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收稿日期: 2012-02-22
基金项目: 国家自然科学基金(30970188 和 30770161)和浙江省自然科学基金(Y5090339)共同资助。
作者简介: 李文巧，女，硕士研究生。E-mail：liwenqiao87@qq.com
* 通讯作者: 刘 鹏，男，博士，教授。E-mail：sky79@zjnu.cn
安徽农业大学学报, 2012, 39(4): 560-567
Journal of Anhui Agricultural University
网络出版时间：2012-7-4 17:52:26
[URL] http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20120704.1752.033.html
珍稀濒危植物长序榆的 ISSR-PCR 引物筛选
及反应条件的优化

李文巧 1,2，徐根娣 1, 2，吴玉环 3，邱志军 1, 2，高建国 1, 2，刘 鹏 1,2*
(1. 浙江师范大学生态研究所，金华 321004；2.浙江师范大学植物学实验室，金华 321004；
3. 杭州师范大学生命与环境科学学院, 杭州 310036)

摘 要：采用正交设计试验，利用引物 UBC834 对长序榆 ISSR-PCR 扩增的主要影响因子 Buffer (含 Mg2+) 浓
度、模板 DNA、引物浓度、Taq DNA 聚合酶浓度、dNTPs 浓度进行优化分析，并在此基础上对 PCR 反应过程中
的退火温度、循环次数、延伸时间进行检测。结果表明，在 25 μL ISSR-PCR 反应体系中各因素的最佳浓度为 2.5 μL
Buffer (含 Mg2+)，50 ng 模板 DNA，2.5 U Taq DNA 聚合酶，1.2 μmol·L-1引物，0.2 mmol·L-1 dNTPs，引物 UBC834
的最佳退火温度为 57℃，最佳循环次数和延伸时间分别为 35 个循环和 1 min。此外，还利用优化的反应体系成功
筛选出 11 条 ISSR 引物，并用筛选的引物对长序榆的遗传多样性进行了分析，结果发现，在物种水平上，长序榆
的遗传多样性较高，多态位点百分率（PPB）为 82.35%，Shannon 信息指数（I）为 0.395 9，Nei’s 基因多样性指数
（H）为 0.258 5。而种群水平上的遗传多样性则较低，多态位点百分率（PPB）、Shannon 信息指数（I）、Nei’s 基
因多样性指数（H）分别为 29.07%、0.173 3 和 0.119 1。
关键词：长序榆; ISSR-PCR; 反应体系; 优化
中图分类号：Q946-3 文献标识码：A 文章编号：1672352X (2012)04056008

Establishment and optimization of ISSR-PCR amplification system in Ulmus elongata

LI Wen-qiao1, 2, XU Gen-di1, 2, WU Yu-huan3, QIU Zhi-jun1, 2, GAO Jian-guo1, 2, LIU Peng1, 2
(1. Institute of Ecology, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004;
2. Laboratory of Biological Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004;
3. College of Biological and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036)

Abstract: To optimize the ISSR-PCR reaction condition for Ulmus elongata, the concentration of buffer,
template DNA, primers, Taq DNA polymerase and deoxy-ribonucleoside triphosphate (dNTPs) were studied and
analyzed with the orthogonal design experiment using UBC834 as primer. Then, based on the optimal ISSR-PCR
amplification system, the annealing temperature, the number of cycles and the extension time were determined by
gradient PCR. The results showed that a suitable ISSR-PCR amplification system for Ulmus elongata was estab-
lished. In a total volume of 25 μL ISSR-PCR amplification system, 2.5 μL buffer, 50 ng template DNA, 2.5 U Taq
DNA polymerase, 1.2 μmol·L-1 primer and 0.2 mmol·L-1 dNTPs were optimum. The optimal condition for primer
UBC 834 was annealing at 57℃, 35 cycles, and extension 60 s. Eleven ISSR primers were screened by using the
optimal reaction system, and the genetic diversity was analyzed with these primers. The results showed that at
species level, the value of the average percentage of polymorphic bands (PPB) was 82.35%, Nei’s genetic diver-
sity index (H) was 0.258 5 and Shannon’s information index (I) was 0.395 9. While at population level, the values
of PPB, H and I were 29.07%, 0.173 3 and 0.119 1, respectively.
Key words: Ulmus elongata; ISSR-PCR; amplification system; optimization


