全 文 ：518 Acta Nutrimenta Sinica,Oct.,2015, Vol.37 No.5

反相高效液相色法测定腌制白花菜中
6 种有机酸的含量

Determination of Six Kinds of Organic Acids in Salted
Cleome gynandra L by RP-HPLC

黄明军 1,2，杨清华 1,2，覃彩芹 1，刘仲华 1,3，吕帮玉 1，杨新河 1
（1 湖北工程学院生命科学技术学院，孝感，432000；2 湖北大学生命科学学院，武汉，430062；
3 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，长沙 410128）
HUANG Ming-jun1,2，YANG Qing-hua1,2，QIN Cai-qin1，LIU Zhong-hua1,3，LV Bang-yu1，YANG Xin-he1
(1School of Life Science and Technology, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000; 2 School of Life Science, Hubei University, Wuhan，
430062;3 National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients,Changsha 410128,China)

白花菜(Cleome gynandra L.)，又名羊角菜、
五梅草、臭花菜，属于双子叶植物刚罂粟目白花
菜属，广泛分布于中国大部分地区，其中以湖北
安陆一带白花菜最为有名[1]。白花菜经过腌制加
工，色泽黄亮，香味独特，咸淡适口，味道鲜美，
与其富含氨基酸、粗纤维质、蛋白质以及多种维
生素和有机酸密不可分。而有机酸类物质作为食
品中的一种重要营养成分，其定性与定量分析对
盐渍食品营养学与风味学研究以及生产过程的质
量管理意义重大。
基于高效液相色谱法近年来广泛用于水
果[2-3]、蔬菜[4-5]和茶叶[6-7]等中有机酸测定，白花
菜中有机酸种类及含量尚未有研究报道，本研究
拟建立反相高效液相色谱法检测腌制白花菜中草
酸、酒石酸、抗坏血酸、α-酮戊二酸、乙酸和柠
檬酸的含量，旨在为控制其品质提供一种重要的
分析方法，也为研究其加工过程中有机酸形成机
制及创新工艺奠定的基础。

1 材 料 与 方 法
1.1 材 料
安陆腌制白花菜成品，购于湖北省孝感市孝
武超市。
1.2 试剂与仪器
磷酸、磷酸二氢钾、草酸、酒石酸、乙酸、
抗坏血酸、柠檬酸、α-酮戊二酸，均为国产分析
纯；色谱纯甲醇(TEDIA 公司)。
戴安 UltiMate 3000 高效液相色谱仪。
1.3 方法
1.3.1 有机酸标准溶液的配制：依次称取草酸
5.00 mg、酒石酸 10.00 mg、抗坏血酸 5.00 mg、
α-酮戊二酸 10.00 mg、柠檬酸 50.00 mg，移取
40.00 μl 乙酸，分别用超纯水溶解并定容至
10.00 ml，配制成单标溶液；称相同量的上述各
种有机酸， 置于同一 10.00 ml 容量瓶中后用超
纯水溶解并定容，配制成混合标准溶液。将各溶
液置于 4℃冰箱保存，使用前经 0.45 μm 膜过滤。
1.3.2 色谱条件的优化：选用 Waters 公司的分析
型 XbridgeTM C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，
UV(DAD-3000RS)紫外二极管阵列检测器检测，以
磷酸二氢钾缓冲液为流动相，210 nm 作为检测波
长，依次考察缓冲盐浓度、pH 值、甲醇添加量、
柱温及流速等因素对 6 种有机酸分离和保留时间
的影响，确定优化的色谱条件。
1.3.3 样品预处理：准确称取已切碎混匀的腌制
白花菜 12.00 g 置于 250 ml 三角瓶中，再添加
200 ml 超纯水，于 100℃的水浴锅中浸提，每隔
10 min 振摇一次，浸提 50 min 后趁热抽滤，残
渣用适量超纯水洗涤 2 次，洗液并入滤液，冷却
后定容至 250 ml，用 0.45 μm 膜过滤，待测。
收稿日期 2015-04-09
基金项目 国家自然科学基金面上项目（No.31370692）；湖北省自然科学基金面上项目（No.2014CFB573）
作者简介 黄明军（1991-），男，硕士研究生，E-mail：mingjunhuang520@163.com；通讯作者：杨新河
中图分类号 R151.3 文献标识码 B 文章编号 0512-7955(2015)05-0518-03
DOI:10.13325/j.cnki.acta.nutr.sin.2015.05.032
营养学报 2015 年第 37 卷第 5期 519
1.4 数据处理
在 Chromeleon 7.10 色谱工作站中，比对各
种有机酸单标、混合标样及样品中峰的保留时间
来进行定性分析；根据峰面积和标准曲线，对样
品中各有机酸进行定量分析。

