全 文 ：#方药纵横#
苦玄参药材 HPLC指纹图谱的研究
陈 勇 1,刘 婧 2,李 立 1, 李 兵 1,李耀华 1
( 1. 广西中医学院药学院,广西 南宁 530001; 2. 广西民族医药研究所, 广西 南宁 530001)
摘 要: 目的:建立苦玄参药材 H PLC指纹图谱分析方法,科学评价并有效控制苦玄参药材质量。方法:采用反相高
效液相色谱法, C18柱 ( 5Lm, 4. 6mm @ 250mm ), 乙腈 - 0. 3%磷酸溶液梯度洗脱, 流速 1. 0m L /m in, 检测波长 264nm, 柱温
25e ,使用 /计算机辅助相似度评价软件0进行数据处理。结果: 建立了苦玄参药材的 H PLC指纹图谱, 以苦玄参苷 IA为
参照峰, 确立了苦玄参药材指纹图谱中的 22个共有峰, 测定了 15批次苦玄参 H PLC指纹图谱与对照药材图谱的相似
度。结论: 所建立的苦玄参药材 HPLC指纹图谱,精密度、重现性和稳定性较好, 有助于苦玄参药材的规范化种植及药材
的质量控制。
关键词: 苦玄参;苦玄参苷 IA; HPLC; 指纹图谱;相似度
中图分类号: R284. 1 文献标识码: A 文章编号: 1000 -1719( 2008) 05 - 0749 - 03
Studies on F ingerprints ofP icriafel- tarrae Lour by HPLC
CHEN Yong1, LIU J ing2, LI L i1, L I B ing1, L I Yao-hua1
( 1. Pharmacy College of G uangx i T rad itiona l ChineseM edica lUniversity, Nann ing 530001, Guangxi, China;
2. Guangxi Institute o f Na tionalM edicine, Nanning 530001, Guangx i, China )
Abstrac t: Ob jective: Estab lish HPLC fingerprin ts o f P ic ria fel - tarrae Lou r( PLT ); ge t the con tro l chrom atogram and the fin-
ge rprin ts o f PTL co llected so as to estab lish a sensitive and specific m ethod for controlling the quality o f PTL. M ethod s: RP -
HPLC w as used on aC18 co lum n, w ith am ix tu re so lution o f ace tonitrile and 0. 3% H3PO 4 asm obile phase using a g radien t e lu tion.
The flow rate w as 1. 0m l /m in , the co lum n temperatu re w as 25e ; and the de te ction w aveleng th w as 262nm. Use the Compu ter
A ided S im ilarity Eva lua tion softw are to compare the qua lity o f PLT. R esu lts: The HPLC fingerprints of P icria fe l - tarrae Lou r,
show ing 22 cha rac te ristic peaks, w as estab lishied from 15 losts o f P icriafe l - tarrae Lour. C onclusion: Estab lish the RP - HPLC
finge rprint chroma tog ram of PLT , ge t reference fingerprin t chrom atogram. Thism e thod is sensitive, quick, and use fu l to actua lize
standard ization plan ting. It can be used for the qua lity con tro l for PLT.
K eywords: picria fe l - ta rrae lour; piefe lta rraen in IA; HPLC; finge rprin ts; sim ilarity