DOI:10.13610/j.cnki.1672-352x.2012.04.032
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中国长序榆，简称长序榆(Ulmus elongata)，隶
属于榆科榆属总序榆组(Sect. Chaetoptalae)，该组共
有 4 种。长序榆是该组在东亚的唯一代表，为我国
所特有，是一个较古老的类群，在地质上属第 3 纪
植物，是国家 II 级重点保护野生植物，被列入中国
被子植物关键类群中高度濒危种类[1]和中国生物多
样性保护行动计划中优先保护的物种[2]，在研究北
美和东亚植物地理学和系统演化中具有重要意义。
该树种具有树干通直圆满，材质优良等优点，是我
国具有重要发展前景的优质树种。然而，长序榆长
期处于散生状态，大树已不多见，天然更新不良，
零星分布于浙江、福建、安徽、江西等省区。目前
国内外对长序榆的研究报道很少，主要集中在生态
学种群、群落、繁殖特性更新等方面。
简单序列重复间区(inter-simple sequence repeat,
ISSR)是在简单重复序列 (simple sequence repeat,
SSR)分子标记技术基础之上，由 Zietkiewicz 等于
1994 年创建的一种基于 PCR 技术的新型 DNA 分子
标记技术。ISSR 标记技术结合了 RAPD 标记技术
和 SSR 标记技术的优点，试验操作简单、快速、高
效、耗资少，在不知道 DNA 序列的情况下也可用
引物进行 PCR 扩增，并可提供多位点信息和揭示不
同微卫星座位个体间变异的信息[3-7]，因此，ISSR
标记技术已广泛应用于遗传连锁图谱的构建、基因
定位、种质资源鉴定、植物分类、进化和遗传多样
性等研究[8-16]。
虽然 ISSR 标记分析的原理十分简单，只要获
得不同物种的适用引物和 PCR 反应条件就可进行，
但对于未开展过 ISSR 研究的物种来讲，所选的
ISSR 引物并不一定适合，而且反应体系不同也可产
生不同的结果[17]。因此，采用 ISSR 分子标记分析
时，首先应建立包括引物筛选在内的反应体系。该
研究通过优化 ISSR-PCR 反应中的各项参数，建立
适用于长序榆的 ISSR 反应体系，以期为濒危植物
长序榆遗传多样性的分析和分子鉴定研究奠定基
础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
长序榆样品取自长序榆的主要分布区福建、江
西、浙江、安徽等地，样品采回后置于﹣20℃冰箱
中存放。
1.2 试验方法
1.2.1 长序榆叶片总DNA的提取 改良 CTAB 法[18]
提取基因 DNA，利用紫外分光光度计测定基因组
DNA 的纯度和浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 长序榆 ISSR-PCR 最初扩增体系及程序
ISSR 引物为加拿大英属哥伦比亚大学网站公布的
序列(University of British Columbia，Set No. 9，No.
801-900)，由大连宝生物工程有限公司合成。最初
的扩增反应体系体积为 25 μL，包括 2.5 μL buffer（含
Mg2+）、30 ng DNA、0.8 μmol·L-1 引物、0.1 U·L-1 Taq
DNA 聚合酶、0.2 mmol·L-1 dNTPs。扩增程序为 94
℃预变性 3 min；94℃变性 30 s ，50℃～60℃(退火
温度随引物不同而定)退火 30 s，72℃延伸 60 s，共
35 个循环；最后 72℃延伸 10 min。扩增产物 1%琼
脂糖凝胶电泳，EB 染色，Bio-Rad 凝胶成像仪观察、
拍照。

表 1 PCR 反应体系各组份水平
Table 1 Factors and levels of PCR reaction
水平 Level Buffer/μL-1 dNTPs/mmol·L-1 DNA/ng Primer/μmol·L-1 Taq DNA polymerase/U
1 2.5 0.15 20 0.6 1.0
2 3.0 0.20 30 0.8 1.5
3 3.5 0.25 40 1.0 2.0
4 4.0 0.30 50 1.2 2.5

