全 文 ：肿瘤防治研究2015年第42卷第7期 Cancer Res Prev Treat,2015,Vol.42,No.7·662·
doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2015.07.005 ·基础研究·
雪灵芝提取物对H22肝癌荷瘤小鼠免疫功能
的影响
杨歆睿，王刚，吉立宾，王海燕
Effects of Arenaria Kansuensis Aqueous Extract on Immune Function of H22 Tumor-
bearing Mice
YANG Xinrui, WANG Gang, JI Libin, WANG Haiyan
Department of Pathology, Medical College of Qinghai University, Xining 810001, China
Corresponding Author: WANG Gang, E-mail: wanggangqh@163.com
Abstract: Objective To investigate the effects of Arenaria Kansuensis aqueous extract(AKAE) on the
immune function of H22 tumor-bearing mice. Methods Mice bearing H22 solid tumor were randomly
divided into fi ve groups: control group, cyclophosphamide(CTX) treatment group and three AKAE treatment
groups (high, middle and low dosage). Each group was taken drug through administration by gavage for
10 days. After the mice were killed, the thymus and spleen were weighted respectively to calculate thymus
and spleen indexes. The lymphocyte proliferation activity and CTL toxicity were detected by MTT method.
The levels of IL-2 and IFN-γ in H22 tumor-bearing mice serum were detected by ELISA. Results After
AKAE treatment, the thymus index were (21.39±14.3)mg/g, (17.52±7.7)mg/g, and (30.57±10.2)mg/g in the
high, middle and low dosage AKAE group; the spleen index were (38.34±12.7)mg/g, (50.38±29.2)mg/g,
and (61.63±35.2)mg/g, respectively. There was significant difference between CTX treatment groups and
AKAE treatment groups. There was statistical difference between the low-dose AKAE group and control
group(P=0.013). There was statistical difference in the stimulation index(SI) of spleen lymphocyte between
high and low-dose AKAE groups(P=0.019). While, there was no signifi cant difference in CTL killing activity
among all groups. ELISA results showed that IL-2 expression in the high-dose AKAE group was higher than
that in the control group, and IFN-γ expression in low-dose AKAE group was increased obviously compared
with the control group(P=0.015). Conclusion AKAE could enhance the proliferation of spleen lymphocytes
and promote Th1 cytokines expression in H22 tumor-bearing mice.
Key words: Arenaria kansuensis aqueous extract(AKAE); H22; Immune function; Mice