收稿日期: 2007 - 12 - 08
基金项目:科技部西部开发科技行动资助项目 ( 2002BA901A14 -C ) ;广
西高校人才小高地建设创新团队资助计划
作者简介:陈勇 ( 1961 - ) ,男,江西南昌人,教授,学士,主要从事中药及
其制剂的质量分析教学与科研。
苦玄参,又名苦草、蛇总管、鱼胆草,为玄参科苦玄
参属植物 ( P icria fel - tarrae Lou r)的干燥全草, 产于我
国广西、广东、云南和贵州等地, 该药已收载于5广西
中药材标准6 1990年版。苦玄参为一年生草本, 在广
西民间作为药用已有很长的历史,其性寒味苦,主治风
热感冒、咽喉肿痛、痄腮、疖肿、泄泻痢疾、痔疮、湿疹,
毒蛇咬伤、跌打损伤等, 具有清热解毒, 凉血消肿之功
效 [1 ]。目前,对苦玄参的研究多集中在化学成分 [ 2- 10]
和制剂中苦玄参药材的含量测定方面 [11 - 15 ]。本文对
苦玄参药材指纹图谱的科学研究,为提高药材质量,充
分利用苦玄参药材资源,制定苦玄参规范化质量标准,
提高产品质量和市场竞争能力提供科学和理论依据,
并对广西地方中草药的开发利用, 促进优质药材规范
化生产基地建立具有重要意义。
1 材料 实验仪器与试剂
1. 1 材料 实验药材为收集于各产地的苦玄参药材
干燥全草,并经广西中医学院刘寿养副教授鉴定为玄
参科植物苦玄参 Picirade l- tarrae Lour, 具体产地与采
收时间见表 1。苦玄参对照药材由中国生物制品检验
所提供 (批号: 1018 - 200002)。苦玄参苷 IA对照品由
广西桂林植物研究所植化室梁小燕老师提供, 经
HPLC归一化法检测,含量达到 98. 0%以上。
表 1 实验用苦玄参药材产地及采收时间
编号 产地 采收时间
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
对照药材
平乐源头
平乐二矿
南宁
梧州Ñ
越南
梧州 Ò
龙州 I
龙州 Ò
梧州 Ó
宁明
龙州 Ó
本院药用植物园
龙州下冻
梧州 Ô
2000. 2
2004. 8
2004. 8
2005. 7
2004. 10
2003. 9
2003. 7
2003. 6
2004. 7
2004. 8
2003. 6
2005. 7
2005. 7
2004. 8
2005. 9
1. 2 实验仪器 Ag ilen t1100高效液相色谱仪 (美国
#749# 辽宁中医杂志 2008年第 35卷第 5期
DOI：10.13192/j.ljtcm.2008.05.112.cheny.065
安捷伦科技公司 ), 含在线真空脱气机 ( G - 1322A );
高压四元梯度泵 ( G - 1311A ); 自动进样器 ( G -
1313A );智能化柱温箱 (G - 1316A ) ;二极管阵列检测
器、可变波长检测器 ( G - 1314A ) ; Ag ilent1100 se ries
色谱工作站。CG - 16W高速微量离心机 (北京医用离
心机厂 ); SB3200 - T超声波清洗器 (上海必能信超
声 ) ; M illipo re Simp licity - 185超纯水器 (美国密里
博 ) ; BP211D电子分析天平 (德国赛多利斯 )。
1. 3 试剂 甲醇、乙腈 (色谱纯 ),其他试剂均为分析
纯。
2 实验方法与结果
2. 1 参照物溶液的配置 精密称取苦玄参苷 IA对照
品适量 (实称 10. 51mg) ,置 50mL量瓶中,用适量甲醇
溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得浓度为 0. 21mg /mL的
对照品溶液。
2. 2 供试品溶液的制备 取苦玄参药材干燥粉末
2g, 精密称定,精密加入 70%甲醇 25mL, 称重, 超声处
理 30m in, 放冷,称重, 补加 70% 甲醇至原重量, 滤过,
取续滤液离心,上清液备用。
2. 3 色谱条件 色谱柱: C18柱 ( Hype rsi,l 4. 6 @
250mm, 5Lm,大连依利特公司 )。
流动相按表 1进行梯度洗脱。
表 1 色谱流动相洗脱程序
时间 ( m in) 乙腈 (% ) 0. 3%磷酸溶液 (% )
0 10 90
20 20 80
50 40 60
70 70 30
检测波长: 264nm; 流速: 1mL /m in; 柱温: 25e ; 进
样量: 10LL; 理论塔板数: 以苦玄参苷 IA计不低于
