全 文 ：黑龙江农业科学２０１６（１）：２３～２５
Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
云南越桔资源ＤＮＡ的提取及分析
王连润１，崔正菊２，刘家迅１，陶　磅１，万　红１，李卫芬１，潘丽云１
（１．云南省农业科学院 园艺作物研究所，云南 昆明６５０２０５；２．云南省农业科学院，云南 昆明
６５０２０５）
摘要：为系统评价云南越桔属资源的遗传多样性及亲缘关系，以云南省农业科学院园艺作物研究所蓝莓试验
基地保存的１３份云南越桔属资源叶片为材料，采用ＣＴＡＢ提取方法，对越桔基因组ＤＮＡ进行了提取，并对
获得的ＤＮＡ进行了琼脂糖凝胶电泳检测及含量测定分析。结果表明：１１份越桔叶片中提取出基因组ＤＮＡ，
且ＤＮＡ的纯度和完整性都较好，质量高，Ｄ２６０ｎｍ／Ｄ２８０ｎｍ的比值均在１．８～２．０；２份野生越桔材料未获得谱带。
关键词：越桔；基因组ＤＮＡ；提取
中图分类号：Ｓ６６３．９　文献标识码：Ａ　文章编号：１００２－２７６７（２０１６）０１－００２３－０３　ＤＯＩ：１０．１１９４２／ｊ．ｉｓｓｎ１００２－２７６７．２０１６．０１．００２３
收稿日期：２０１５－１０－１９
基金项目：云南省重点新产品开发计划资助项目（２０１３
ＢＢ０１１）
第一作者简介：王连润（１９７８－），女，云南省鹤庆县人，硕士，
助理研究员，从事果树栽培及育种研究。
通讯作者：刘家迅（１９６７－），男，学士，副研究员，从事小浆果
栽培及育种研究工作。
　　蓝莓（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ），又称越桔、蓝浆果，为杜鹃
花科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）越桔属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ Ｌ．）植物，多
年生落叶或常绿灌木。蓝莓以其风味独特、营养
保健功能强日益受到人们的关注，被列入第三代
水果行列。由于对其保健意义的科学论证，尤其
是色素在保护视力上的作用，使蓝莓受到越来越
广泛的重视［１］，联合国粮农组织将其列为人类五
大健康食品之一［２－３］。
成功提取并获得高质量的基因组ＤＮＡ是进
行果树种质资源遗传多样性、系统演化及亲缘关
系等研究的基础。目前，已经报道越桔资源基因
组ＤＮＡ 的提取一般采用植物基因组试剂盒提
取［４］、ＣＴＡＢ法提取［５］及改良ＣＴＡＢ法提取［６－７］
等方法，近年来，ＳＳＲ、ＩＳＳＲ、ＳＲＡＰ等分子标记技
术已逐渐被应用于越橘品种鉴定、亲缘关系分析
及遗传多样性研究等领域［４，６，８］。本研究在借鉴
前人研究的基础上，采用ＣＴＡＢ法对云南越桔属
资源的ＤＮＡ进行提取，并对提取产物进行了紫
外、琼脂糖凝胶电泳检测分析，旨在确定ＣＴＡＢ
法对于云南越桔属资源ＤＮＡ 提取的可行性，为
系统评价云南越桔属资源的遗传多样性及亲缘关
系等分子生物学研究，以及进一步开发利用资源
奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料
试验所用越桔材料采自云南省农业科学院园
艺作物研究所试验基地，分别为４份越桔栽培种、
５份栽培品种的２年生实生苗及４份云南野生越
桔材料。样品采集后装入泡沫冰盒中带回实验
室，于－２０℃冰箱中保存备用。
表１　供试材料
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
编号
Ｃｏｄｅ
种名 编号
Ｃｏｄｅ
种名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
１ 灿烂－３　 ８ 云南越桔
２ 灿烂－２　 ９ 灿烂
３ 灿烂－１　 １０ 密斯黛
４ 梯芙蓝 １１ 野生型－２
５ 夏普蓝 １２ 野生型－１
６ 夏普蓝－２　 １３ 野生型－３
７ 夏普蓝－１
　　２×ＣＴＡＢ 提取缓冲液为：１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０），２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０），１．４ ｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ，２％ （ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ，
