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类叶升麻苷对阿尔采末症小鼠皮层 Ｃａｓｐａｓｅ３基因表达的影响
彭晓明，高　莉，霍仕霞，闫　明
（新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所 新疆维吾尔医方剂学实验室，新疆 乌鲁木齐　８３００４９）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１４．１２．０２９
文献标志码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１４）１２－１７６３－０６
中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ２８４．１；Ｒ３２２．８１；Ｒ３９４．２；Ｒ７４５．７
摘要：目的　探讨类叶升麻苷（ａｃｔｅｏｓｉｄｅ，ＡＳ）对阿尔采末症
（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）小鼠皮层组织中Ｃａｓｐａｓｅ３基因表
达的影响。方法　将昆明（ｋｕｎｍｉｎｇ，ＫＭ）小鼠随机分为正常
组，模型组，ＶｉｔａｍｉｎＥ（ＶＥ）组，类叶升麻苷低、中、高剂量组。
除正常组外，其余各组小鼠均腹腔注射６０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１的
Ｄ半乳糖和灌胃５ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１的三氯化铝，连续造模６０
ｄ以制备ＡＤ模型。然后给以３０、６０、１２０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１的
ＡＳ治疗３０ｄ，期间造模继续。给药完成后，利用跳台法测定
小鼠的学习和记忆能力，化学比色法测定小鼠血清及脑组织
中的ＡＣｈＥ活性；ＨＥ染色观察各组小鼠皮层组织结构变化；
免疫组化分析小鼠皮层组织中 Ｃａｓｐａｓｅ３基因表达的变化。
结果　与模型组相比，ＡＳ给药组小鼠的学习记忆能力有所
改善，其下台潜伏期和错误次数均明显延长和减少（Ｐ＜
００５或Ｐ＜００１），血清和脑组织中 ＡＣｈＥ活性明显降低（Ｐ
＜００５或 Ｐ＜００１），皮层组织中神经细胞的形态和数量明
显改善（Ｐ＜００１），且皮层组织中 Ｃａｓｐａｓｅ３基因表达明显
下调（Ｐ＜００５或Ｐ＜００１）。结论　ＡＳ对Ｄ半乳糖联合三
氯化铝诱导的小鼠脑损伤具有明显保护作用，其保护机制可
能是通过抑制小鼠皮层组织 Ｃａｓｐａｓｅ３基因表达，进而维持
皮层组织神经细胞的正常形态及数量。
关键词：类叶升麻苷；阿尔采末症；Ｄ半乳糖；三氯化铝；小
鼠；皮层；Ｃａｓｐａｓｅ３；表达
收稿日期：２０１４－０９－０３，修回日期：２０１４－１０－１０
基金项目：新疆维吾尔自治区科研机构创新发展基金项目（Ｎｏ
２０１２０１５）
作者简介：彭晓明（１９８３－），男，硕士，助理研究员，研究方向：细胞
与分子药理学，Ｅｍａｉｌ：ｐｘｍ１９８３＠１６３．ｃｏｍ；
闫　明（１９５９－），男，硕士，研究员，研究方向：药物分析
与新药研发，通讯作者，Ｔｅｌ：０９９１６６４２４１０，Ｅｍａｉｌ：ｙａｎ
ｍｉｎｇ２１ｃｎ＠１６３．ｃｏｍ
　　阿尔采末症（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种
老年性中枢神经系统退行性疾病，临床表现为记忆
力减退和认知功能障碍。目前该病在我国６５岁以
上人群中发病率在 ３％ ～５％［１］，并呈逐年上升趋
势，因此研究开发有效的 ＡＤ防治药物成为当今医
学领域的热点。类叶升麻苷（ａｃｔｅｏｓｉｄｅ，ＡＳ）是传统
补益中药———肉苁蓉中的一种苯乙醇苷类活性成
分，含量在０３％以上。前期研究工作表明［２－４］，ＡＳ
对Ｄ半乳糖或东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆以及
对Ｈ２Ｏ２诱导的 ＰＣ１２细胞氧化损伤均具有明显改
善作用，因此ＡＳ可能在ＡＤ治疗中具有潜在应用价
值。已有研究表明［５］，通过Ｄ半乳糖联合三氯化铝
诱导小鼠９０ｄ后，可出现学习记忆能力减退、老年
斑及神经细胞凋亡等 ＡＤ病样特征。Ｃａｓｐａｓｅ３是
神经细胞凋亡调控的关键基因，其与 ＡＤ发病具有
重要联系［６］。本实验利用 Ｄ半乳糖和三氯化铝联
合诱导小鼠建立ＡＤ模型，研究ＡＳ对ＡＤ小鼠皮层
组织中 Ｃａｓｐａｓｅ３基因表达的影响，为初步阐明 ＡＳ