2 结 果
2.1 色谱条件的确定
2.1.1 流动相中 KH2PO4浓度：固定流动相 pH 2.60,
甲醇的添加量 7%、流速 0.5ml/min、柱温 20℃，
考察缓冲盐浓度分别为 0.005、0.010、0.050、
0.100、0.150mol/L KH2PO4 时对 6 种有机酸的分
离效果。当 KH2PO4浓度在 0.001～0.050mol/L 之
间时，各种有机酸的保留时间几乎无变化；浓度
低于 0.050mol/L 时，柠檬酸拖尾；浓度达到
0.100mol/L 及以上时，柠檬酸、α-酮戊二酸的
保留时间明显比 0.050mol/L 时低 1min，且各有
机酸分离度良好。另外，考虑到 KH2PO4浓度超过
0.100 mol/L 时可能会对泵和色谱柱寿命产生一
定影响。因此，宜选用 0.100 mol/L KH2PO4溶液。
2.1.2流动相 pH值：固定缓冲盐浓度 0.100 mol/L
KH2PO4、甲醇的添加量 7%、流速 0.5 ml/min、柱
温 20℃，考察用 85%磷酸调节 pH 分别为 2.20、
2.40、2.60、2.80、3.00 时对 6 种有机酸的分离
效果。当 pH 2.20 时，草酸和酒石酸保留时间相
差小，二者不能达到基线分离；pH 2.40 时，除
了 α-酮戊二酸和乙酸分离度较低外，与其它 pH
相比较，柠檬酸保留时间最长，分析时间偏长；
pH 值 2.60 和 2.80 时，有机酸分离度均较高，而
抑制6种有机酸解离效果以pH 2.60略优；pH 3.00
时，柠檬酸和乙酸、α-酮戊二酸和抗坏血酸均不
能够达到基线分离。因此，选择流动相 pH 2.60。
2.1.3 流动相中甲醇的添加量：固定缓冲盐浓度
0.100 mol/L KH2PO4，pH2.60、流速 0.5ml/min、
柱温 20℃，考察甲醇的添加量分别为 1%、3%、5%、
7%、9%时对 6 种有机酸的分离效果。随着甲醇的
添加量在 1%～9%范围内不断增加时，草酸和酒石
酸的保留时间几乎没有变化，而柠檬酸、α-酮戊
二酸、乙酸和抗坏血酸的保留时间会逐渐降低；
当甲醇的添加量为 9%时，草酸和酒石酸不能够达
到基线分离；甲醇的添加量低于 5%时，α-酮戊
二酸峰形过宽，存在拖尾现象。依据各有机酸的
保留时间长短、分离度的大小和峰形的对称性等
指标综合考虑，选择甲醇的添加量为 7%。
2.1.4 流动相流速的选择：固定缓冲盐浓度
0.100 mol/L KH2PO4，pH 2.60、甲醇添加量 7%、
柱温 20℃，考察流速为 0.30、0.50、0.70、
0.90 ml/min 时对 6 种有机酸的分离效果。随着
流速在 0.30～0.90 ml/min 范围内提高，对各种
有机酸分离的影响较大，其中各有机酸保留时间
降低、分离度下降；当流速 0.70 ml/min 时，草
酸与酒石酸保留时间很接近，未达到有效分离；
当流速 0.90 ml/min 时，各种有机酸分离度很低，
相互间峰出现重叠。此外，柱压随着流速上升而
升高，对柱子寿命会产生一定的影响。当流速过
低时，各种有机酸保留时间明显增加，分析时间
延长。因此，选择流速 0.50 ml/min。
2.1.5 柱温选择：固定缓冲盐浓度 0.100 mol/L
KH2PO4 ， pH2.60 、 甲 醇 的 添 加 量 7% 、 流 速
0.50 ml/min，考察柱温为 15.0、20.0、25.0、
30.0、35.0℃时对 6 种有机酸的分离效果。柱温
15.0℃时，6 种有机酸能够分离，但柠檬酸和乙
酸的保留时间过长；当柱温 25.0℃和 30.0℃时，
柠檬酸和乙酸未能达到理想的基线分离；当柱温
35.0℃时，柠檬酸和乙酸保留时间比 25.0℃以下
温度时的明显降低，但相邻有机酸分离度降低，
且柱温过高长时间使用对柱子寿命影响大。当柱
温 20.0℃时，各有机酸保留时间合理、分离度好、
峰型对称，且有利于保护色谱柱，因此，柱温以
20.0℃为宜。
2.2 方法学考察
2.2.1 线性方程和检测限：按照优化的色谱条件
测定有机酸混合标准溶液稀释配制的 5 个浓度梯
度溶液。以各有机酸浓度(X，mg/ml)与峰面积(Y)
进行线性回归分析，得到回归方程、线性范围和
相关系数；以 3 倍信噪比(S/N)时各有机酸对应的
质量浓度作为检测限，结果见表 1。
2.2.2 回收率：精密移取一定体积各有机酸含量
已知的样品溶液和混合标准品溶液配制成待测溶
液，按照优化的色谱条件进行测定后计算得到 6
种有机酸的回收率在 94.3%～103.7%之间。
2.2.3 精密度：将混合标准品溶液测定 5 次，计
算得到草酸、酒石酸、抗坏血酸、α-酮戊二酸、
乙酸、柠檬酸的峰面积的 RSD 值分别为 0.66%、
520 Acta Nutrimenta Sinica,Oct.,2015, Vol.37 No.5
0.26%、0.21%、0.07%、0.40%、0.50%，表明该方 法的精密度好。
Table 1 Regression equation, linearity range, correlation coefficient and detection limit of six organic acids
Organic acid Linear equation Linearity range (mg/ml) Correlation index(r) LOD (μg/ml)
2100.0 999.0 075.0-310.0 802.6+x8.152 = y dica cilaxO
0300.0 799.0 080.1-050.0 004.1+x51.93 = y dica ciratraT
4100.0 789.0 047.0-230.0 59.5-x6.792 = y dica cibrocsA
α 0340.0 999.0 002.1-420.0 733.4+x3.822 = y etaratulgotek-
2400.0 999.0 002.4-003.0 492.1+x08.41 = y dica citecA
0551.0 999.0 030.5-051.0 539.1+x94.82 = y dica cirtiC