摘 要：目的 探讨雪灵芝水提物（arenaria kansuensis aqueous extract, AKAE）对H22荷瘤小鼠免
疫功能的影响。方法 建立小鼠肝癌H22实体瘤模型，将小鼠随机分为5组：对照组、环磷酰胺组、
AKAE高、中、低剂量组，各组连续给药10 d。断头处死小鼠，称重胸腺和脾脏并计算胸腺、脾脏指
数；MTT法检测荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖活性及CTL细胞杀伤活性；采用双抗体夹心ELISA法检测
H22荷瘤小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平。结果 AKAE处理各组小鼠后，AKAE高、中、低剂量组胸腺
指数分别为（21.39±14.3）mg/g、（17.52±7.7）mg/g、（30.57±10.2）mg/g；脾脏指数分别为（38.34
±12.7）mg/g、（50.38±29.2）mg/g、（61.63±35.2）mg/g，各剂量组与环磷酰胺组比较具有显著差
异，AKAE低剂量组与对照组比较差异具有统计学意义（P＝0.013）；AKAE高剂量组脾淋巴细胞增
殖刺激指数（SI）与AKAE低剂量组比较差异具有统计学意义（P＝0.019），而各组CTL杀伤活性无
明显差异；AKAE高剂量组IL-2水平较对照组有所升高，而AKAE低剂量组IFN-γ水平明显升高（P＝
0.015）。结论 AKAE可以促进H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖及Th1型细胞因子的表达。
关键词：雪灵芝水提物；H22；免疫功能；小鼠
中图分类号：R735.7 文献标识码：A
收稿日期：2014-12-16；修回日期：2015-01-22
基金项目：国家自然科学基金地区基金（81060369）；
青海省应用基础研究项目（2010-Z-722）
作者单位：810001 西宁，青海大学医学院病理学教研室
通信作者：王刚，E-mail: wanggangqh@163.com
作者简介：杨歆睿（1986-），女，硕士在读，主要从
事肿瘤病理学研究
0 引言
原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，在我国
尤以肝细胞癌常见，占各种恶性肿瘤死亡率的第
二位[1]。药物治疗是其主要治疗手段之一。在治
疗的同时，机体的免疫功能会受到不同程度的影
响。祖国的传统医学中，常选用植物作为药物来
肿瘤防治研究2015年第42卷第7期 Cancer Res Prev Treat,2015,Vol.42,No.7 ·663·
调节机体的免疫功能，有着很好的效果。目前，
对藏药的药用价值和药用成分的进一步发掘研究
正在兴起。其中，从藏药植物中筛选出高效、安
全的抗肿瘤新药，具有深远的意义。藏药雪灵
芝，为青藏高原特有的石竹科蚤缀属雪灵芝亚属
埑状草本植物，生长于青藏高原海拔4 000米以上
雪线地带。国内研究表明，雪灵芝具有抗炎、抗
氧化、促消化以及对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌
具有预防作用[2-4]。我们的前期研究显示，藏药雪
灵芝水提物在一定的浓度范围内，对体外培养的
MGC-803胃癌细胞系具有增殖抑制作用，对体外
培养的小鼠脾淋巴细胞增殖及其分泌Th1型细胞因
子的表达具有促进作用[5-6]。
小鼠（H22）模型作为一种重要的肿瘤移植性
模型[7]，可在多个近交或远交系小鼠体内生长、繁
殖、接种于皮下呈结节状增长，移植于腹腔呈腹
水型增长，既是实体瘤又是腹水瘤，易于体内外
传代培养，是国内广泛用于基础研究和药物筛选
中动物肿瘤造模的一种细胞株[8-9]。
本研究希望通过观察雪灵芝水提物对H22荷瘤
小鼠免疫功能的影响，探索雪灵芝是否具有激活
体内抗肿瘤免疫的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
小鼠腹水型肝癌细胞株由中国科学院上海细
胞库建立；昆明种小鼠，雄性，体质量18~20g，
青海省地方病研究所实验动物中心提供；注射用
环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司
生产，批号11013121；雪灵芝水提物冻干粉剂由
本实验室制备，蒸馏水溶解；RPMI1640培养液为
美国Gibco公司产品；胎牛血清购自中国Hyclone
公司；ELISA试剂盒购于深圳市达科为生物技术
有限公司；细胞培养箱（HF-90型，美国Forma公
司）；酶标仪（Rayto RT-6000型，深圳雷杜生命
科学股份有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 皮下移植瘤模型的建立
将腹水型小鼠肝癌细胞H22用含10% FBS的
RPMI1640培养液培养，取最佳生长状态的细胞，
调整浓度为5×106/ml，无菌条件下注入小鼠腹腔0.2
毫升/只，6~7 d后用于皮下移植瘤的接种，用0.9%
氯化钠溶液稀释成含量为1×107/ml的细胞悬液，
按每只0.2 ml接种于小鼠右侧腋窝部皮下，接种