1.3 长序榆 ISSR-PCR 反应体系的优化试验设计
1.3.1 正交设计 为排除试验中各因素之间互作
的影响，利用引物 UBC834 对 Buffer、模板 DNA (20
ng·L-1)、Taq 酶(5 U·L-1)和引物(10 μmol·L-1)、dNTPs
(10 mmol·L-1)5 种因素选用 L16 (45) (表 1)设计 PCR
反应各组份不同因素水平的正交表(表 2)，并进行极
差和方差分析。
1.3.2 温度梯度 PCR 采用温度梯度 PCR 模式，以
引物 UBC834 的 Tm 为中心，设定退火温度梯度范
围 49~59℃，自动生成 8 个温度梯度，由高到低分
别为 59.0℃、58.2℃、57.0℃、55.1℃、52.7℃、50.9
℃、49.7℃和 49.0℃。PCR 反应体系中的 Buffer 浓
度、模板 DNA 浓度、引物浓度、Taq 酶浓度以及
dNTPs 浓度根据优化试验的结果而定，PCR 扩增程
序与 1.2.2 相同，以确定此引物最合适的退火温度。
1.3.3 循环次数和延伸时间的确定 本试验对循
562 安 徽 农 业 大 学 学 报 2012 年

环次数设置了 30 次、35 次、40 次和 45 次 4 个循
环梯度，对延伸时间设置了 45 s、60 s、90 s 和 120
s 4 个梯度，用最佳反应体系对循环次数和延伸时间
进行梯度试验。

表 2 ISSR-PCR 反应体系的 L16（45）正交试验设计
Table 2 L16 (45) orthogonal design of factors and levels of ISSR-PCR amplification system
处理组合 Treatment Buffer/μL dNTPs/mmol·L-1 DNA/ng Primer/μmol·L-1 Taq DNA polymerase/U
1 2.5 0.15 20 0.6 1.0
2 2.5 0.20 30 0.8 1.5
3 2.5 0.25 40 1.0 2.0
4 2.5 0.30 50 1.2 2.5
5 3.0 0.15 30 1.0 2.5
6 3.0 0.20 20 1.2 2.0
7 3.0 0.25 50 0.6 1.5
8 3.0 0.30 40 0.8 1.0
9 3.5 0.15 40 1.2 1.5
10 3.5 0.20 50 1.0 1.0
11 3.5 0.25 20 0.8 2.5
12 3.5 0.30 30 0.6 2.0
13 4.0 0.15 50 0.8 2.0
14 4.0 0.20 40 0.6 2.5
15 4.0 0.25 30 1.2 1.0
16 4.0 0.30 20 1.0 1.5

1.3.4 长序榆 ISSR 引物筛选及遗传多样性分析
利用优化的反应体系从哥伦比亚大学公布的 100 个
ISSR 引物中筛选出能够应用于长序榆相关研究的
ISSR 引物，并利用筛选到的 ISSR 引物对其遗传多
样性进行分析。
1.4 数据处理
对每个因素处理产生的可识别的条带数进行计
数；正交设计中极差和方差分析用 DPS 软件进行分
析。以 10 000 bp DNA Marker 作为相对分子量标准，
对照反应产物在凝胶上的对应位置，有带记为 1，
无带记为 0，得到 ISSR 分析的原始数据矩阵，用于
分析扩增条带的多态性。通过 Popgene1.32 软件[19]
计算长序榆的多态位点百分率(PPB)、每个位点的等
位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s 基因多
样性指数(H)[20]、Shannon 信息指数(I)[21]。
2 结果与分析
2.1 DNA 质量
高质量的 DNA 是进行 ISSR-PCR 反应的基础。
经紫外分光光度计检测发现，所提取的长序榆 DNA
的 OD 值在 1.7~1.9 之间；琼脂糖凝胶电泳后在点样
孔附近都有单一的高分子量条带（图 1），说明所提
的 DNA 比较完整，可用于后续的 ISSR-PCR 反应。



M：DNA Marker DL 10 000 bp; 1-6：长序榆样品 DNA Ex-
tracted DNA samples from Ulmus elongata
图 1 长序榆 DNA 样品电泳图
Figure 1 Electrophoretogram of DNA extracted from leaves
of Ulmus elongata

2.2 长序榆 ISSR-PCR 反应正交试验结果
试验结果(图 2)表明，第 5、第 6 和第 7 泳道能
扩增出比较清晰稳定的条带，其中第 5 泳道的组合
条带多而清晰、背景清晰，将 2 次试验条带数分别
进行统计(表 3)。