治疗ＡＤ的作用机制及其新药研制提供实验依据。
１　材料与方法
１．１　药物与试剂　类叶升麻苷（ＡＳ，纯度＞９８％），
由本实验室自制［７］；Ｄ半乳糖（批号１４０１５３４５４６０３０
２１）购自Ｓｉｇｍａ公司；ＡｌＣｌ３·６Ｈ２Ｏ（批号２０１１０７０４）
为天津光复精细化工研究所产品；ＶｉｔａｍｉｎＥ（ＶｉｔＥ，
批号ＹＹ１１５１８）购自上海源叶生物科技有限公司；
ＡＣｈＥ试剂盒（批号 ２０１３０７１７）、ＢＣＡ试剂盒（批号
２０１３０７１２）为南京建成生物工程研究所产品；４％多
聚甲醛（批号 ０９Ｂ２７Ｃ６８）、ＳＡＢＣ免疫组化试剂盒
（批号ＳＡ１３２１００）购自武汉博士德生物工程有限公
司；Ｃａｓｐａｓｅ３一抗（批号ＧＲ１２３６８６１）、βａｃｔｉｎ一抗
（批号 ＧＲ１２３９８７１）、山羊抗兔 ＩｇＧ二抗（批号
ＧＲ１１９２２４５）为Ａｂｃａｍ公司产品。
１．２　主要仪器　ＩＶＣ独立送风隔离笼具（苏州冯氏
实验动物设备有限公司，ＩＶＣⅡ），跳台仪（济南益
延科技发展有 限 公 司，ＹＬＳ３ＴＢ），分 析 天 平
［ＢＳ２２４Ｓ，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］，全
波长酶标仪（美国 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司，ＭｕｌｔｉｓｋａｎＧｏ
１５１０），高速低温离心机（美国 Ｂｅｃｋｍａｎ公司，ＡＬ
ＬＥＧＲＡ６４Ｒ），光学显微镜 （德国 ＬＥＩＣＡ公司，
ＤＭ２５００），生物组织摊烤片机（天津天利航空机电
有限公司，ＫＺＰＪ１Ａ），生物组织包埋机（浙江科迪仪
器设备有限公司，ＫＤＢＭⅡ），组织脱水机（浙江科
迪仪器设备有限公司，ＫＥＤＥＥＫＤＴＳ３Ｄ），石蜡切片
机（德国ＬＥＩＣＡ公司，ＲＭ２１３５）。
·３６７１·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｅｔｉｎ　２０１４Ｄｅｃ；３０（１２）：１７６３～８
2014-11-11 14:51http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2014.12.029.html
１．３　动物模型制备及分组给药　ＫＭ小鼠（♀，１８
±２ｇ），购自新疆维吾尔自治区实验动物中心。于
ＩＶＣ盒中适应性饲养７ｄ，经强迫游泳和疲劳转棒测
试，剔除体能和智力较差的小鼠。选取１２０只小鼠，
称取体重，随机分成６组，即：正常组，模型组，阳性
药（ＶｉｔＥ）组，ＡＳ低、中、高剂量组，每组２０只。分组
完成后，正常组小鼠分别腹腔注射和灌胃１０ｍｌ·
ｋｇ－１·ｄ－１的生理盐水，其余各组小鼠腹腔注射６０
ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１的 Ｄ半乳糖和灌胃５ｍｇ·ｋｇ－１·
ｄ－１的ＡｌＣｌ３，连续造模６０ｄ。从 ｄ６１开始，上午小
鼠继续造模，下午对小鼠进行灌胃给药，连续给药
３０ｄ（造模和给药共９０ｄ）：① 正常组：１０ｍｌ·ｋｇ－１
·ｄ－１的生理盐水；② 模型组：１０ｍｌ·ｋｇ－１·ｄ－１的
生理盐水；③ ＶｉｔＥ组：１５０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１的维生素
Ｅ；④ ＡＳ低剂量组：３０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１的 ＡＳ；⑤ ＡＳ
中剂量组：６０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１的 ＡＳ；⑥ ＡＳ高剂量
组：１２０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１的ＡＳ。
１．４　跳台法测定小鼠学习与记忆能力　小鼠造模
ｄ８９，ＡＳ给药２ｈ后开始训练，将小鼠放入跳台箱内
适应环境３ｍｉｎ，然后立即通以３６Ｖ，２ｍＡ的交流电。
此时，小鼠为了逃避遭受电击而跃上安全平台，开始
计时并观察５ｍｉｎ内受电击的次数（即错误次数），
作为学习成绩。同时记录计时开始至小鼠走下平台
遭受电击的时间，作为下台潜伏期，潜伏期超过３００
ｓ，则以３００ｓ计算。２４ｈ后测其记忆能力：将训练
过的小鼠稳当地放于跳台上，通电并开始计时，记录
开始至小鼠走下平台的时间（下台潜伏期），以及５
ｍｉｎ内小鼠走下平台遭受电击的次数（即错误次
数），作为记忆成绩，进行统计学检验。
１．５　小鼠血清与脑组织中 ＡＣｈＥ活性的测定　小