后随机将动物分为5组；对照组、环磷酰胺组（20
mg/kg）、AKAE高剂量组（800 mg/kg）、中剂量
组（400 mg/kg）及低剂量组（200 mg/kg）。每组
5只，对照组每日给予蒸馏水0.5 ml灌胃；环磷酰
胺组腹腔注射3.25 mg/ml浓度的环磷酰胺0.2 ml；
AKAE高、中、低剂量组分别给予不同浓度的雪灵
芝水提物0.5 ml灌胃，1次/天，连续给药10 d。
1.2.2 胸腺及脾脏指数测定
称重后断头处死小鼠，无菌条件下分离小鼠
胸腺和脾脏，称重并分别计算胸腺和脾脏指数：
胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）；脾脏指
数=脾脏质量（mg）/体质量（g）。
1.2.3 荷瘤小鼠脾淋巴细胞悬液制备
无菌条件下分离脾脏，置皿中剔除脂肪和结
缔组织，将脾组织研碎后用0.9%氯化钠溶液混
悬，经200目滤网过滤，收集滤液，1 000 r/min离
心5 min后弃上清液，加入3倍体积红细胞裂解液，
置冰上裂解1 min，4℃离心弃上清液后重复裂解一
次，用Hanks液洗涤离心细胞两次，用1 ml完全培
养液重悬，锥虫蓝染色，计数活细胞数，调整细
胞密度为2×106/ml。
1.2.4 荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖活性检测
于96孔培养板接种荷瘤小鼠脾淋巴细胞悬液
100 微升/孔，各样本设刺激孔及对照孔（各设3复
孔），刺激孔加入含Con A（终浓度1 μg/ml）培养
液80 μl，对照孔加入等量培养液80 μl。37℃、5%
CO2培养44 h，每孔加20 μl MTT（5 mg⁄ml），继
续培养4 h。吸弃上清液，各孔加入150 μl DMSO，
振荡溶解10 min，酶标仪检测490 nm波长OD值，
结果以刺激指数（SI）表示：SI=（OD刺激孔-OD
对照孔）/OD对照孔×100%。
1.2.5 细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，
CTL）的细胞杀伤活性检测
无菌条件下取各组小鼠脾脏，置于无菌100目
钢筛网中轻轻捻碎，加PBS液冲洗，并再用200目
钢筛网滤过，于无菌离心管中，1 000 r/min离心10
min，弃上清液，加细胞裂解液于4℃冰箱作用10
min，去除红细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清
液，用无血清RPMI1640培养液洗细胞2次，1 000
r/min 离心5 min，弃上清液，加含ConA 1 μg/ml、
100 u/ml青霉素的完全培养液重悬，调整细胞密度
至5×106/ml，接种于96孔板中，每孔180 μl。置于
37℃、5%CO2 培养箱48 h后，按效:靶为25:1的比
例加入H22靶细胞20 μl，同时设效应细胞对照孔、
靶细胞对照孔，各设3复孔。培养20 h后，加入
20 μl MTT，继续培养4 h后，置平板离心机1 000
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r/min离心4 min，弃上清液，每孔加入DMSO 200
μl，振荡溶解10 min，酶标仪490 nm波长处测定吸
光度（OD值），按下列公式计算CTL细胞杀伤活
性：CTL细胞杀伤活性=[1－（OD效-靶细胞－OD
效应细胞）/OD靶细胞]×100% 。
1.2.6 荷瘤小鼠血清中白细胞介素2（interleukin 2，
IL-2）及干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）水平检测
荷瘤小鼠血清中IL-2及IFN-γ的ELISA检测严
格按试剂盒说明书操作。
1.3 统计学方法
采用SPSS17.0统计学软件进行分析，数据以
均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素
方差分析，以LSD法进行显著性检验，检验水准
（α=0.05）。
2 结果
2.1 AKAE对荷瘤小鼠胸腺和脾脏指数的影响
AKAE低剂量组胸腺指数及脾脏指数均高于对
照组，见表 1。
2.2 AKAE对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖及CTL杀伤
活性的影响
MTT法对H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖指数
（SI）及CTL杀伤活性检测结果显示，AKAE高剂
量组脾淋巴细胞增殖刺激指数（SI）较对照组有
所升高，同时AKAE高剂量组明显高于AKAE低剂
量组；各组CTL杀伤活性无明显差异，见表2。
2.3 AKAE对荷瘤小鼠Th1型细胞因子的影响
ELISA检测结果显示，AKAE高剂量组IL-2水
平较对照组有所升高；而AKAE低剂量组IFN-γ水
平明显升高（P＝0.015），见图1。
3 讨论
雪灵芝藏药名“阿仲嘎保”，意为“采天地
灵气之人间仙草”，以全草或以其根入药。据藏
医药古籍《四部医典》和《秘诀遗补》记载雪灵
芝具有“治疗胃肠之溃疡、膨胀、癌症、瘰疬并能