表 3 正交试验设计条带数统计
Table 3 The number of bands of the orthogonal design experiment
处理组 Treatments 项目 Item
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
条带数 The number of bands 3 4 3 6 4 4 3 3 3 4 4 3 4 4 4 4
3 4 4 5 4 4 3 3 3 4 3 3 4 4 4 3
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M：DNA Marker DL10000 bp; 1-16：正交 16 个组合结
果 Lanes from 1 to 16 are corresponding to the treatments of
orthogonal design experiment
图 2 正交试验设计 ISSR-PCR 反应体系的扩增结果
Figure 2 The results of ISSR-PCR amplification system
according to orthogonal design

2.3 各因素对 ISSR-PCR 反应影响的差异分析
将上述 2次试验结果用DPS数据处理软件进行
极差和方差分析。由表 4 可知，引物浓度和 Taq 酶
的作用相当，对长序榆 ISSR-PCR 反应的影响最大，
其次为 DNA，再为 Buffer，dNTPs 对长序榆 ISSR
扩增影响最小。由于极差分析不能估计实验误差，
因此降低了试验结果的精度。为了准确判断各因素
对长序榆 ISSR-PCR 反应的影响是否显著，进一步
进行方差分析(表 5)，由 F 值可知，Taq 酶的浓度对
反应结果的影响最大，dNTPs 浓度的影响最小，各
因素水平变化对 PCR 反应的影响大小依次为 Taq
酶、引物、DNA、Buffer、dNTPs，除 dNTPs 浓度
对试验结果的影响达到显著水平外，其他因素均达
到极显著水平(P < 0.01)，可进一步进行因素内多重
比较分析，这一结果与极差分析的结果相一致。
2.4 因素内各个水平对 ISSR-PCR 结果的影响
2.4.1 Taq DNA 聚合酶浓度对 ISSR-PCR 反应的影响
极差分析和方差分析表明，Taq 酶对 PCR 的扩增影
响最大。由图 3 中 a 可知，随着酶浓度的升高，扩
增的条带数呈先下降后升高的趋势，在 2.5 U 时扩
增的条带数最多。对 Taq 酶各水平进行因素内多重
比较，结果表明 Taq 酶浓度在 0.5 U 和 1 U 时条带
数变化不明显，2 U 和 2.5 U 时所产生的条带数有一
个明显的增加趋势。由图 2 显示，Taq 酶浓度在 2.5
U 时产物的稳定性最好，因此，综合考虑确定长序
榆 ISSR-PCR 反应体系中酶的浓度为 2.5 U。
2.4.2 引物浓度对 ISSR-PCR 反应的影响 由表 4
中 F 值可知，引物浓度对长序榆的 PCR 扩增结果影
响也很大。如图 3 中 b 所示，随引物浓度的升高，
扩增条带数呈上升趋势。对引物各水平进行因素内
多重比较，结果表明，0.8 μmol·L-1 和 1 μmol·L-1 之
间差异不显著，0.6 μmol·L-1 与 1.2 μmol·L-1 之间差
异极显著，1.2 μmol·L-1 与 0.8 μmol·L-1、1.0 μmol·L-1
之间差异显著。由图 2 可知，泳道 4 条带扩增的条
带数最多、最清晰，因此在本试验条件下，引物浓
度确定为 1.2 μmol·L-1。

表 4 正交设计极差分析
Table 4 Range analysis of orthogonal design
因子
Factor
极小值
Minimum value
极大值
Maximum value
极差 R
Range
调整 R＇
Revised range
Buffer 3.375 4.000 0.625 0.562 5
dNTPs 3.500 4.000 0.500 0.450 0
DNA 3.375 4.125 0.750 0.675 0
Primer 3.250 4.125 0.875 0.787 5
Taq DNA polymerase 3.375 4.250 0.875 0.787 5

表 5 正交设计方差分析
Table 5 Variance analysis of orthogonal design
变异来源
Source of variance
平方和
SS
自由度
DF
均方
MS
F 值
F value
Buffer 2.13 3.00 0.708 3 5.666 7**
dNTPs 1.38 3.00 0.458 3 3.666 7*
DNA 模版 DNA template 2.63 3.00 0.875 0 7.000 0**
引物 Primer 3.13 3.00 1.041 7 8.333 3**
Taq DNA 聚合酶 Taq DNA polymerase 3.63 3.00 1.208 3 9.666 7**
误差 Error 1.88 15.00 0.125 0
总和 Total 14.88 30.00
注：** 表示 0.01 水平上的差异显著性。Note: ** represents significant difference at the 0.01 level.
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图 3 各因素不同水平对 ISSR-PCR 的影响
Figure 3 Influence of different levels of the factors on ISSR-PCR reaction