2.2.4 重复性：精密称取 5份白花菜样品 12.00g，
按照优化的色谱条件对样品制备液进行测定表
明，草酸、酒石酸、抗坏血酸、α-酮戊二酸、乙
酸、柠檬酸含量的 RSD 值分别为 1.27%、2.31%、
1.82%、0.93%、2.51%、0.69%，表明该方法的重
复性好。
2.3 样品中有机酸含量的测定（图 1,2）

1. oxalic acid; 2. tartaric acid; 3. ascorbic acid; 4. α-ketoglutarate；
5. acetic acid; 6. citric acid；the same in Fig.2
Fig.1 HPLC chromatogram of organic acids standards








Fig.2 HPLC chromatogram of organic acids samples

按照优化的色谱条件对有机酸混合标准品溶
液和样品制备液进行测定，谱图分别见图 1 和图
2。计算得到样品中草酸、酒石酸、抗坏血酸、α-
酮戊二酸、乙酸和柠檬酸含量依次为（8.69±
0.02）、（0.39±0.13）、（0.94±0.06）、（0.51±
0.31）、（1.91±0.12）和（3.85±0.25）mg/g。
表明草酸和柠檬酸为其主要有机酸，二者对腌制
白花菜呈现咸淡适口，味道鲜美的独特风味发挥
了重要作用。此外，含量相对较低的四种有机酸
及有机酸与其他呈味小分子共同作用，对腌制白
花菜的整体风味也有一定的影响。
本研究建立的 RP-HPLC 同时测定腌制白花菜
中 6 种有机酸的方法，适合研究白花菜腌制加工
中有机酸变化规律及机制，进而推测所产生的微
生物菌群，阐明腌制白花菜风味形成机制。

关键词：反相高效液相色谱法；腌制白花菜；有机酸
Keywords: RP-HPLC；salted Cleome gynandra L.；organic acid
[参 考 文 献]
[1] 中国医学科学院药物研究所.中药志第 3 册[M].2 版.北京：人
民卫生出版社，1984：303.
[2] 张娥珍,崔素芬,辛明,等.HPLC法同时测定不同种类芒果中 10
种有机酸的研究[J].食品科技,2014,3：276－280.
[3] 崔婧,段长青.反相高效液相色谱法测定葡萄中的有机酸[J].
中外葡萄与葡萄酒,2010,5：25－30.
[4] 叶秀娟,郑炯.高效液相色谱法同时测定泡蒜中的有机酸[J].
中国调味品,2014,11：100－104.
[5] 徐月,高慧,贾天柱. HPLC 测定五味子不同炮制品及不同部位
有机酸含量[J].中国中医药信息杂志,2014,7：85－88.
[6] 张静,蒋华军,刘仲华.亲水性硅胶反相色谱柱同时分离测定
红茶中的有机酸[J].食品安全质量检测学报,2014,8：2476－
2481.
[7] 刘盼盼,钟小玉,许勇泉，等.茶叶中有机酸及其浸出特性研究
[J],茶叶科学,2013,33：405－410.



2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
-1
A
bs
or
ba
nc
e(
m
A
U
)
1
2
0.0 2.0
Time(min)
4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 15.0
3
4
5
6
2500
2250
2000
1750
1500
1250
1000
750
500
250
0
A
bs
or
ba
nc
e(
m
A
U
)
1
2
0.0 2.0
Time(min)
4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 15.0
3 4 5 6