健胃助消”。近年来环肽类物质因其具有多种生物
活性，如抗肿瘤、抗病原体、抗菌及免疫调节等
功能，使之逐渐成为石竹科蚤缀属植物药用化学
方面的研究热点。本实验发现雪灵芝水提物可以
促进小鼠脾淋巴细胞增殖以及小鼠脾淋巴细胞中
Th1型细胞因子的表达。雪灵芝水提物在0.025~0.2
mg/ml浓度范围，对小鼠脾淋巴细胞增殖具有浓度
依赖性的促进作用，其中0.05~0.4 mg/ml浓度范围
是雪灵芝激活淋巴细胞增殖、促进Th1型细胞因子
表达的最佳效应浓度范围。其结果与国内学者的
观点一致[9]。
雪灵芝的药用研究始于上世纪末，国内研究
者进行的植化研究显示，雪灵芝含有多糖、皂
甙、β-咔波啉生物碱及环肽等活性物质[10]。雪灵芝
对肝癌细胞增殖影响方面的药理研究也见诸于报
道[11]。李凤文等[12]研究报道，雪灵芝具有促进小鼠
脾细胞增殖、增强小鼠迟发性变态反应、提高小
鼠抗体生成细胞数和小鼠血清溶血素水平以及增
表1 AKAE对荷瘤鼠胸腺指数及脾脏指数的影响(x±s, n=5)
Table1 Effect of AKAE on thymus and spleen indexes of
tumor-bearing mice (x±s, n=5)
Groups Thymus index(mg/g) Spleen index(mg/g)
Control 25.53±7.70 38.48±26.60
CTX 9.41±3.41* 45.56±25.20
AKAE (high) 21.39±14.30 38.34±12.70
AKAE (middle) 17.52±7.70 50.38±29.20
AKAE (low) 30.57±10.20** 61.63±35.20***
Notes: *: P=0.013, **: P=0.046, ***: P=0.042, compared with
control group; AKAE: arenaria kansuensis aqueous extract; CTX:
cyclophosphamide
表2 AKAE对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖指数影响 (x±s,
n=5)
Table2 Effect of AKAE on lymphocyte proliferation index
of tumor-bearing mice (x±s, n=5)
Groups SI (%) CTL (%)
Control 12.88±25.22 87.07±3.25
CTX 15.12±5.82 85.65±5.26
AKAE(high) 26.09±8.32* 87.74±1.85
AKAE (middle) 8.77±10.44 85.07±4.47
AKAE (low) 0.39±9.69 83.15±3.40
Notes: *: P=0.019 compared with low-dose AKAE group; SI:
stimulation index; CTL: cytotoxic T lymphocytes
1: Control group; 2: CTX group; 3: AKAE(high); 4: AKAE(middle);
5: AKAE(low); *: P＝0.015，compared with control group; IFN-γ:
interferon-γ; IL-2: interleukin 2
图1 AKAE对荷瘤小鼠血清中IL-2及IFN-γ的影响
Figure1 Effect of AKAE on IL-2 and IFN-γ in serum of
tumor-bearing mice
肿瘤防治研究2015年第42卷第7期 Cancer Res Prev Treat,2015,Vol.42,No.7 ·665·
强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力等免疫作用。
本课题组在之前进行的体外研究基础上，开
展了雪灵芝激活荷瘤小鼠免疫功能方面的体内研
究，分别从免疫器官、免疫细胞及免疫因子三个
方面进行了研究。本实验发现AKAE在一定浓度
范围内具有增加胸腺指数和脾指数的作用，提示
AKAE具有一定的延缓荷瘤动物免疫器官衰退的
作用；药物处理后的荷瘤小鼠脾淋巴细胞IL-2和
IFN-γ分泌量相对于对照组明显升高，并且AKAE
在一定的浓度范围内可明显改善IL-2和IFN-γ分
泌能力，使荷瘤小鼠的机体免疫功能增强，在一
定的药物浓度范围内有刺激作用，说明药物成分
中含有促进淋巴细胞作用的靶向作用成分，然而
AKAE高剂量组脾淋巴细胞增殖刺激指数较对照组
有所升高，同时AKAE高剂量组明显高于AKAE低
剂量组，但对CTL细胞活性未观察到明显改变，
尚有待深入研究。
综上所述，本研究结果初步证实，AKAE对
H22荷瘤小鼠体内与抗肿瘤免疫相关的免疫器官的
重量、免疫细胞的增殖及免疫细胞因子的表达具
有一定的促进作用，为更深入地开展此方面的研
究提供了线索。
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[编辑校对：周永红]