４０ｍｍｏｌ·Ｌ－１β－巯基乙醇；ＴＥ缓冲液：１０ｍｍｏｌ·Ｌ－
１
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＥＤＴＡ ；氯仿－异
戊醇（２４∶１），７５％ 乙醇，液氮；２　０００ｂｐ　Ｍａｒｋｅｒ，
６×ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ，琼脂糖，ＴＡＥ 缓冲液：Ｔｒｉｓ－
ｂａｓｅ，０．５ｍｏｌ·Ｌ－１　ＥＤＴＡ，冰乙酸。主要仪器为：
台式高速离心机，恒温水浴锅，紫外可见分光光度
计，琼脂糖凝胶电泳仪，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪，
电泳槽，移液器。
３２
　　　　　黑　龙　江　农　业　科　学 １期
１．２　方法
１．２．１　ＤＮＡ提取方法　ＣＴＡＢ法参照《生物工
程实验技术手册》中“植物 ＤＮＡ的ＣＴＡＢ提取
法”进行［９］。取３～４片越桔嫩叶置于研钵中，分
３次加入液氮研磨至粉末状；将粉末置于１．５ｍＬ
的离心管中，用移液器加入７５０μＬ配置好的３％
ＣＴＡＢ 裂 解 液 ［１００ ｍｍｏｌ·Ｌ－１　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＥＤＴＡ（ｐＨ　８．０）、１．４ｍｏｌ·Ｌ－１
ＮａＣｌ、２％ＣＴＡＢ（Ｍ／Ｖ）、５％β－巯基乙醇（Ｖ／
Ｖ）］，混匀，６５℃水浴３０ｍｉｎ；１１　０００ｒ·ｍｉｎ－１，离心
５ｍｉｎ，取 上 清 液；加 入 同 体 积 的 氯 仿：异 戊
醇（２４∶１），轻摇 ３ ｍｉｎ；１１　０００ｒ·ｍｉｎ－１，离心
５ｍｉｎ，取上清液；加入同体积的冰异丙醇，混匀，
置于－２０℃静置３０ｍｉｎ；１１　０００ｒ·ｍｉｎ－１，离心
５ｍｉｎ，弃上清液；１１　０００ｒ·ｍｉｎ－１，用７５％的乙醇
离心２ｍｉｎ，洗两次，超净台下吹干，并加入６０～
１００μＬＴＥ［（１００ｍｍｏｌ·Ｌ－
１　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　８．０）、
１．０ｍｏｌ·Ｌ－１　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）缓冲液］稀释，置于
－２０℃冰箱保存备用。
１．２．２　ＤＮＡ的检测方法　①ＤＮＡ 纯度和浓度
检测。ＤＮＡ的纯度和浓度采用紫外分光光度计
检测。取２μＬ　ＤＮＡ样品，加入９８μＬ　ＴＥ缓冲
液，稀释至５０倍，用１００μＬ　ＴＥ缓冲液作为对
照，测定其在２６０及２８０ｎｍ处的紫外吸收值，计
算出Ｄ２６０ｎｍ／Ｄ２８０ｎｍ的比值。
②ＤＮＡ完整性检测。ＤＮＡ样品的完整性
采用１．５％琼脂糖凝胶电泳检测。取５μＬ　ＤＮＡ
样品，加入３μＬ　６×ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ缓冲液，混匀
后加入点样。在１．０％琼脂糖（ＥＢ染色）凝胶上
电泳，电泳结束后置于自动凝胶成像仪中观察，拍
照记录。
２　结果与分析
２．１　１３份云南越桔叶片 ＤＮＡ 纯度和浓度的
分析
　　从表２可知，ＣＴＡＢ法从１３份越桔资源中均
提取出了基因组ＤＮＡ，１１份样品的Ｄ２６０ｎｍ／Ｄ２８０ｎｍ
比值均介于１．８～２．０。试验过程中发现提取的
ＤＮＡ均为白色絮状沉淀，溶液清亮，无黏稠感，表
明蛋白质、ＲＮＡ、多糖和酚类等杂质去除完全，对
ＤＮＡ样液未造成污染，ＤＮＡ纯度较高；野生型－１
和野生型－３两份样品的Ｄ２６０ｎｍ／Ｄ２８０ｎｍ比值分别为
１．６３和１．４８，表明提取的ＤＮＡ纯度较低，ＤＮＡ
样液中可能存在蛋白质、ＲＮＡ、多糖和酚类等杂
质的污染。表２结果显示，不同越桔材料提取的
叶片ＤＮＡ浓度差异较大，最高达６．２９μｇ·μＬ－
１，
最低仅为０．０４μｇ·μＬ－
１，这种差异可能与不同越
桔材料的叶片在成熟度方面，以及在多糖、蛋白质
等次生物质含量方面存在差异等因素有关［１０］。
表２　１３份越桔叶片基因组ＤＮＡ紫外分析结果
