全 文 ：＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｙｉ＠ｎｗｉｐｂ．ｃａｓ．ｃｎ
收稿日期：２０１４－０４－１６；修回日期：２０１４－０８－２７
基金项目：国家科技支撑计划项目（２０１２ＢＡＣ０８Ｂ０４）；国家自然
科学基金项目（３１２００２４５）；２０１１年中国科学院“西部之光”人才培养
计划“西部博士资助”项目
作者简介：包蕊（１９９１－ ），女，青海湟中人，主要从事资源植物遗
传多样性研究，Ｅ－ｍａｉｌ：１０７００７４４８５＠ｑｑ．ｃｏｍ．
文章编号：１６７３－５０２１（２０１４）０６－００４６－０７
华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化及引物筛选
包 蕊１，胡延萍１，王 莉１，旭荣花２，李 毅１，＊
（１．中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 ８１０００８；２．海西州科学技术局，青海 德令哈 ８１７０００）
摘要：利用正交试验设计方法，对影响华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应中 Ｍｇ２＋、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、引物和ＤＮＡ
模板等５个因素进行优化筛选，以期建立最佳反应条件。同时，筛选扩增条带清晰稳定的ＩＳＳＲ引物，经退火温度试
验得到各个引物的最佳退火温度。结果表明：华扁穗草２０μｌ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ最佳反应体系包括１．８０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ
２＋、
０．８０ＵＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、０．１００ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ、０．６μｍｏｌ／Ｌ引物和２０ｎｇ ＤＮＡ模板；筛选出扩增条带清晰稳定的１０
条引物。体系验证和引物筛选试验表明，其在华扁穗草不同个体中能够扩增出条带清晰、稳定性好的条带，可用于
后续华扁穗草遗传多样性分析，为华扁穗草野生资源保护和优良牧草种质资源选育提供理论依据。
关键词：华扁穗草；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ；反应体系；正交试验设计；引物筛选
中图分类号：Ｓ５４８ 文献标识码：Ａ
华扁穗草（Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ Ｔａｎｇ ｅｔ
Ｗａｎｇ）为莎草科扁穗草属多年生草本，生长于海拔
１０００～４２００ｍ的溪边、河边、河滩潮湿处和沼泽地
上，分布于内蒙古、山西、河北、陕西、甘肃、青海、云
南、四川、西藏等省区［１～２］。华扁穗草是中生或中湿
生植物群落的优势种和建群种之一，由于过度放牧
在若尔盖高原、甘南玛曲县等地区已成为濒危物
种［３～４］，保护华扁穗草野生资源和选育优良种质牧
草迫在眉睫。目前，对华扁穗草的研究相对较少，仅
涉及生长特征、形态解剖学与其在湿地植物群落中
的功能与作用等研究，而在分子生物学水平用ＩＳＳＲ
分子标记对华扁穗草的研究尚未见报道。ＩＳＳＲ是
一种基于ＰＣＲ的分子标记，现已广泛应用于牧草遗
传分析、基因定位、遗传作图等方面［５～９］。本研究采
用正交设计方法对华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中
的各个因子进行优化，以建立华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
最佳反应体系，为进一步利用ＩＳＳＲ分子标记进行
华扁穗草种质资源遗传多样性研究和优良牧草资源
保护提供理论依据。
１ 材料和方法
１．１ 植物材料
样品于２０１３年８月采自青海省海北州祁连县
下大坂口（３７°１８′５３．８″Ｎ、１０１°４８′５９．４″Ｅ），经中国科
学院西北高原生物研究所卢学峰研究员鉴定为华扁
穗草，每个植株材料采集嫩叶，置于塑料自封袋中，
加入硅胶促其快速干燥，带回实验室于－２０℃冰箱保
存备用。凭证标本保存于中国科学院西北高原生物研
究所青藏高原生物标本馆（采集号２０１３０８２２０５）。
１．２ 方法
１．２．１ 华扁穗草基因组总ＤＮＡ提取
华扁穗草总 ＤＮＡ 提取使用 Ｄｏｙｌｅ［１０］改进的
ＣＴＡＢ法，１％琼脂糖凝胶电泳检测 ＤＮＡ 纯度，
ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ微量紫外分光光度计测定 ＤＮＡ
浓度。
１．２．２ 优化ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系
用Ｌ１６（４５）正交试验设计方法对Ｔａｑ ＤＮＡ聚合
酶、Ｍｇ２＋、引物浓度、ｄＮＴＰ浓度和模板ＤＮＡ设计５因
素４水平试验（表１）。共１６个处理，每个处理２个重
复。选择ＵＢＣ８０７（５′－ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴ－３′）
引物。反应体系总体积为２０μｌ，ＰＣＲ仪型号为ＰＴＣ－
２２１（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。扩增程序由９４℃预变性
５ｍｉｎ，３８个循环９４℃变性２０ｓ、５０℃复性６０ｓ、７２℃延
伸８０ｓ，７２℃延伸６ｍｉｎ及４℃ｆｏｒｅｖｅｒ组成。
