度和 G+C含量
编号 类群
ITS
长度
(bp)
G+C
含量
(%)
ITS1
长度
(bp)
G+C
含量
(%)
ITS2
长度
(bp)
G+C
含量
(%)
1 浏阳朝天椒 719 51.3 246 43.0 226 50.9
2 Capsicumeximium 655 44.3 243 43.1 224 45.1
3 Capsicumbaccatu 637 45.7 247 41.3 226 48.7
4 Capsicumlyciant 742 49.1 320 49.4 227 49.1
5 Lyciumamericanum 630 49.0 240 47.7 225 50.5
6 Lyciumathium 634 48.9 250 46.4 219 52.3
7 Lyciumpuberulum 621 49.3 246 45.5 221 53.8
8 Nicotianawigandioides 781 49.2 359 49.1 260 50.2
9 Nicotianaatenuata 784 48.1 358 48.5 263 48.9
10 Nicotianaacuminata 784 48.1 358 47.6 263 48.9
　　用软件 DNAMAN对浏阳朝天椒和其他栽培种进行两两
比对 ,可以得出 ,浏阳朝天椒 ITS序列与其他各栽培种的相似
度都在 73%以上 。和同一属的比较 ,浏阳朝天椒与 Capsicum
baccantu亲缘关系最近 ,为 78.3%;与 Capsicumeximiumu亲缘
关系最远 ,为 73.7%(表 2)。
2.3　系统发育分析
用 DNAMAN分析得出浏阳朝天椒和同为茄科的 9种栽
培物种之间的遗传距离 ,可以看出 ,浏阳朝天椒与其他种的遗
传距离都在 0.217以上:与辣椒属 3个种的遗传距离在 0.217
～ 0.263,与枸杞属 3个种为 0.240 ～ 0.259,与烟草属 3个种
为 0.261 ～ 0.265(表 2)。可见 ,浏阳朝天椒不但与同科不同
属的烟草和枸杞相差较大 ,与同属的其他辣椒相比也有较大
的遗传距离 。
运用 DNAMAN软件对浏阳朝天椒和其他几个近缘载培
种进行系统发育分析 ,建立同源树(图 2)。从图 2可以看出 ,
浏阳朝天椒和其他几种比较 ,同源性在 76%以上 。比较的
4个辣椒品种中 , Capsicumeximium和 Capsicumlyciant亲缘关
系最近 ,在同源树上聚为一支 ,相似度在 90%以上;而浏阳朝
天椒由于各种原因导致变异较大 ,与其他 3种辣椒亲缘关系
最远 ,在同源树上独为一支 。运用 DNAMAN软件得出几种辣
椒的系统发育树(图 3),同样可以很清楚地反映出几种辣椒
之间的亲缘关系 ,得出以上相同结果 。
表 2　浏阳朝天椒与同科 9个栽培种的相似度和遗传距离
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 — 0.737 0.783 0.759 0.760 0.754 0.741 0.735 0.739 0.739
2 0.263 — 0.876 0.889 0.885 0.885 0.865 0.863 0.878 0.876
3 0.217 0.125 — 0.874 0.877 0.885 0.865 0.854 0.858 0.858
4 0.241 0.111 0.126 — 0.920 0.915 0.903 0.902 0.909 0.911
5 0.240 0.115 0.123 0.080 — 0.959 0.935 0.914 0.921 0.920
6 0.246 0.115 0.115 0.085 0.041 — 0.949 0.906 0.911 0.911
7 0.259 0.135 0.135 0.097 0.065 0.051 — 0.881 0.885 0.883
8 0.265 0.137 0.146 0.098 0.086 0.094 0.119 — 0.968 0.968
9 0.261 0.122 0.142 0.091 0.079 0.089 0.115 0.032 — 0.999
10 0.261 0.122 0.142 0.089 0.080 0.089 0.117 0.032 0.001 —
　　注:编号物种同表 1;“— ”上方为相似度 ,下方为遗传距离。
3　小结与讨论
3.1　浏阳朝天椒 ITS序列分析及其分类
本研究基于 ITS序列分析和聚类分析认为:(1)浏阳朝天
椒 rDNA的 ITS序列长度为 719 bp, ITS序列的 G+C含量为
51.3%。 (2)浏阳朝天椒与其他辣椒种比较 ,无论在长度还
是 G+C含量上都有较大差异。 (3)经同源树比较可以得出 ,
浏阳朝天椒经过多年栽培后有较大的变异 ,与 C.eximium和