M：DNA Marker DL10000 bp; 1-8：退火温度梯度（℃）
59.0、58.2、57.0、55.1、52.7、50.9、49.7 和 49.0 Lanes from
1 to 8 represent the results with annealing temperature of 59.0,
58.2, 57.0, 55.1, 52.7, 50.9, 49.7 and 49.0, respectively
图 4 退火温度对长序榆 ISSR 反应的影响
Figure 4 The results of ISSR amplification system with
different annealing temperature



M：DNA Marker DL10 000 bp; 1-4：优化循环次数依次为 30、
35、40 和 45 次 Lanes from 1 to 4 represent the results with
cycle times of 30, 35, 40 and 45, respectively
图 5 循环次数对长序榆反应的影响
Figure 5 Influence of the number of cycles on ISSR in Ulmus
elongata


M：DNA Marker DL10 000 bp; 1-4：优化延伸时间 45 s、
1 min、1.5 min 和 2 min Lanes from 1 to 4 represent the re-
sults with extension time of 30, 35, 40 and 45 min, respectively
图 6 延伸时间对长序榆 ISSR 反应的影响
Figure 6 Influence of extension time on ISSR in Ulmus
elongate

2.4.3 模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响 由表
4 中 F 值可知，模板 DNA 浓度对扩增结果的影响较
大。从图 3 中 c 可知，随着 DNA 浓度的升高，扩
增的条带数呈先升高后降低的趋势，在 50 ng 时扩
增的条带数最多，与图 5 相吻合。对 DNA 各水平
进行因素内多重比较，结果表明，20 ng 与 30 ng 之
间的差异不显著，40 ng 与 50 ng 差异达到极显著水
平，且 50 ng 与 20 ng、30 ng 之间达到显著水平。
因此 50 ng 模板 DNA 用于长序榆 ISSR-PCR 扩增为
最佳选择。
2.4.4 Buffer (含 Mg2+) 浓度对 ISSR-PCR 反应的影
响 Mg2+的主要作用是与反应液中的 dNTP、引物
及模板相结合，影响引物与模板的结合效率，同时
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对 Taq 酶的活性产生影响。由于本试验所使用的
Mg2+是和 Buffer 混合在一起的，所以对 Buffer 浓度
进行了优化。由图 3 中 d 可知，随着 Buffer 浓度的
升高，扩增的条带数呈先下降后上升的趋势，在 2 .5
μl 时条带数最多。因素内多重比较分析表明，2.5 μL
和 4 μL、3 μL 和 3 .5 μL 时扩增的条带数无显著性
差异，其余各组间差异均达到极显著水平。因此考
虑选择 Buffer 浓度 2.5 μL 为本试验最佳反应参数。
2.4.5 dNTPs 浓度对 ISSR-PCR 反应的影响 dNTPs
是 ISSR-PCR 反应的原料，dNTPs 浓度过高会导致
PCR 错配，从而使扩增出现非特异性条带；反之则
影响合成效率，甚至会因过早的消耗而使产物单链
化，影响扩增效果[22]。由表 4 中 F 值可知，dNTPs
浓度在 5 个因素中对 PCR 的影响最小。由图 3 中 e
可以看出，随引物浓度的增加，扩增条带数呈先增
后减再增的趋势，当浓度为 0.2 mmol·L-1 时扩增条
带数达到最大值。对 dNTPs 浓度进行因素内多重比
较，结果表明各浓度间没有显著性差异。因此，在
本实验条件下， dNTPs 的合适浓度定为 0.2
mmol·L-1。
2.5 退火温度、循环次数和延伸时间对 ISSR-PCR
反应体系的影响
退火温度与 ISSR 指纹的稳定性至关重要。退
火温度不同，产生错配的程度也不同。通常，较低
的温度在保证引物与模板结合稳定性的同时，也会
使引物与模板之间一些未完全配对的位点得到扩
增，即产生一定的错误扩增。因此，在允许的范围
内，选择较高的退火温度可减少引物和模板之间的
非特异性结合，提高 PCR 反应的特异性[23]。图 4
中从左往右依次为 59.0℃、58.2℃、57.0℃、55.1℃、
52.7℃、50.9℃、49.7℃和 49.0℃ 8 个温度梯度，结
果可以看出引物 UBC834 的最适退火温度为 57℃。
循环次数决定产量。循环次数太少，产物量极
低且条带较弱；循环次数太多，反而会引起非特异
性扩增。在原来的反应程序基础上，其他条件不变，
进行了 30 次、35 次、40 次和 45 次循环的尝试。试
验结果表明（图 5）：当循环次数在 30 个时，扩增
不稳定，条带弱且少带。而当循环次数在 40 和 45
个时，虽然与 35 个循环时扩增出的条带数相似，但
是 35 个循环时扩增带型较强，条带更清晰。