在１×ＴＡＥ电泳缓冲液、电压４Ｖ／ｃｍ 的条件
下，取１０μｌ ＰＣＲ扩增产物在１．２％琼脂糖凝胶（含
０．５μｇ／ｍＬ ＥＢ）中电泳，ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＭＰ凝胶成
像系统（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）拍照记录电泳情况。
经直观分析将１６个处理划分为１６等级，条带
丰富、清晰、背景低的记１６分，最差的记１分。分数
越高，表示特异性越强，该条件下的扩增效果好。对
—６４—
第３６卷 第６期
Ｖｏｌ．３６ Ｎｏ．６
中 国 草 地 学 报
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｒａｓｓｌａｎｄ
２０１４年１１月
Ｎｏｖ．２０１４
评分情况用ＤＰＳ ７．０５统计软件进行方差分析［１１］。
表１ 华扁穗草五因素四水平正交设计
Ｔａｂｌｅ １ Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｌ１６（４５）ｆｏｒ Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ
编号
Ｎｕｍｂｅｒ
因素Ｆａｃｔｏｒｓ
评分结果Ｓｃｏｒｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
镁离子
Ｍｇ２＋
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶
Ｔａｑ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｕ／２０μＬ）
脱氧核糖核
苷三磷酸
ｄＮＴＰ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
（μｍｏｌ／Ｌ）
模板ＤＮＡ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ
ＤＮＡ（ｎｇ）
重复１
Ｒｅｐｅａｔ １
重复２
Ｒｅｐｅａｔ ２
１ ０．９ ０．４ ０．０７５ ０．３ ２０ １ ４
２ ０．９ ０．６ ０．１００ ０．４ ３０ ６ ５
３ ０．９ ０．８ ０．１２５ ０．５ ４０ １０ ８
４ ０．９ １．０ ０．１５０ ０．６ ５０ ４ ７
５ １．２ ０．４ ０．１００ ０．５ ５０ ９ ９
６ １．２ ０．６ ０．０７５ ０．６ ４０ ３ ２
７ １．２ ０．８ ０．１５０ ０．３ ３０ １１ １１
８ １．２ １．０ ０．１２５ ０．４ ２０ ８ １０
９ １．５ ０．４ ０．１２５ ０．６ ３０ １３ ６
１０ １．５ ０．６ ０．１５０ ０．５ ２０ １５ １５
１１ １．５ ０．８ ０．０７５ ０．４ ５０ ２ １
１２ １．５ １．０ ０．１００ ０．３ ４０ ７ １２
１３ １．８ ０．４ ０．１５０ ０．４ ４０ １２ １４
１４ １．８ ０．６ ０．１２５ ０．３ ５０ １４ １３
１５ １．８ ０．８ ０．１００ ０．６ ２０ １６ １６
１６ １．８ １．０ ０．０７５ ０．５ ３０ ５ ３
１．２．３ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ退火温度试验
在最佳反应体系基础上进行退火温度实验，筛选
各个引物的最佳退火即复性温度。以ＵＢＣ８１８（５′－ＣＡＣ
ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＧ－３′，Ｔｍ＝５２℃）为例，采用梯
度ＰＣＲ模式，在其Ｔｍ 值上下浮动４～６℃的情况下设
置１２个梯度（４８．００、４８．３０、４８．９０、４９．７０、５０．８０、５２．３０、
５４．００、５５．４０、５６．５０、５７．３０、５７．８０和５８．００℃），扩增程
序与前文正交设计程序一致。
１．２．４ 反应体系稳定性试验及引物筛选
用ＵＢＣ８１８引物对华扁穗草不同个体进行ＩＳ－
ＳＲ－ＰＣＲ扩增，对筛选出的最佳体系进行稳定性检
测和引物筛选。
２ 结果与分析
２．１ 华扁穗草ＤＮＡ提取结果
从华扁穗草ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳图（图１）可以看
出，在２３ｋｂ处有一条清晰的主条带，说明所提ＤＮＡ基
因组完整性好，无明显降解现象。另外，ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ
微量紫外分光光度计对华扁穗草ＤＮＡ进行浓度检测，
其浓度在１４９～５９２．３ｎｇ／μＬ之间。总之，所得ＤＮＡ纯
度较高，能够满足后续ＩＳＳＲ－ＰＣＲ分析的要求。
图１ 华扁穗草基因组ＤＮＡ电泳图（Ｍ：μＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ标准分子量参照物）
Ｆｉｇ．１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ（Ｍ：μＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌａｄｄｅｒ）
２．２ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验数据统计
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验电泳凝胶成像结果见图２，
其中组合１５所得条带清晰且稳定性好。１６个处理
两次重复的评分结果见表１。
根据评分计算每一因素同一水平下的得分之和