C.lycint2种辣椒亲缘关系较远 。
3.2　ITS序列保守性和应用可靠性的讨论
相关物种间的系统关系可以通过同源序列的比对来决
定 [ 4 ] 。在被子植物中 , rDNAITS区既具有核苷酸序列的高度
变异性又有长度上的保守性 ,这使得该序列很容易在近缘类
群间排序 ,且丰富的变异可在较低的分类阶元上解决植物系
统发育问题 [ 5-7 ] 。本试验选用 4种辣椒种类的类群均为茄科
辣椒属植物 , 故能应用 ITS序列进行分析 。排序后的ITS序
(下转第 88页)
—37—蒋向辉等:浏阳朝天椒的 ITS序列分析及分类地位研究
表 5　株高 60 ～ 65cm条件下不同摘薹长度对油菜主要农艺性状差异显著性分析
处理 摘薹重(g)
株高
(cm)
有效分枝数
(个)
单株角果数
(粒)
每角果粒数
(粒)
鲜重
(g)
千粒重
(g)
单株产量
(g)
D1 0.00e 143.53±3.79a 8.13±0.42ab 129.53±10.28ab 20.46±0.55a 148.57±13.98b 4.22±0.03a 11.18±0.35b
D2 2.86d 90.20±1.45b 8.33±0.56ab 159.80±10.05a 20.37±0.64a 173.34±16.37a 4.00±0.02b 13.01±0.44a
D3 4.64c 73.93±2.59c 7.73±0.73b 132.46±13.28ab 20.58±0.58a 129.85±11.16c 3.58±0.02c 9.76±0.67c
D4 7.00b 68.66±1.96cd 9.46±1.62ab 117.20±11.41b 20.33±0.23a 146.97±16.80b 4.23±0.01a 10.07±0.35c
D5 9.23a 62.93±1.50d 11.33±1.44a 143.66±17.44ab 20.67±0.79a 170.31±19.43a 3.64±0.05c 10.81±0.86bc
　　注:同列小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)。
表 6　不同株高条件下最佳摘薹处理油菜主要农艺性状差异显著性分析
处理 摘薹重(g)
株高
(cm)
有效分枝数
(个)
单株角果数
(粒)
每角果粒数
(粒)
鲜重
(g)
千粒重
(g)
单株产量
(g)
A4 13.58a 32.73±1.31d 9.86±0.90b 105.26±11.87b 19.33±0.35b 118.09±11.60b 2.66±0.03d 5.31±0.64d
B4 10.44b 39.93±1.72c 10.33±1.10b118.53±18.68ab20.34±0.57a133.14±17.11ab 3.03±0.01b 7.22±0.68c
C4 8.08d 54.53±1.45b 12.46±1.35a157.533±12.66a19.74±0.68ab143.08±11.75ab 2.89±0.04c 8.96±0.31b
D5 9.22c 62.93±1.50a 11.33±1.44ab143.66±17.44ab20.67±0.79a 170.31±19.43a 3.64±0.05a 10.81±0.86a
　　注:同列小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)。
显著;株高之间单株产量差异显著 , D5产量最高 ,单株产量最
大 、摘薹重高于 C4方案 ,但此时大多数植株已经开花 ,摘薹
时期已晚 ,食用时口感下降 ,菜薹售价较低 。所以 ,综合考虑
以 C4为佳(即在油菜株高为 50 ～ 55 cm时 ,摘薹 15 cm)。摘
薹后不仅菜薹鲜嫩 、适宜食用 ,而且对油菜籽产量具有增产效
应 ,为油菜“一菜两用 ”的最佳处理方案 。
3　讨论
本试验结果表明 ,油菜在不同株高进行摘薹处理对油菜
农艺和经济性状影响较大 。主要表现为:随着摘薹长度的增
加 ,株高逐渐降低 、分枝数逐渐增加 、角果数有部分增加趋势 、
鲜重增加 、千粒重和单株产量呈部分增加趋势 ,而每角果粒数
无显著变化 。在株高较矮时 ,摘薹使得油菜籽产量下降;植株
高于 40cm时 ,摘薹不但不会降低油菜籽产量 ,反而能够提高
油菜籽产量 。在合适的株高条件下摘薹长度适当 ,不但能够
增收菜薹 ,同时可以增收油菜籽 。 “一菜两用 ”摘薹时间和标
准要把握好 ,当植株达 50 ～ 55 cm时摘薹较好 ,摘薹长度 15
cm最佳 ,基部保留 40 cm左右 ,可促进分枝的增加 ,从而提高
油菜籽产量 。
参考文献:
[ 1]侯　燕 ,何惠平 ,朱文秀 ,等.甘蓝型三系杂交油菜秋播制种技术
研究Ⅱ.母本摘薹对杂种纯度和产量影响的研究 [ J] .种子 ,
1997(2):38-39.