鼠完成给药和跳台测试后，每组取 １０只摘眼球取
血，分离血清。然后在冰上剥离脑组织并称重，加入
９倍的生理盐水，匀浆并以３５００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０
ｍｉｎ，吸上清液备用。利用南京建成生物工程研究所
的ＡＣｈＥ试剂盒和 ＢＣＡ试剂盒测定小鼠血清与脑
组织中ＡＣｈＥ活性，具体测定方法为：分别设置并标
记测定管、对照管、标准管（３个）和空白管（３个）。
在测定管中加入５０μｌ的待测血清或脑组织匀浆，
标准管中加入５０μｌ的１ｍｍｏｌ·Ｌ－１标准应用液，空
白管加入５０μｌ双蒸水，对照管不加。然后在所有
管中加入５００μｌ的底物缓冲液和５００μｌ的显色应
用液，混匀，３７℃反应６ｍｉｎ。反应完成后，依次在
所有管中加入３０μｌ的抑制剂、１００μｌ的透明剂、５０
μｌ的稳定剂，同时样品对照管中加入５０μｌ的待测
血清或脑组织匀浆。混匀，室温放置１５ｍｉｎ，于全波
长酶标仪测定４１２ｎｍ处吸光度值。并通过公式计
算小鼠血清与脑匀浆中的 ＡＣｈＥ活性。血清中
ＡＣｈＥ活力＝（测定ＯＤ值－对照ＯＤ值）／（标准ＯＤ
值－空白 ＯＤ值）×标准品浓度 ×样品测试前稀释
倍数；脑匀浆中 ＡＣｈＥ活力 ＝（测定 ＯＤ值 －对照
ＯＤ值）／（标准 ＯＤ值 －空白 ＯＤ值）×标准品浓度
÷待测样本蛋白浓度。
１．６　ＨＥ染色观察小鼠皮层组织结构的变化　每
组另取１０只小鼠，脱颈椎处死，于冰上剥离脑组织，
以预冷的生理盐水洗涤１遍，之后将脑组织固定于
４％的多聚甲醛过夜。脑组织经常规脱水、透明、浸
蜡、包埋、切片（每张切片厚度约为５μｍ）后，进行
ＨＥ染色。具体方法为：①二甲苯Ⅰ５ｍｉｎ→二甲苯
Ⅱ １０ｍｉｎ→无水乙醇、９５％乙醇Ⅰ、９５％乙醇Ⅱ、
８０％乙醇各５ｓ→水洗（直接入自来水洗一遍）。②
苏木精染色５～１０ｍｉｎ。③自来水洗，洗去多余的染
液（可多洗几遍）。④盐酸乙醇分化（先备好足够的
自来水，将切片在盐酸乙醇缸内快速沾一下，立即入
自来水中返蓝，换一遍自来水继续返蓝１ｍｉｎ）。⑤
伊红染液３～５ｍｉｎ。⑥自来水洗，洗去多余的染液
（可多洗几遍）。⑦脱水（梯度酒精 ８０％、９５％Ｉ、
９５％乙醇Ⅱ、无水乙醇各５ｓ）。⑧透明（二甲苯Ⅰ、
二甲苯Ⅱ各５ｓ），取出封片（中性树胶）。⑨镜检，
在显微镜下观察切片并拍照。应用 Ｉｍａｇｅｐｒｏｐｌｕｓ
６．０分析软件分别选取相同倍数下的３个视野，进
行神经细胞计数。
１．７　免疫组化观察小鼠皮层组织中 Ｃａｓｐａｓｅ３的
表达变化　将石蜡切片按方法“１６”进行脱蜡和水
化，然后进行免疫组化染色，具体方法如下：①去除
内源性过氧化物酶：３％ Ｈ２Ｏ２室温１０ｍｉｎ，蒸馏水
洗，ＰＢＳ液洗。②预处理（抗原修复）：００１ｍｏｌ·
Ｌ－１枸橼酸抗原修复液，微波修复，解冻温度（９２～
９８）℃１０ｍｉｎ，室温冷却，蒸馏水洗１遍，ＰＢＳ液洗１
遍。③加Ｃａｓｐａｓｅ３一抗，３７℃温箱孵育６０ｍｉｎ或
４℃冰箱过夜，ＰＢＳ液洗３遍。④滴加通用型ＩｇＧ抗
体ＨＲＰ多聚体（二抗），３７℃温箱孵育２５ｍｉｎ，ＰＢＳ
液洗３遍。⑤新鲜配制的ＤＡＢ显色液显色（显微镜
下控制显色时间３～１０ｍｉｎ），自来水终止显色。⑥
苏木精复染 ５～１０ｍｉｎ，蒸馏水洗，盐酸乙醇分化
（快速沾一下），温水返蓝 １ｍｉｎ、脱水（梯度乙醇
８０％、９５％ Ⅰ Ⅱ、无水乙醇各 ５ｓ）、透明（二甲苯
Ⅰ、Ⅱ各５ｓ）。⑦封片（中性树胶），显微镜观察并
拍照。应用Ｉｍａｇｅｐｒｏｐｌｕｓ６０分析软件，分别选取
相同倍数下的６个视野，进行阳性细胞计数。同时
依照细胞阳性着色程度（抗原含量）进行吸光度评
·４６７１· 中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｅｔｉｎ　２０１４Ｄｅｃ；３０（１２）
分，评分标准为：弱阳性（１分），中等阳性（２分），强
阳性（３分）。
１．８　统计学处理　数据均以 珋ｘ±ｓ表示，利用 ＳＰＳＳ
１７０统计软件处理，用ｏｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ进行组间比
较分析。
２　结果
２．１　ＡＳ对ＡＤ小鼠学习与记忆的影响　小鼠跳台
实验常被用于评价痴呆小鼠被动回避学习记忆能
力。与正常组比较，ＫＭ小鼠经 Ｄ半乳糖联合三氯
化铝诱导 ９０ｄ后，其下台潜伏期明显缩短（Ｐ＜
００５），错误次数明显增加（Ｐ＜００１）。而经 ＡＳ给
药３０ｄ后，与模型组相比，ＡＳ各剂量组均可明显减
少小鼠下台的错误次数（Ｐ＜００１），对其下台潜伏