Ｔ与每一因素同一水平下的平均值Ｘ，统计分析同
一因素不同水平间平均值的极差Ｒ见表２。
极差Ｒ值代表该因素对扩增结果的影响程度，
Ｒ越大影响越显著，反之越小。由表２可知，各因素
浓度的变化对华扁穗草扩增情况的影响由大到小依
次为ｄＮＴＰ、Ｍｇ２＋、模板ＤＮＡ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶和
引物。
—７４—
包 蕊 胡延萍 王 莉 旭荣花 李 毅 华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化及引物筛选
１～１６为处理组合编号（见表１）Ｍ：２００ｂｐ标准分子量参照物
１～１６：Ｎｕｍｂｅｒｓ ａｒｅ ｓｈｏｗｎ ｉｎ Ｔａｂｌｅ １．Ｍ：２００ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌａｄｄｅｒ
图２ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验电泳结果（引物为ＵＢＣ８０７）
Ｆｉｇ．２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ（ＵＢＣ８０７Ｐｒｉｍｅｒ）
表２ 华扁穗草直观分析结果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ
计算结果
Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ
镁离子
Ｍｇ２＋
ＴａｑＤＮＡ聚合酶
ＴａｑＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
脱氧核糖核苷三磷酸
ｄＮＴＰ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
模板ＤＮＡ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ
Ｔ１ ４５ ６８ ２１ ７３ ８５
Ｔ２ ６３ ７３ ８０ ５８ ６０
Ｔ３ ７１ ７５ ８２ ７４ ６８
Ｔ４ ９３ ５６ ８９ ６７ ５９
Ｘ１ ５．６２５ ８．５００ ２．６２５ ９．１２５ １０．６２５
Ｘ２ ７．８７５ ９．１２５ １０．０００ ７．２５０ ７．５００
Ｘ３ ８．８７５ ９．３７５ １０．２５０ ９．２５０ ８．５００
Ｘ４ １１．６２５ ７．０００ １１．１２５ ８．３７５ ７．３７５
Ｒ ６．０００ ２．３７５ ８．５００ ２．０００ ３．２５０
注：Ｔ１－Ｔ４为每一因素同一水平下的总和；Ｘ１－Ｘ４为每一因素同一水平下的平均值；Ｒ为极差。
Ｎｏｔｅ：Ｔ１－Ｔ４，Ｓｕｍ ｏｆ ｅｖｅｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｖｅｌ；Ｘ１－Ｘ４，Ｍｅａｎ ｏｆ ｅｖｅｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｖｅｌ；Ｒ，Ｒａｎｇｅ．
由平均值Ｘ得出每一因素的最佳浓度，即：该
因素的最佳浓度是最大Ｘ对应的水平。因此，Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶以水平３、Ｍｇ２＋水平４、ｄＮＴＰ水平４、
引物水平３和ＤＮＡ水平１较好。即影响华扁穗草
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验设计５个因素的最佳水平为：
１．８０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋、０．８０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、
０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ、０．５μｍｏｌ／Ｌ 引 物 和 ２０ｎｇ
ＤＮＡ。尽管各个因素的最佳组合在正交表中没有
出现，但最接近扩增效果最好的处理１５。
为判断各个因素对华扁穗草扩增结果的影响是否
显著，对评分结果进行方差分析（表３）。由Ｆ值大小可
知，ｄＮＴＰ＞Ｍｇ２＋＞ＤＮＡ＞Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶＞引物，与
极差分析结果完全一致。其中，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶和引
物对试验结果的影响不显著，模板ＤＮＡ的影响达到了
显著水平（Ｐ＜０．０５），ｄＮＴＰ和Ｍｇ２＋的影响达到了极显
著水平（Ｐ＜０．０１）。所以，还应对 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ和模板
ＤＮＡ这３个因素进行水平间的Ｄｕｎｃａｎ多重比较（表
４），以确定每个因素最适宜的水平。
极差分析（表２）和方差分析（表３）均表明，
ｄＮＴＰ不但影响华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的试验结
表３ 华扁穗草ＩＳＳＲ各因素方差分析
Ｔａｂｌｅ ３ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｆｏｒ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ＩＳＳＲ ｉｎ
Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ
变异来源
Ｓｏｕｒｃｅ
平方和
ＳＳ
自由度
ｄｆ