Ｔａｂｌｅ　２　ＵＶ　ｓｃａｎｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　１３　ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ　ｓｐｅｃｉｅｓ
编号
Ｃｏｄｅ
种名
Ｓｐｅｃｉｅｓ
Ｄ２６０／Ｄ２８０
ＤＮＡ浓度／（μｇ·μＬ－１）
ＤＮＡ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
１ 灿烂－３　 ２．０２　 １．４１
２ 灿烂－２　 ２．０５　 １．７４
３ 灿烂－１　 ２．０６　 ３．５５
４ 梯芙蓝 ２．０７　 ３．８６
５ 夏普蓝 ２．００　 ５．９０
６ 夏普蓝－２　 １．９９　 ０．７１
７ 夏普蓝－１　 １．９９　 ０．５７
８ 云南越桔 ２．０２　 ０．７１
９ 灿烂 ２．０６　 ２．０６
１０ 密斯黛 １．９７　 ６．２９
１１ 野生型－２　 ２．０２　 ０．５９
１２ 野生型－１　 １．６３　 ０．１１
１３ 野生型－３　 １．４８　 ０．０４
２．２　１１份云南越桔叶片 ＤＮＡ的电泳分析
图１结果显示，采用ＣＴＡＢ法获得了１１份
越桔材料的ＤＮＡ谱带，ＤＮＡ结构完整，带型较
整齐，但ＤＮＡ条带不够清晰，有少量杂质及降解
迹象，且多数材料存在拖尾现象（供试材料中，野
生型－１和野生型－３未获得谱带，已删除）。
图１　１１份云南越桔资源叶片基因组ＤＮＡ电泳图谱
Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｃｈａｒｔ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ
ｏｆ　１１ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｓｐｐ．）ｓｐｅｃｉｅｓ
４２
１期 　　王连润等：云南越桔资源ＤＮＡ的提取及分析
３　结论与讨论
本研究中的ＤＮＡ电泳图谱结果显示，野生
型－１和野生型－３两份野生材料未获得清晰的谱
带，表明提取的ＤＮＡ产率极低，紫外分光光度计
检测结果也证实了这一点。该两份野生材料为于
２０１４年４月份从云南野外收集并盆栽的越桔资
源，实验取样时植株尚未萌发新梢新叶，故采集了
中老叶片，由此可见，采用ＣＴＡＢ法提取越桔叶
片基因组ＤＮＡ时材料必须为嫩叶，或采用该方
法提取越桔基因组ＤＮＡ只适用于幼嫩材料，这
与徐娜等［５］的结论一致。该两份野生叶片材料较
老，提取的ＤＮＡ产率极低，推测ＤＮＡ样液中可
能存在蛋白质、ＲＮＡ、多糖和酚类等杂质的污染，
具体原因有待于进一步的研究。
ＤＮＡ谱带出现拖尾现象，且谱带并不十分清
晰，这可能与含有酚羟基的小分子次生代谢产物
如黄酮、有机酸、鞣质等未彻底去除，氧化后与
ＤＮＡ结合，引起ＤＮＡ降解或抑制了酶的活性有
关，具体原因有待于进一步的研究。在今后云南
越桔资源的ＤＮＡ提取过程中，采取相应的措施
对ＣＴＡＢ法进行改良，尽量使这些越桔叶片中含
有的小分子次生代谢产物去除完全，或许能获得
更清晰的ＤＮＡ谱带，此方面的工作有待于进一
步的开展。
紫外分光光度计检测研究结果表明，采用
ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ可以满足越桔ＰＣＲ、ＳＳＲ、
ＳＲＡＰ等一般分子生物学研究对ＤＮＡ 质量的要
求，但为了获得更高质量的ＤＮＡ，以及谱带更清
晰、无“拖尾”现象等结果的ＤＮＡ电泳图谱，实验
过程中除取样时必须严格采集幼嫩叶片除外，还
需要对ＣＴＡＢ法进行进一步的优化。本研究为
云南越桔资源ＤＮＡ提取方法和试验材料的选择
提供了科学依据，为进一步开展云南越桔属资源
的遗传多样性及亲缘关系等分子生物学研究奠定
了基础。
参考文献：
［１］　於虹，顾姻，贺善安．我国南方地区越橘栽培现状及发展展
望［Ｊ］．中国果树，２００９（３）：６８－７０，７２．
［２］　顾姻，贺善安．蓝浆果与蔓越桔［Ｍ］．北京：中国农业出版
社，２００１．
［３］　和加卫，徐中志，唐开学，等．云南越桔的组织培养［Ｊ］．植物
生理学通讯，２００７，４３（２）：３２０．
［４］　崔建民，刘红霞，邹荣仟，等．越橘种质资源遗传多样性和亲
缘关系研究［Ｊ］．果树学报，２０１０（３）：３７３－３７８．
［５］　徐娜，夏秀英，徐大可，等．越橘基因组的快速提取及分