表 6 11 条 ISSR 引物扩增条带数与多态性比率
Table 6 Number and polymorphic ratios of the bands amplified by 11 ISSR primers
引物
Primer
条带序列
Sequence(5-3)
退火温度/℃
Annealing
temperature
条带数
Number of
bands scored
多态性条带数
Number of
ploymorphism bands
多态性百分率/%
PPB
UBC808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 60.0 7 6 85.71
UBC809 AGA GAG AGA GAG AGA GG 60.0 9 8 88.89
UBC810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 56.2 7 4 57.14
UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 51.9 6 5 83.33
UBC812 GAG AGA GAG AGA GAG AA 57.0 8 8 100.00
UBC820 GTG TGT GTG TGT GTG TC 60.0 6 5 83.33
UBC834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT 57.0 12 11 91.67
UBC835 AGA GAG AGA GAG AGA GYC 57.1 8 7 87.50
UBC840 GAG AGA GAG AGA GAG AYT 57.0 10 8 80.00
UBC857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 54.7 6 6 100.00
UBC873 GAC AGA CAG ACA GAC A 56.2 6 2 33.33
Species level 70 85 82.35

在 ISSR-PCR 反应中，除退火温度、循环次数
等因素外，延伸时间也是一个重要的影响因素。延
伸时间过短无法完成扩增，产量低；延伸时间过长
会产生非特异扩增。本试验设置了 45 s、1 min、1.5
min 和 2 min 4 种梯度进行尝试，试验结果表明（图
6），延伸时间在 1 min 时获得了较稳定扩增结果。
2.6 长序榆特异 ISSR 引物筛选及遗传多样性
综合正交试验设计得出的结果，最终确定的在
25 μL 的反应体系中，采用 2.5 μL Buffer（含 Mg2+）、
50 ng 模板 DNA、1.2 μmol·L-1 引物、2.5 U Taq 酶及
0.2 mmol·L-1 dNTPs 为长序榆 ISSR-PCR 反应体系
的最佳组合。利用此优化体系，对 100 条哥伦比亚
大学网站公布的 ISSR 引物进行筛选，成功筛选到
11 条可用于长序榆 PCR 扩增的 ISSR 引物（表 6），
并用筛选到的引物对长序榆个体进行遗传多样性
分析。结果表明，11 条引物共扩增出了 85 条带，
566 安 徽 农 业 大 学 学 报 2012 年

其中 70 条为多态性条带，多态百分率为 82.35%。
在物种水平上，长序榆的遗传多样性较高，多态位
点百分率（PPB）为 82.35%，等位基因数（Na）为
1.8353，有效等位基因数（Ne）为 1.4287，Shannon
信息指数（I）为 0.3959，Nei’s 基因多样性指数（H）
为 0.2585。而种群水平上的遗传多样性则较低，多
态位点百分率（PPB）、等位基因数（Na）、有效等
位基因数（Ne）、Shannon 信息指数（I）、Nei’s 基
因多样性指数（H）平均为 29.07%、1.2907、1.2136、
0.1733 和 0.1191（表 7）。