均方
ＭＳ
Ｆ值
Ｆ ｖａｌｕｅ
Ｐ值
Ｐ ｖａｌｕｅ
Ｍｇ２＋ １４８．５０００ ３ ４９．５０００ １４．１４２９ ０．０００１＊＊
Ｔａｑ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
２７．２５００ ３ ９．０８３３ ２．５９５２ ０．０８８５
ｄＮＴＰ ３７３．７５００ ３ １２４．５８３３ ３５．５９５２ ０．０００１＊＊
Ｐｒｉｍｅｒ ２０．２５００ ３ ６．７５００ １．９２８６ ０．１６５７
ＤＮＡ ５４．２５００ ３ １８．０８３３ ５．１６６７ ０．０１０９＊
Ｅｒｒｏｒ ５６．００００ １６ ３．５０００
注：＊＊表示０．０１水平差异极显著；＊代表０．０５水平差异显著。
Ｎｏｔｅ：＊＊Ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０．０１ｌｅｖｅｌ；＊Ｒｅ－
ｍａｒｋａｂｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０．０５ｌｅｖｅｌ．
果，而且是所有因素中影响最明显的。ｄＮＴＰ是
ＰＣＲ反应的重要原料，当浓度过低时扩增效率低，
过高则会产生错误掺入和非特异性扩增。从图２可
以看出，当ｄＮＴＰ浓度在０．０７５ｍｍｏｌ／Ｌ时扩增出
的 条 带 数 目 少 且 亮 度 低；而 在 浓 度 高 于
０．１００ｍｍｏｌ／Ｌ时扩增出的条带增多，且开始逐渐清
晰明亮。从多重比较的结果看，水平１与水平２、水平
３、水平４差异显著，水平２、水平３、水平４三者间差
—８４—
中国草地学报 ２０１４年 第３６卷 第６期
表４ 华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ因素水平间Ｄｕｎｃａｎ比较
Ｔａｂｌｅ ４ Ｄｕｎｃａｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ
ｏｆ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｉｎ Ｂｌｙｓｍｕｓｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ
镁离子
Ｍｇ２＋
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
均值
Ａｖｅｒａｇｅ
脱氧核糖核
苷三磷酸
ｄＮＴＰ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
均值
Ａｖｅｒａｇｅ
模板ＤＮＡ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ
ＤＮＡ
（ｎｇ）
均值
Ａｖｅｒａｇｅ
１．８ １１．６２５０ａ ０．１５０ １１．１２５０ａ ２０ １０．６２５０ａ
１．５ ８．８７５０ｂ ０．１２５ １０．２５００ａ ４０ ８．５０００ｂ
１．２ ７．８７５０ｂ ０．１００ １０．００００ａ ３０ ７．５０００ｂ
０．９ ５．６２５０ｃ ０．０７５ ２．６２５０ｂ ５０ ７．３７５０ｂ
注：在０．０５水平上，不同字母表示处理间差异显著，相同字母差
异不显著。
Ｎｏｔｅ：Ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｄｉｆｆｅｒ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｗｈｉｌｅ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｔｔｅｒ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｔ Ｐ＜０．０５ｌｅｖｅｌ．
异均不显著。从经济的角度考虑，选择水平 ２
（０．１００ｍｍｏｌ／Ｌ）为ｄＮＴＰ最佳浓度。
Ｍｇ２＋对华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的影响仅次于
ｄＮＴＰ。Ｍｇ２＋一方面影响Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶活性，另一
方面还能与反应液中的模板、引物及ｄＮＴＰ结合，对引
物与模板的结合、模板与ＰＣＲ产物的变性温度以及扩
增产物的特异性有影响。当Ｍｇ２＋浓度过低时，会显著
降低酶的活性而使扩增片段的含量少，如Ｍｇ２＋浓度为
０．９ｍｍｏｌ／Ｌ时，扩增出的片段亮度低；当 Ｍｇ２＋浓度在
１．２～１．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，扩增出的片段逐渐变亮；当
Ｍｇ２＋浓度为１．８ｍｍｏｌ／Ｌ时，扩增出的条带清晰且亮
度适中。由表４可知，Ｍｇ２＋浓度水平１与水平２、水平
３、水平４差异显著，且水平４与水平２、水平３差异显
著，水平２与水平３差异不显著。因此，选择水平４为
最佳Ｍｇ２＋浓度，即１．８ｍｍｏｌ／Ｌ。
当模板ＤＮＡ的浓度大于等于２０ｎｇ时，均能扩增
出条带。模板ＤＮＡ浓度在水平１和水平２、水平３、水
平４之间差异显著，而水平２和水平３、水平４之间两
两差异不显著。从图２可以看出，模板ＤＮＡ大于２０ｎｇ
后条带数目和清晰度并没有明显差异，由于模板浓度
的增加可能会增加反应中抑制的成分，因此在ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应中应尽可能降低模板的使用量。综合分析选
择水平１为最佳模板ＤＮＡ浓度，即２０ｎｇ。
Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶是ＰＣＲ扩增反应的重要因