析［Ｊ］．果树学报，２００７，２４（５）：７１４－７１７．
［６］　於虹，顾姻，贺善安，等．越橘品种的ＩＳＳＲ鉴定及其亲缘关
系分析［Ｊ］．吉林农业大学学报，２００９，３１（５）：５１２－５１５．
［７］　尹德洁，苏淑钗，刘肖，等．蓝莓ＳＲＡＰ－ＰＣＲ反应体系的建
立优化及引物筛选［Ｊ］．东北林业大学学报，２０１３（２）：
３５－３９．
［８］　尹德洁．蓝莓野生资源和ＳＲＡＰ遗传多样性研究［Ｄ］．北
京：北京林业大学，２０１２．
［９］　栾雨时，包永明．生物工程实验技术手册［Ｍ］．北京：化学
工业出版社，２００５：１６４－１６８．
［１０］　佟兆国，王富荣，章镇，等．一种从果树成熟 叶片提取
ＤＮＡ的方法［Ｊ］．果树学报，２００８，２５（１）：１２２－１２５．
Ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｏｆ
Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｓｐｐ．）Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｉｎ　Ｙｕｎｎａｎ
ＷＡＮＧ　Ｌｉａｎ－ｒｕｎ１，ＣＵＩ　Ｚｈｅｎｇ－ｊｕ２，ＬＩＵ　Ｊｉａ－ｘｕｎ１，ＴＡＯ　Ｐａｎｇ１，ＷＡＮ　Ｈｏｎｇ１，ＬＩ　Ｗｅｉ－ｆｅｎ１，ＰＡＮ
Ｌｉ－ｙｕｎ１
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｒｏｐｓ，Ｙｕｎｎａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｕｎｍｉｎｇ
６５０２０５；２．Ｙｕｎｎａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｕｎｍｉｎｇ　６５０２０５）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ　ｒｅｓｏｕｒｃｅ，ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡ　ｏｆ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　１３ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｓｐｐ．）ｓｐｅｃｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ，ｗｈｉｃｈ　ｆｒｏｍ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｒｏｐｓ，Ｙｕｎｎａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎｄ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ＤＮＡ　ｏｂ－
ｔａｉｎｅｄ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎｄ　ＵＶ　ｓｃａｎｎｉｎｇ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　１１ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｓｐｐ．）ｓｐｅｃｉｅｓ　ｂｙ　ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｐｕｒｅ，ｉｎｔｅｇｒａｌ，ｔｈｅ　ｖａｌ－
ｕｅ　ｏｆ　Ｄ２６０ｎｍ／Ｄ２８０ｎｍ ｗａｓ　１．８０ｔｏ　２．０．Ｔｗｏ　ｗｉｌｄ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｆａｉｌ　ｔｏ　ｇｅｔ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｂａｎｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍｓｐｐ．）；Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｒ
５２