表 7 长序榆种群内遗传多样性分析
Table 7 Genetic diversity within populations of U. elongata
种群 Population 等位基因 Na 有效等位基因 Ne Nei 基因多样性 H Shannon 指数 I
福建南平 (FJNP) 1.423 5(0.497 1) 1.323 4(0.413 9) 0.177 9(0.217 0) 0.257 2(0.308 6)
浙江临安 (ZJLA) 1.294 1(0.458 3) 1.224 7(0.376 3) 0.123 6(0.198 8) 0.178 7(0.283 6)
安徽歙县 (AHSX) 1.294 1( 0.458 3) 1.193 8(0.333 9) 0.112 5(0.182 6) 0.166 7(0.265 6)
浙江松阳 (ZJSY) 1.164 7(0.373 1) 1.132 3(0.314 9) 0.071 5(0.165 7) 0.102 6(0.235 4)
浙江遂昌 (ZJSC) 1.352 9(0.480 7) 1.262 3(0.388 9) 0.145 7(0.205 9) 0.211 5(0.294 3)
浙江开化 (ZJKH) 1.247 1(0.433 9) 1.167 5(0.322 1) 0.096 2(0.175 4) 0.141 8(0.254 2)
江西武宁 (JXWN) 1.258 8(0.440 6) 1.191 1(0.351 1) 0.106 4(0.187 2) 0.154 6(0.268 2)
物种水平 Species 1.835 3(0.373 1) 1.428 7(0.347 3) 0.258 5(0.176 0) 0.395 9(0.240 4)

3 讨论
ISSR 扩增反应混合物的各组分浓度(包括模
板、DNA 用量与纯度、引物、Mg2+和 dNTPs 的浓
度，Taq DNA 聚合酶用量等)以及 PCR 反应中的退
火温度等都会影响 DNA 扩增，从而影响扩增产物
的可靠性和稳定性。因此，本研究对各影响因子进
行优化，筛选出了长序榆最适宜的 ISSR 反应条件。
总体来看，Taq DNA 聚合酶浓度是本研究中影
响 ISSR-PCR 最为明显的一个因素。Taq DNA 聚合
酶是 PCR 反应的催化剂[24]，在 PCR 反应体系中，
Taq 酶用量过高不仅增加成本，还会产生非特异性
扩增，过低则会降低产物合成效率甚至不能扩增
[25]，因此应选择合适的 Taq DNA 聚合酶用量，本试
验确定 2.5 U 为最佳浓度。引物浓度对 ISSR-PCR
的扩增结果影响也较大，引物浓度过高易导致碱基
错配、引物二聚体的形成；过低则会导致扩增效率
下降，甚至扩增不出条带。本实验确定引物的最适
浓度 1.2 μmol·L-1。其次是 Mg2+和 DNA 浓度。Mg2+
是 Taq 酶的激活剂，Mg2+不足，则 Taq 酶的作用效
率低，此外，Mg2+还能与 dNTPs 分子中的磷酸基团
结合，影响引物与模板的结合效率、产物的特异性、
模板与产物的解链温度以及引物二聚体的形成[26]。
模板 DNA 的浓度过高不利于 PCR 扩增，甚至导致
扩增失败；过低则会降低扩增效率[27]。本试验中模
板 DNA 浓度对 ISSR-PCR 扩增的影响较大，这与原
勤勤[28]等的研究结果不一致，可能是因为 DNA 纯
度过低，需要进一步纯化。本试验所使用的 Mg2+
是和 Buffer 混合在一起的，所以对 Buffer 浓度进行
了优化通过比较扩增条带数，以及扩增条带的背景，
最终确定 Buffer 和 DNA 浓度分别为 2.5 μL 和 50
ng。dNTPs 浓度过高会导致 PCR 反应过程中的错
配，从而出现非特异性扩增；浓度过低又会影响合
成效率，甚至会因过早消耗而使产物单链化，影响
扩增效率[29]。本试验研究结果表明，dNTPs 对扩增
结果的影响最小，这与张龙进[30]等的研究一致。本
研究中最适的 dNTPs 浓度为 0.2 mmol·L-1。
引物退火温度明显影响扩增谱带式样，温度过
低或过高都会产生非特异性条带，影响目的条带的
清晰度。引物不同，物种不同，其退火温度亦不相
同，因此，对于不同引物，必须各自筛选其退火温
度，不能统一而论。
本试验利用最终确定的 ISSR-PCR 反应体系成
功筛选到 11 条可以在长序榆中稳定扩增的 ISSR 引
物，所产生的 ISSR 标记位点清晰，反应稳定，检
测多态性能力较强，并且不同引物显示扩增出的多
态性条带数各不相同。
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