[ 2]湖北省农业厅.油菜———亦油亦菜 [ J].农家顾问 , 2005(4):21.
[ 3]杜远存.油菜摘薹能增产 [ J].农村经济与科技 , 1999(2):22.
[ 4]耿　玲.沪油 15一种两收、一菜两用 [ J].农家顾问 , 2004(8):
43.
[ 5]周志淑.双低油菜“一种两收”栽培模式效益分析 [ J] .耕作与栽
培 , 2009(3):41-43.
(上接第 37页)
列总长度为 779bp,变异位点有 432个(占 55.5%)。
许多研究表明 ,属内种间 ITS序列长度比较保守 ,相差的
碱基数从几个到十几个 。有研究表明 ,花椒 ITS区序列总长
度为 619 ～ 620 bp,长度变异较小 ,与其混淆种长度仅相差
4 bp[ 8] ;枸杞属 ITS1序列的变异范围为 621 ～ 634 bp[ 9 ] ,这证
明了 ITS序列的属间保守性 。而本试验研究的浏阳朝天椒与
其他参考辣椒品种 ITS序列长度变化在 637 ～ 742bp之间 ,最
大相差 105bp, G+C含量在 44.3% ～ 51.3%,说明了 ITS序
列的变异性 。这可能是因为辣椒经过多年栽培驯化后 ,核基
因发生交流或改变而导致 ITS序列变化较大 。
参考文献:
[ 1]俞德俊.中国植物志 [ M] .北京:科学出版社 , 2005:240-293.
[ 2]闫苗苗 ,魏光成 , 潘效红 ,等.一种适用于动物与植物总 DNA提
取的方法———改良 CTAB法 [ J] .安徽农业科学 , 2008, 36(20):
8488, 8558.
[ 3] WhiteTJ, BrunsT, LeeS, etal.Amplificationanddirectsequencing
offungalribosomalRNAgenesforphylogenetics[ M] //InnesMA,
GelfandDH, SninskyJJ, etal.PCRprotocols:aguidetomethods
andapplications.NewYork:AcademicPress, 1990:315-322.
[ 4] KässE, WinkM.PhylogeneticrelationshipsinthePapilionoideae
(familyLeguminosae)basedonnucleotidesequencesofcpDNA
(rbcL)andncDNA(ITS1and2)[ J] .MolPhylogenyEvol, 1997, 8
(1):65-88.
[ 5] GielyL, YuanYM, KǜpferP.Phylogeneticuseofnoncodingregions
inthegenusGentianaL.:CholoroplasttrnL(UAA)intronversusnu-
clearribosomalinternaltranscribedspacersequences[ J] .MolPhy-
logenyEvol, 1996, 5(3):460-466.
[ 6] EdwardS, BucklerIV, HoltsfordTP.Zeasystematics:ribosomalITS
evidence[ J].MolBiolEvol, 1996, 13:612-622.
[ 7] QuLH, ChenYQ.Keytomoleculartaxonomyprinciplesandmeth-
ods[ J] .ActaSciNatUnivSunyatseni, 1999, 38(1):1-6.
[ 8]沈　洁.DNA序列、ISSR标记在药用植物种质鉴别中的应用
[ D] .南京:南京师范大学 , 2005.
[ 9]石志刚 ,安　巍 ,焦恩宁 ,等.基于 nrDNAITS序列的 18份宁夏
枸杞资源的遗传多样性 [ J] .安徽农业科学 , 2008, 36(24):10379
-10380.
—88— 江苏农业科学　2010年第 4期