期具有一定延长作用，但差异无显著性（Ｐ＞００５）。
结果表明ＡＳ对Ｄ半乳糖联合三氯化铝诱导的小鼠
被动回避学习能力具有一定改善作用。从２４ｈ后
的小鼠记忆能力测试结果发现，模型组小鼠回避记
忆能力明显低于正常组小鼠，其下台潜伏期明显缩
短（Ｐ＜００５）、错误次数明显增加（Ｐ＜００５）。与
模型组相比较，除ＶｉｔＥ组以外，其余ＡＳ给药组均能
明显延长下台潜伏期（Ｐ＜００５或Ｐ＜００１）和减少
错误次数（Ｐ＜００５或 Ｐ＜００１）。此外，ＡＳ低、中
剂量组较正常组能延长小鼠下台潜伏期（Ｐ＜００５）
和减少错误次数（Ｐ＜００５或Ｐ＜００１），ＡＳ高剂量
组也能明显减少错误次数（Ｐ＜００５），结果表明 ＡＳ
具有良好的改善和增强模型小鼠记忆能力损伤的作
用（Ｔａｂ１）。
２．２　ＡＳ对ＡＤ小鼠血清和脑组织中ＡＣｈＥ活性的
影响　乙酰胆碱（ＡＣｈ）是中枢神经系统的主要神经
递质之一，与学习记忆密切相关，ＡＣｈＥ是ＡＣｈ的水
解酶，其活力可间接反映 ＡＣｈ的含量，反映胆碱能
神经功能的情况。本实验中小鼠经 Ｄ半乳糖和
ＡｌＣｌ３诱导造模９０ｄ后，模型小鼠血清和脑组织中
ＡＣｈＥ活力明显高于正常组（Ｐ＜００５），说明造模对
小鼠胆碱能神经功能有明显的损伤作用。而经不同
浓度ＡＳ治疗３０ｄ后，与模型组比较，ＡＳ低、中剂量
组均能明显抑制 ＡＣｈＥ活力（Ｐ＜００５或 Ｐ＜
００１），表明除 ＡＳ高剂量组以外，其余给药组对小
鼠的胆碱能神经功能的损伤均具有改善作用（Ｔａｂ
２）。
２．３　ＡＳ对ＡＤ小鼠皮层组织结构的影响　ＨＥ染
色后，神经细胞胞质呈紫红色，核呈紫蓝色，可以清
楚地观察细胞的整体形态。本实验中正常组小鼠皮
层脑细胞结构正常，数量较多，胞核清晰，胞质丰富，
间质无水肿表现。模型组小鼠皮层神经细胞减少，
体积变小，胞核与胞质界限模糊，核固缩呈三角形或
不规则形，核仁消失。与模型组比较，ＶｉｔＥ组小鼠
皮层神经细胞结构较正常，数量较多，虽仍有不同程
度的神经细胞变形，但变形神经细胞数量明显减少；
ＡＳ低、中、高剂量组小鼠皮层神经元细胞结构正常，
密度增高，胞核清晰，胞质丰富。表明ＡＳ对Ｄ半乳
糖联合三氯化铝诱导小鼠皮层组织损伤具有一定的
保护作用（Ｆｉｇ１，２）。
２．４　ＡＳ对 ＡＤ小鼠皮层组织中 Ｃａｓｐａｓｅ３表达的
影响　应用免疫组织化学染色法检测各组小鼠皮层
Ｃａｓｐａｓｅ３表达的变化，光镜下可见 Ｃａｓｐａｓｅ３免疫
组化染色阳性标记物为深浅不一的棕黄色颗粒，位
于神经元胞质内。结果显示模型组小鼠皮层组织可
以见到较多的Ｃａｓｐａｓｅ３免疫反应阳性神经元，其阳
性细胞数目以及光密度值评分均较正常组明显增高
（Ｐ＜００１）。而 ＡＳ各给药组小鼠皮层均可见
Ｃａｓｐａｓｅ３免疫反应阳性神经元减少，染色变浅，其
阳性细胞数目以及光密度值评分均较模型组明显降
低（Ｐ＜００５或Ｐ＜００１），而ＶｉｔＥ组无明显变化（Ｐ
＞００５）（Ｆｉｇ３，Ｔａｂ３）。
３　讨论
ＡＤ作为一种原因不明、进行性、与衰老相关的
中枢神经系统退行性疾病，是老年痴呆的最常见原
因。迄今为止，ＡＤ的发病机制仍不明确，由于缺少
理想的细胞及动物评价模型，因而导致ＡＤ的预防、
Ｔａｂ１　ＥｆｅｃｔｓｏｆａｃｔｅｏｓｉｄｅｏｎｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙｏｆｍｉｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄＡｌＣｌ３（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１２）
Ｇｒｏｕｐ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／
ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１
Ｌｅａｒｎｉｎｇ
Ｓｔｅｐｄｏｗｎｌａｔｅｎｃｙ／ｓ Ｅｒｏｒｆｒｅｑｕｅｎｃｙ／ｔ
Ｍｅｍｏｒｙ
Ｓｔｅｐｄｏｗｎｌａｔｅｎｃｙ／ｓ Ｅｒｏｒｆｒｅｑｕｅｎｃｙ／ｔ
Ｃｏｎｔｒｏｌ １２７．４４±２５．３５ ３．５６±０．８９ １８６．７２±５５．２０ １．００±０．２９
Ｍｏｄｅｌ ８６．９４±２７．６９ ６．４４±１．２０ １３５．７２±４９．５８ １．５０±０．２５
ＶｉｔＥ １５０ ９５．２４±３３．３２ ３．４１±１．１７＃＃ １６８．６５±４８．６５ １．４１±１．５８
ＡＳ ３０ １０４．７８±４５．９６ ３．４４±０．５７＃＃ ２５２．３３±６１．５２６＃＃ ０．５６±０．２５＃＃