素。在本试验设计中，参考以往我们实验室人员对
其他植物ＩＳＳＲ 分子标记体系优化的经验，Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶的量一般在０．５～０．６Ｕ［１２～１３］，我们设
置Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的量为０．４～１．０Ｕ，设计的水
平范围较小，所以对正交试验结果影响不显著。由
图２可知，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的用量过大时（１．０Ｕ）
扩增的特异性减少，扩增产物的电泳呈弥散状。从
保证扩增反应的结果和酶量充足综合考虑，确定水
平３为Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶最佳水平。
极差和方差分析表明，本次试验中引物对体系
的影响最小。由图２可知，引物浓度变化对ＩＳＳＲ
条带的数量影响不大，只是对其强弱有一定的作用，
确定引物的最优浓度为水平３（０．５μｍｏｌ／Ｌ）。
综合以上直观分析和方差分析结果，本试验各个
因素（Ｍｇ２＋、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、引物和ＤＮＡ模
板浓度）的最佳水平组合是４、３、２、３、１，但该组合并未
出现在正交设计的处理中，与扩增结果最好的处理１５
最接近。所以，本试验以接近最佳组合的处理１５为正
式试验的反应体系，即２０μｌ反应体系中包括
１．８０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋、０．８０ＵＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、０．１００
ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ、０．６μｍｏｌ／Ｌ引物和２０ｎｇ ＤＮＡ模板。
２．３ 退火温度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的影响
引物ＵＢＣ８１８退火温度试验结果如图３。从图３
１～１２泳道的退火温度分别为４８．００、４８．３０、４８．９０、４９．７０、５０．８０、５２．３０、５４．００、５５．４０、５６．５０、５７．３０、５７．８０、５８．００℃；
１３～２４是１～１２的重复；Ｍ为１００ｂｐ标准分子量参照物
Ｌａｎｅｓ １～１２ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ４８．００、４８．３０、４８．９０、４９．７０、５０．８０、５２．３０、５４．００、５５．４０、５６．５０、５７．３０、５７．８０、
５８．００℃ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｌａｎｅｓ １３～１４ａｒｅ ｒｅｐｅａｔ ｏｆ ｌａｎｅｓ １－１２．Ｍ ｉｓ １００ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ
图３ ＵＢＣ８１８退火温度实验
Ｆｉｇ．３ Ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ＵＢＣ８１８
—９４—
包 蕊 胡延萍 王 莉 旭荣花 李 毅 华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化及引物筛选
可以看出，退火温度显著影响华扁穗草ＩＳＳＲ扩增
条带。当退火温度低于５０．８０℃时，扩增特异性差，
产生的杂带多，如５００～１０００ｂｐ的片段模糊，重复
性差，背景深。随着复性温度的升高，扩增特异性变
强，非特异性带减少，背景变低。当退火温度大于
５２．３０℃，引物与模板结合效率差，所得条带减少且
弱。复性温度为５２．３０℃，扩增条带清晰、丰富且稳
定，所以５２．３０℃是ＵＢＣ８１８引物的最佳复性温度。
２．４ ＩＳＳＲ最优体系验证和筛选到的引物
引物ＵＢＣ８１８对华扁穗草不同个体进行ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ扩增，均能扩增出清晰、稳定性好的条带（图
４）。由扩增结果可知，优化确定的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系
是稳定可靠的。在最佳反应条件基础上，最终选出
谱带清晰、稳定且多态性丰富的１０条引物，通过退
火温度梯度试验确定各个引物的最佳退火温度见表
５。
Ｍ为２００ｂｐ和１００ｂｐ标准分子量参照物
Ｍ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ２００ｂｐ ａｎｄ １００ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ
图４ 引物ＵＢＣ８１８对华扁穗草不同个体ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增的结果
Ｆｉｇ．４Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｕｓ ｂｙ ＵＢＣ８１８
表５ 筛选出的引物序列和退火温度
Ｔａｂｌｅ ５ Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５′→３′）
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）
