全 文 ：Vol. 34 No. 6
Jun. 2014
第 34 卷 第 6期
2014年 6月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期：2013-09-04
基金项目：“十二五”国家科技支撑项目“楸树和赤皮青冈珍贵用材林定向培育技术研究与示范”（2012BAD21B03）
作者简介：朱品红（1987-），女，河南焦作人，硕士研究生，从事林木定向培育研究
通讯作者：李志辉（1957-），男，湖南安化人，教授，博士生导师，主要从事森林培育教学和研究工作；
E-mail：lzh1957@126.com
简单重复序列区间扩增多态 ( inter-simple
sequence repeat，ISSR)分子标记技术是近几年来
发展起来的一种新型分子标记法，由 Zietkiew ica
等 [1]于 1994年在 SSR (Simple Sequence Repeat)基
础上创建的，综合了 SSR和 RAPD技术的优点，
具有稳定性高、重复性好、操作方便、成本低廉等
特点。因此近年来已广泛应用于遗传作图、遗传多
样性分析、基因定位和种质资源鉴定 [2-8]等方面。
赤皮青冈 Cyclobalanopsis gilva (Bl.) Oerst.属
壳斗科青冈属，常绿乔木，树皮暗赤褐色，又名
红椆、赤皮稠，是珍贵的硬木树种。主要产自我
国福建、湖南、浙江、贵州、台湾等省。适应性强，
生于海拔 300～ 1 500 m的山地，较耐干旱脊薄，
能在丘陵酸性红壤与石灰岩发育而成的钙质土壤
生长 [9]。但近年来由于人类的影响，赤皮青冈天
然种群逐渐枯竭，仅保存下少量的古木大树 [10]。
目前国内外对赤皮青冈的研究主要集中在地理分
布 [11]，造林技术 [9]，理化特性 [12-14]等方面。而关
于 ISSR标记技术的研究尚未见报道。本研究采用
单因素试验与正交设计相结合的方法，建立了适
合赤皮青冈的 ISSR-PCR最佳反应体系，为 ISSR
分子标记技术应用于赤皮青冈的种质资源鉴定、
遗传变异分析、系统进化等研究奠定了基础。
赤皮青冈 ISSR-PCR 反应体系的建立与优化
朱品红，李志辉，杨模华
（中南林业科技大学 林学院 , 湖南 长沙 410004)
摘 要：为建立适宜于赤皮青冈 ISSR分析的扩增体系，以赤皮青冈叶片基因组 DNA为材料，采用单因素和正
交设计相结合的方法系统地测试模板 DNA、Mg2+、引物、磷酸碱基脱氧核苷（dNTPs）浓度，Taq DNA聚合酶
用量和退火温度这 6个因素对 ISSR-PCR反应结果的影响。综合分析表明：优化后的最佳反应体系为 20 μL反应
总体系中，含 20 ng模板DNA，2.5 mmoL/L Mg2+，0.2 mmoL/L dNTPs，1.0 U Taq DNA聚合酶，0.2 μmoL/L引物；
UBC 808号作引物最佳退火温度为 59.3℃。这一优化体系的建立为进一步开展赤皮青冈遗传多样性的 ISSR分析
奠定了基础。
关键词：赤皮青冈；ISSR-PCR；正交设计；单因素试验；优化
中图分类号：S723.7 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2014)06-0061-05
Establishment and optimization of Cyclobalanopsis gilva ISSR-PCR
reaction system
ZHU Pin-hong, LI Zhi-hui, YANG Mo-hua
(School of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)
Abstract: In order to establish the optimal system of ISSR-PCR for Cyclobalanopsis gilva, with the genomic DNA of C.gilva leaves as
material, single factor test and orthogonal experiment design were used to systematically test six parameters of ISSR-PCR which include
template DNA, Mg2+, primers, dNTPs concentration, dose of Taq DNA polymerase and annealing temperature.Integrated analysis
implies that the optimal reaction system of ISSR (20 μL) is:20 ng template DNA, 2.5 mmoL/L Mg2+, 0.2 mmoL/L dNTPs, 0.2 μmoL/L
primers and 1.0 U Taq DNA polymerase, if UBC808 as the primers in ISSR-PCR that the optimized annealing temperature is 59.3℃ .