ＡＳ ６０ ９８．９４±２６．３７ ３．８２±１．０７＃＃ ２５８．５９±７０．７７＃＃ ０．２９±０．２２＃＃
ＡＳ １２０ １０３．２９±８９．３２ ３．９４±１．４６＃＃ ２１６．３５±１０１．１６＃ ０．６５±０．３８＃
　　Ｐ＜００５，Ｐ＜００１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜００５，＃＃Ｐ＜００１ｖｓｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ．
·５６７１·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｅｔｉｎ　２０１４Ｄｅｃ；３０（１２）
Ｆｉｇ１　ＥｆｅｃｔｏｆａｃｔｅｏｓｉｄｅｏｎｔｉｓｓｕｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘｉｎｍｉｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄＡｌＣｌ３（４００×）
　　Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；Ｂ：Ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ；Ｃ：ＶｉｔＥｇｒｏｕｐ；Ｄ：ＡＳ（３０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）；Ｅ：ＡＳ（６０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）；Ｆ：ＡＳ（１２０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）
Ｔａｂ２　ＥｆｅｃｔｓｏｆａｃｔｅｏｓｉｄｅｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡＣｈＥｉｎｓｅｒｕｍａｎｄ
ｂｒａｉｎｏｆｍｉｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤｇａｌａｃｔｏｓｅｃｏｍｂｉｎｅＡｌＣｌ３（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
Ｇｒｏｕｐ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／
ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１
Ｓｅｒｕｍ／
ｋＵ·Ｌ－１
Ｂｒａｉｎ／
ｋＵ·ｇ－１Ｐｒｏ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ３．４２７±１．１１７ ０．９６５±０．１４６
Ｍｏｄｅｌ ５．５７３±１．７０８ ２．６１２±０．４７１
ＶｉｔＥ １５０ ３．５８８±０．４７２３＃ ２．０４７±０．４３８
ＡＳ ３０ ４．１７０±０．９１２＃ １．３５２±１．３８３＃＃
ＡＳ ６０ ３．３１５±１．０９０＃ １．１０９±１．１２６＃＃
ＡＳ １２０ ４．６２６±０．７６２ ０．９３９±１．６０８＃＃
　　Ｐ＜００５，Ｐ＜００１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ；＃Ｐ＜００５，＃＃Ｐ＜００１ｖｓｍｏｄ
ｅｌ．
Ｆｉｇ２　Ｅｆｅｃｔｏｆａｃｔｅｏｓｉｄｅｏｎｎｕｍｂｅｒｏｆｎｅｕｒｏｎｃｈａｎｇｅｓｏｆｃｅｒｅｂｒａｌ
ｃｏｒｔｅｘｉｎｍｉｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄＡｌＣｌ３（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
　Ｐ＜００５，Ｐ＜００１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ；＃Ｐ＜００５，＃＃Ｐ＜００１ｖｓｍｏｄｅｌ．
治疗及新药研制受到限制。文献资料显示［８－９］，Ｄ
半乳糖会引起脑神经元的一系列退行性变化。Ｄ半
Ｔａｂ３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｓｐａｓｅ３ｏｆｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘｉｎ
ｍｉｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄＡｌＣｌ３（珋ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
Ｇｒｏｕｐ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／
ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１
Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌ
ｒａｔｅ／％
Ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ
ｓｃｏｒｅ
Ｃｏｎｔｒｏｌ １４．６７±４．５８ １．７５±０．４６
Ｍｏｄｅｌ ３７．１２±１３．２９ ２．７５±０．４６
ＶｉｔＥ ３００ ２８．８８±５．５４ ２．８８±０．３５
ＡＳ ３０ ２０．５６±９．０７＃＃ ２．１１±０．７８＃
ＡＳ ６０ １４．３８±７．２１＃＃ １．６２±０．７４＃＃
ＡＳ １２０ １５．４０±３．１０＃＃ １．６０±０．５２＃＃
　Ｐ＜００５，Ｐ＜００１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ；＃Ｐ＜００５，＃＃Ｐ＜００１ｖｓｍｏｄｅｌ．
乳糖可在醛糖还原酶的作用下生成半乳糖醇和
Ｈ２Ｏ２，同时在反应过程中生成超氧阴离子。通过对
啮齿类动物长期注射 Ｄ半乳糖可引起过量的氧自
由基，在动物体内与细胞中的脂质、蛋白和核酸产生
非酶糖基化、氧化应激 －自由基损伤作用及诱导醛
糖还原酶活性增强等一系列病理改变，进而使其多
器官功能衰退而出现亚急性衰老表现。ＡＤ患者脑
组织中的铝含量也较正常人有所增高［１０］，含量可达
（３６±２９）ｍｇ·ｇ－１。铝元素具有神经毒性，其通
过离子形式可透过肠屏障和血脑屏障，进入大脑取
代Ｃａ２＋和 Ｍｇ２＋，与氨基酸链上的谷氨酸或精氨酸
的羧基结合形成谷氨酸铝盐或精氨酸铝盐的稳定复
合物。Ｙａｎｇ［１１］和Ｌｕｏ等［５］利用 Ｄ半乳糖和三氯化
铝共同作用，成功诱导小鼠产生学习记忆力减退，脑
内ＡＣｈＥ活性升高，Ａβ水平升高等 ＡＤ病理特征。
因此，应用Ｄ半乳糖联合三氯化铝对大脑的综合毒
性模型，更贴近人类的 ＡＤ病症，也更有利于 ＡＤ药
物的药效评价。
·６６７１· 中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｅｔｉｎ　２０１４Ｄｅｃ；３０（１２）
Ｆｉｇ３　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｓｐａｓｅ３ｏｆｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘｉｎｍｉｃｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＤｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄＡｌＣｌ３（４０×）
　　Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ；Ｂ：Ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ；Ｃ：ＶｉｔＥｇｒｏｕｐ；Ｄ：ＡＳ（３０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）；Ｅ：ＡＳ（６０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）；Ｆ：ＡＳ（１２０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）
　　本实验利用 Ｄ半乳糖联合三氯化铝诱导小鼠
９０ｄ后，与正常组比较，模型组小鼠的学习、记忆能
力明显下降，血清和脑组织中的 ＡＣｈＥ活性明显升
高，证明 ＡＤ模型建立成功。通过３０、６０、１２０ｍｇ·
ｋｇ－１·ｄ－１的ＡＳ治疗３０ｄ后，与模型组比较，ＡＳ各
给药组小鼠在跳台检测中均能延长下台潜伏期和减
少错误次数，同时小鼠血清和脑组织中 ＡＣｈＥ活性
亦明显降低，表明 ＡＳ对 Ｄ半乳糖联合三氯化铝诱
导的小鼠脑损伤具有明显保护作用，尤其是对小鼠
记忆能力的改善作用较明显。此外，在３０～１２０ｍｇ
·ｋｇ－１·ｄ－１的给药浓度范围内，ＡＳ对脑损伤小鼠
的保护作用无浓度依赖性。
已有研究表明［６］，ＡＤ脑内存在神经元丢失现