８０７ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＴ ５２．０
８０８ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＣ ５４．３
８１７ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＡ ５０．８
８１８ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＧ ５２．３
８２２ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＡ ４８．３
８３４ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＹＴ ５５．４
８３６ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＧＹＡ ５８．０
８５７ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＹＧ ５０．０
８６４ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ４８．０
８９９ＣＡＴ ＧＧＴ ＧＴＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＴＧＴ ＴＣＣ Ａ ５０．０
注：Ｙ＝ （Ｃ，Ｔ）。Ｎｏｔｅ：Ｙ＝（Ｃ，Ｔ）．
３ 讨论
ＩＳＳＲ分子标记是近年来发展起来的一种非常
有前途的新型技术，其实验结果因反应体系和物种
的差异而不同［１２～１５］。本试验结果证明，不同的正交
体系组合对华扁穗草ＩＳＳＲ扩增结果影响较大。在
本研究中，极差分析和方差分析结果均表明，ｄＮＴＰ
是影响华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的最主要的因素，
这与廖丽［１６］对夏枯草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ体系优化的研究
结果一致。Ｍｇ２＋ 浓度也是影响华扁穗草ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ的重要因素，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶是 Ｍｇ２＋依赖性
酶，对 Ｍｇ２＋浓度较敏感，选择适量 Ｍｇ２＋对ＰＣＲ反
应至关重要。模板作为ＰＣＲ扩增的对象，在保证其
质量的前提下，ＩＳＳＲ对其要求并不严格。一般而
言，ＤＮＡ浓度在一定范围内对扩增条带的多少无影
响，但对得到的条带产量有影响，模板ＤＮＡ浓度越
高条带越亮，扩增产量越多［１６］。Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶
和引物浓度对华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的影响均不
显著，这与本研究中正交试验设计的因素和水平有
关。Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶是ＰＣＲ扩增反应的重要因
素，但在本试验设计中因 Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶设置的
水平范围较小，所以对正交结果影响不显著。此外，
在试验过程中，为了确保ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的重复性，建议
使用同一厂家同一批次的Ｔａｑ ＤＮＡ酶。一般ＰＣＲ
反应中引物的终浓度为０．２～１．０μｍｏｌ／Ｌ，在此范围
内ＰＣＲ产物量基本相同［１４］，本研究也证实了这一
点，华扁穗草引物浓度水平在０．３～０．６μｍｏｌ／Ｌ之
间，各水平间所得结果差异不大。
退火温度是影响华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的又一重
要因素，华扁穗草不同引物的退火温度不一样。退
火温度严重影响引物是否与模板特异的结合，退火
温度低，错配的几率高，条带的特异性差且背景深；
而提高退火温度虽可提高配对的准确性，但引物与
模板结合效果差，所得扩增条带较少。因此，为获得
稳定可靠的实验结果，对不同的ＩＳＳＲ引物需根据
其熔点逐一筛选，确定其最适退火温度。
４ 结论
本研究采用Ｌ１６（４５）正交试验方法，优化筛选华
扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的主要因素，并通过直观分
析和正交极差分析对比，确定了适合华扁穗草ＩＳ－
ＳＲ－ＰＣＲ的最佳反应体系：即２０μｌ反应体系中包括
１．８０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋、０．８０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、
—０５—
中国草地学报 ２０１４年 第３６卷 第６期
０．１００ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ、０．６μｍｏｌ／Ｌ 引 物 和 ２０ｎｇ
ＤＮＡ模板。同时，筛选出扩增条带清晰、稳定的１０
条引物，并确定了各引物的最佳退火温度。对华扁
穗草不同个体扩增的结果表明，该反应体系稳定可
靠，可用于后续华扁穗草ＩＳＳＲ遗传多样性分析。
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（７）：１１３１－１１３５．