20000。
2. 4 方法学考察 ¹ 精密度实验: 取编号为 3号的
供试品,按供试品溶液制备方法制备,在上述色谱条件
下记录指纹图谱,结果表明,各色谱峰的相对保留时间
( RSD为 0. 04% ~ 1. 49% )和峰面积占总峰面 5%以
上各峰相对峰面积 ( RSD为 0. 22% ~ 0. 77% )数值基
本一致,符合指纹图谱的检测要求。
º稳定性实验:取编号为 3号的供试品,按供试品
溶液制备方法制备, 在上述色谱条件下, 分别在 0, 4,
6, 8, 12, 24h检测指纹图谱, 结果表明, 各色谱峰的相
对保留时间 ( RSD为 0. 05% ~ 0. 92% )和占总峰面
5%以上各峰相对峰面积 ( RSD为 0. 33% ~ 1. 47% )数
值基本一致,表明样品在 24h内稳定。
»重复性实验:精密秤取苦玄参药材粉末 5份, 按
供试品溶液制备方法制备,在上述色谱条件下测定,记
录指纹图谱。结果表明, 5份样品的 HPLC指纹图谱
中各色谱峰相对保留时间 ( RSD为 0. 05% ~ 1. 27% )
和占总峰面 5% 以上各峰相对峰面积 ( RSD为 0. 39%
~ 2. 0% )数值基本一致,表明方法重复性良好。
3 指纹图谱的建立及技术参数
3. 1 参照色谱峰的建立 5中药注射剂指纹图谱研
究的技术要求 (暂行 ) 6规定制定指纹图谱必须设立参
照物,实验选取苦玄参苷 IA峰 (第 20号峰 )作为参照
物峰,进行相对保留时间和相对峰面积的计算,符合指
纹图谱研究需要。在同样色谱条件下, 取苦玄参苷 IA
对照溶液和苦玄参对照药材溶液分别进样,色谱图见
图 1、图 2。
3. 2 各批次苦玄参药材指纹图谱的采集 按照
/ 2. 20项下的方法制备 15批次苦玄参药材供试品溶
液,以5中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行 )6
建立苦玄参药材 HPLC指纹图谱。通过记录 120m in
图谱,可以看到 65m in后已无色谱峰出现, 从而确定指
纹图谱的采集时间为 65m in。取供试品溶液依次进
样,记录 15批次苦玄参药材 HPLC色谱图。 15批苦
玄参药材 HPLC叠加色谱图见图 3。
图 3 15批苦玄参药材 HPLC叠加色谱图
3. 3 共有指纹峰的标定 实验借助了国家药典委颁
布的5中药色谱指纹图谱相似度评价系统 A版6软件,
对指纹图谱的相关参数进行自动匹配, 标定药材的共
有指纹峰,同时给出对照指纹图谱等功能。采用软件
自动匹配 15批次苦玄参药材 HPLC图谱,标定其中匹
配数目为 15的 22个色谱峰为共有指纹峰。选择编号
为 1的苦玄参对照药材图谱为参照图谱,以中位数法
#750# 辽宁中医杂志 2008年第 35卷第 5期
作为对照指纹图谱的生成方法, 设定时间窗宽度为
0. 20m in,提取苦玄参药材的共有模式建立对照指纹图
谱,结果见图 4。
峰面积占总峰面积 5%以上的共有峰为: 6号、8
号、9号、15号、20号。选定指纹图谱中峰面积相对较
大的第 20号共有峰为参照物峰。以参照物峰的保留
时间和峰面积作为 1, 分别计算共有指纹峰的相对保
留时间和相对峰面积。结果表明, 不同批次苦玄参药
材共有峰相对保留时间 RSD小于 1. 0% ,而相对峰面
积 RSD较大。由此可知, 本实验建立的色谱方法可以
使不同批次苦玄参药材具有基本一致的色谱行为, 但
药材之间各种化学成分的含量受多种因素的影响具有
较大差异。
图 4 共有模式建立对照指纹图谱
3. 4 苦玄参药材相似度评价 本实验采用5中药色谱
指纹图谱相似度评价系统 A版6进行苦玄参药材 HPLC
指纹图谱相似度计算,计算结果见表 2。15批次苦玄参
药材与对照药材指纹图谱的相似度计算结果均大于
0. 8,表明各批次苦玄参药材与对照指纹图谱有较好的
一致性,本方法可用于综合评价药材的整体质量。
表 2 苦玄参药材 HPLC指纹图谱相似度计算结果
苦玄参药材 相关系数 1 相关系数 2
对照药材 1 0. 969
平乐源头 0. 911 0. 903
平乐二矿 0. 936 0. 941
南宁 0. 962 0. 99
梧州Ñ 0. 925 0. 952
越南 0. 909 0. 933
梧州 Ò 0. 947 0. 978
龙州Ñ 0. 947 0. 933
龙州 Ò 0. 953 0. 995
梧州 Ó 0. 940 0. 943
宁明 0. 940 0. 973
龙州 Ó 0. 858 0. 849
本院植物园 0. 918 0. 972