象，而细胞凋亡与 ＡＤ发病关系密切。Ｃａｓｐａｓｅ３是
半胱氨酸蛋白酶家族 Ｃａｓｐａｓｅｓ成员之一，不仅参与
ＡＤ患者脑内 β淀粉样蛋白的切割，还是细胞凋亡
调控的关键环节之一［１２］。正常生理状态下，
Ｃａｓｐａｓｅ３以酶原形式（３３ｋｕ）存在于细胞质中，一
旦受到凋亡信号刺激，活化的Ｃａｓｐａｓｅ３便能特异性
切割ＤＮＡ，使参与ＤＮＡ损伤修复过程的ＰＡＲＰ以及
ＤＮＡＰＫ等失活，促使染色质凝集和核酶激活，而导
致细胞凋亡［６］。因此，筛选Ｃａｓｐａｓｅ３活化抑制剂及
神经元凋亡抑制药物可能是 ＡＤ治疗的一个重要靶
向。本研究结果显示，模型组小鼠皮层组织中的神
经细胞明显减少，Ｃａｓｐａｓｅ３基因表达明显上调。而
经不同浓度 ＡＳ治疗后，小鼠皮层组织中神经细胞
的形态和数量均较模型组有明显改善，且皮层组织
中Ｃａｓｐａｓｅ３的基因表达明显下调。在给药浓度范
围内，ＡＳ对小鼠皮层组织神经细胞的形态改善和
Ｃａｓｐａｓｅ３的基因表达调控亦无浓度依赖性。
综上所述，ＡＳ能够明显提高由 Ｄ半乳糖联合
三氯化铝诱导的 ＡＤ病样小鼠学习和记忆能力，抑
制其血清和脑组织中的 ＡＣｈＥ活性。研究结果提
示，ＡＳ对Ｄ半乳糖联合三氯化铝诱导的小鼠脑损
伤具有明显保护作用，其保护机制可能与 ＡＳ抑制
小鼠皮层组织Ｃａｓｐａｓｅ３基因表达，进而维持皮层组
织神经细胞的正常形态及数量有关。但是，Ｃａｓｐａｓｅ
３基因仅仅只是Ｃａｓｐａｓｅ凋亡基因家族中的一员，而
ＡＤ又是多因素引起的复杂性疾病，因此在对ＡＤ小
鼠治疗过程中，ＡＳ仅是通过抑制 Ｃａｓｐａｓｅ３基因表
达，亦或是其还通过其他作用靶点发挥作用，仍有待
于更深入的研究。
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ＸｉｎｊｉａｎｇＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＵｙｇｈｕｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００４９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｉｍ　Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｅｃｔｏｆａｃｔｅｏｓｉｄｅ
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ｏｄｓ　Ｋｕｎｍｉｎｇ（ＫＭ）ｓｔｒａｉｎｍｉｃｅｗｅｒｅａｓｓｉｇｎｅｄｉｎｔｏ
ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
（ＶｉｔＥ）ａｎｄａｃｔｅｏｓｉｄｅｇｒｏｕｐ．Ｅｖｅｒｙｇｒｏｕｐｗａｓｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙＤｇａｌａｃｔｏｓｅ（ｉ．ｐ．６０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）ａｎｄＡｌＣｌ３
（ｉ．ｇ．５ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）ｆｏｒ６０ｄｓｅｘｃｅｐｔｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｎｍｉｃｅｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｄｉｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａ
ｔｉｏｎｓ（３０，６０，１２０ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１）ｏｆａｃｔｅｏｓｉｄｅｆｏｒ
３０ｄｓ．Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｔｉｍｅ，ｍｉｃｅｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ
ｌｙｂｙＤｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄＡｌＣｌ３．Ｔｈｅｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙ
ｏｆｍｉｃｅｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｓｔｅｐｄｏｗｎｔｅｓｔ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ
ＡＣｈＥｉｎｓｅｒｕｍａｎｄｂｒａｉｎｏｆｍｉｃｅｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙ
ｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ，ｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｃｅｒｅｂｒａｌ
ｃｏｒｔｅｘｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙＨＥｓｔａｉｎｉｎｇ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎｏｆｃａｓｐａｓｅ３ｉｎｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘｗａｓａｎａｌｙｚｅｄ
ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　
Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｍｏｄｅｌｇｒｏｕｐ，ａｃｔｅｏｓｉｄｅｃｏｕｌｄｉｍｐｒｏｖｅ
ｔｈｅｌｅａｒｎｉｎｇａｎｄｍｅｍｏｒｙａｂｉｌｉｔｉｅｓ（Ｐ＜００５ｏｒＰ＜
００１），ｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡＣｈＥｉｎｓｅｒｕｍａｎｄ
ｂｒａｉｎ（Ｐ＜００５ｏｒＰ＜００１），ａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｍｏｒ
ｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｎｕｍｂｅｒｏｆｎｅｕｒｏｎｉｎｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘ（Ｐ＜
００１）．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ａｃｔｅｏｓｉｄｅｃｏｕｌｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔ
ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｓｐａｓｅ３ｉｎｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘ（Ｐ＜
００５，Ｐ＜００１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｃｔｅｏｓｉｄｅｈａｓｓｉｇｎｉｆｉ
ｃａｎｔｌｙｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｅｃｔｓｏｎｂｒａｉｎｄａｍａｇｅｏｆｍｉｃｅｉｎ
ｄｕｃｅｄｂｙＤｇａｌａｃｔｏｓｅａｎｄＡｌＣｌ３，ａｎｄｉｔ′ｓｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍｐｒｏｂａｂｌｙｒｅｌａｔｅｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆｃａｓｐａｓｅ３ａｎｄｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｓｔｈｅｎｏｒｍａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
ａｎｄｎｕｍｂｅｒｏｆｎｅｕｒｏｎｉｎｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｃｔｅｏｓｉｄｅ；ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓｄｉｓｅａｓｅ；Ｄｇａｌａｃ
ｔｏｓｅ；ＡｌＣｌ３；ｍｉｃｅ；ｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘ；ｃａｓｐａｓｅ３；ｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ
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