—１５—
包 蕊 胡延萍 王 莉 旭荣花 李 毅 华扁穗草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化及引物筛选
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｐｒｉｍｅｒ
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ
ＢＡＯ Ｒｕｉ １，ＨＵ Ｙａｎ－ｐｉｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｌｉ １，ＸＵ Ｒｏｎｇ－ｈｕａ２，ＬＩ Ｙｉ １
（１．Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｔｅａｕ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉｎｉｎｇ８１０００８，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｈａｉｘｉ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｒｅａｕ，Ｄｅｌｉｎｇｈａ８１７０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ，ａｎ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ
ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｔ ｆｏｕｒ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｆｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ（Ｍｇ２＋，Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｄＮＴＰ，ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ）．
Ｔｈｅｎ，ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｎｅａ－
ｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ（２０μＬ）ｃｏｎｔａｉｎｅｄ １．８０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｍｇ２＋，０．８０ＵＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．１００ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，０．６ｍｏｌ／Ｌ ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ２０ｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ．
Ｔｅｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｗｉｔｈ ｃｌｅａｒ ａｎｄ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｂａｎｄｓ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ａｎｄ
ｐｒｉｍｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｃｌｅａｒ ａｎｄ ｓｔｅａｄｙ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｏｆ Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ．
Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｕｌｄ ｆａｖｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ ｐａｓ－
ｔｕｒｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｉｔ ｗａｓ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ
Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ ａｎｄ ｅｘｃｅｌｅｎｔ ｆｏｒａｇｅ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｂｒｅｅｄｉｎｇ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂｌｙｓｍｕｓ ｓｉｎｏｃｏｍｐｒｅｓｓｕｓ；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ；Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ；Ｐｒｉｍｅｒ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
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中国草地学报 ２０１４年 第３６卷 第６期