龙州下冻 0. 976 0. 972
梧州 Ô 0. 936 0. 956
注: 1.以苦玄参对照药材为模板; 2.以 15批样品均值为模板。
4 讨论与小结
为了使苦玄参药材中的主要化学成分能够在
HPLC指纹图谱中得到充分反映, 因此, 必须确定一个
有效的色谱分离方法及检测条件。实验过程中对色谱
柱、流动相、柱温及流速及检测波长的选择等几个方面
进行了考察,最后确定了实验所采用的色谱条件。
比较了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、水等提取
溶剂,结果表明以 70%甲醇为提取溶剂时, 色谱峰峰
数多,峰面积大, 整体基线好;比较了超声、回流、冷浸、
索氏提取和冷浸后超声处理等提取方法,以超声提取
法各色谱峰峰面积较大。
本实验参照5中药注射剂指纹图谱研究的技术要
求 (暂行 )6建立了苦玄参药材 HPLC指纹图谱, 并对
相关项目进行考察,采集色谱图,指定其中指纹峰的做
法具有更好的科学性,能够为苦玄参药材指纹图谱质
量标准的建立提供可靠的依据, 且前处理和色谱方法
简便易行, 便于指纹图谱技术的推广。采用5中药色
谱指纹图谱相似度评价系统 A版6对色谱参数进行匹
配和运算,结合先进的计算机技术在指纹图谱研究的
优势和特长,避免人为的失误和偏差,充分保证相似度
评价结果的准确。
本实验虽然收集了多个产地苦玄参药材样品, 采
用 HPLC法作为获取化学数据的手段, 进行了苦玄参
的指纹图谱研究,但所获得的信息也只能从一个侧面
反映苦玄参药材的质量。如果能够获得更多的代表性
的样品,按照不同来源、不同产地、不同种植期、不同采
收期、进行分类测定, 以便获得全面的分类信息, 则能
使苦玄参药材质量的评价方法更为完善。
参考文献
[ 1 ] 广西壮族自治区卫生厅. 广西中药材标准 ( 1990年版 ) [M ].南
宁:广西科学技术出版社, 1992: 225.
[ 2 ] 成桂仁,金静兰,文勇新,等.苦玄参化学成分的研究 I -苦玄参甙
元Ñ 的结构 [ J ].化学学报, 1982, 40( 8 ): 737 - 746.
[ 3 ] 甘立宪,伍文超,周维善,等. 苦玄参化学成分的研究 Ò -苦玄参
甙元 Ò 和Ó 的结构 [ J ].化学学报, 1982, 40( 9 ): 812 -820.
[ 4 ] 甘立宪,周维善,成桂仁,等. 苦玄参甙元 Ô 及其讲解物的结构研
究 [ J ].植物学报, 1982, 24( 1 ) : 59 - 64.
[ 5 ] 甘立宪,毛国青,伍文超,等. 苦玄参化学成分的研究Õ -苦玄参
甙元Õ和Ö 的结构 [ J ].化学学报, 1982, 40( 10) : 926 - 931.
[ 6 ] 成桂仁,金静兰,文永新,等. 苦玄参化学成分的研究× -苦玄参
甙 I
A
和 I
B
的结构 [ J ].化学学报, 1985, 43: 374 - 379.
[ 7 ] 金静兰,文永新,成桂仁,等. 苦玄参化学成分的研究Ø -苦玄参
甙 Ò 的结构 [ J ].化学学报, 1987, 45: 1133 - 1134.
[ 8 ] 成桂仁,金静兰, 甘立宪, 等.苦玄参酮Ñ 的结构 [ J ]. 植物学报,
1982, 24 ( 2) : 194 -196.
[ 9 ] 王力生,马学敏,郭亚健,等.苦玄参的化学成分研究 [ J ].中国中
药杂志, 2004, 29 ( 2) : 149 - 151.
[ 10 ] 邹节明,王力生,马学敏,等.苦玄参中一个新葫芦苦素成分的分
离与结构鉴定 [ J ].药学学报, 2005, 39( 11) : 910 - 912.
[ 11 ] 蒋明廉.苦玄参中苦玄参甙Ñ A的含量测定 [ J ]. 桂林医学院学
报, 1997, 10 ( 6) : 698 - 699.
[ 12 ] 陈勇,甄汉深,张延,等.炎肿化毒片的薄层鉴别及苦玄参甙 IA的
含量测定 [ J ].中成药, 1997, 19( 5 ): 14 - 16.
[ 13 ] 陈勇,甄汉深,黄蘅,等.炎见宁片的定性鉴别及其苦玄参甙 IA的
含量测定 [ J ].中成药, 1997, 19( 12 ): 12 -14.
[ 14 ] 陈勇,甄汉深, 黄蘅,等. 妇炎净胶囊中苦玄参甙 IA的含量测定
[ J ].广西中医学院学报, 1999, 16( 1 ): 38 - 40.
[ 15 ] 陈勇.几种含苦玄参的中成药定性定量研究 [ J ].中国现代应用
药学杂志, 2000, 17 ( 2) : 106 - 108.
#751# 辽宁中医杂志 2008年第 35卷第 5期