The establishment of the optimal system lays an important foundation for using ISSR technology in research C.gilva genetic diversity in
future.
Key words: Cyclobalanopsis gilva; ISSR-PCR; orthogonal design; single factor tests; optimization
朱品红，等：赤皮青冈 ISSR-PCR反应体系的建立与优化62 第 6期
1 材料与方法
1.1 材 料
赤皮青冈种子来源于湖南省张家界市永定区，
于 2012年在汨罗科技示范园育苗，2013年 4月将
新鲜叶片置于低温储藏箱中带回实验室，洗净、
晾干，-70℃冰箱中保存备用。
1.2 主要试剂及仪器
参照加拿大哥伦比亚大学 UBC公司提供的
ISSR引物序列，由上海英骏生物技术有限公司合
成。经初步筛选，确定引物 808号即 (AG)8C作为
本次反应体系优化试验的固定引物。扩增反应在
GeneAmp PCR System 9700扩增仪上进行，试验所
用 Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs购自 TINGEN
公司，标准分子量 ( Marker)DL2000购自东盛公司。
1.3 基因组 DNA的提取与检测
采用 OMEGA公司生产的试剂盒对赤皮青冈
DNA进行提取，方法参照说明书。λDNA测定提
取液浓度，溴化乙锭（EB）染色，0.7%的琼脂糖
凝胶电泳检测。
1.4 试验方法
1.4.1 单因素试验优化反应体系
根据预备实验结果，对影响 ISSR-PCR反应体
系的 6个因素，分别设置了不同的梯度水平，见
表 1。通过查阅相关文献确定最初的反应体系为：
40 ng的模板 DNA，1.4 μL的Mg2+，0.8 μL引物，
0.3 μL 的 dNTPs，0.3 μL 的 Taq DNA 聚 合 酶，
10×Buffer缓冲液 2.0 μL；PCR初步反应程序为
94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，58℃退火 45 s，
72℃延伸 2 min，共循环 35次；最后 72℃延伸 7
min；4℃保温。
表 1　影响ISSR-PCR扩增的因素水平
Table 1 The factors and levels influencing amplification of
ISSR-PCR
因素 试剂浓度
各因素水平梯度
1 2 3 4 5 6 7 8
DNA模板 / μL 50 ng/ μL 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 2.0 2.4
引物 / μL 10 μmoL/L 0.4 0.6 0.8 1.0 1.5 2.0
Mg2+ / μL 50 mmol/L 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.8
dNTPs / μL 10 mmol/L 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.4
Taq酶 / μL 5 U/ μL 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5
退火温度 /℃ 48.0 49.3 51.2 53.5 56.8 59.3 61.0 62.0
1.4.2 正交设计试验优化反应体系
对模板 DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq酶 5
个因素进行正交设计，因素水平参考单因素试验，
依据 PCR重复 2次的扩增结果进行直观分析。
1.4.3 ISSR-PCR产物的检测
ISSR-PCR产物用 EB染色，1.4%的琼脂糖凝
胶电泳检测。5 V/cm恒定电压下电泳约 1.5 h，然
后用 Bio-Rad紫外凝胶成像仪拍照保存。
2 结果与分析
2.1 DNA提取结果
赤皮青冈叶片基因组 DNA的凝胶电泳检测结
果如图 1所示。图中主带明亮清晰，无明显拖带，
点样空基本干净，无杂质，说明蛋白质、多糖、
酚类等基本去除，满足 ISSR分子标记实验的要求。
图 1 赤皮青冈叶片基因组 DNA电泳结果
Fig.1 Electrophoresis pattern of genomic DNA of the
leaves of C. gilva
2.2 单因素试验结果分析
2.2.1 模板 DNA浓度对 ISSR-PCR反应的影响
适宜的模板 DNA浓度是保证 ISSR-PCR良好
扩增效果的一个重要因素，DNA模板浓度过低，
扩增不稳定甚至无法扩增；而浓度过高，又相应
增加了非特异性扩增产物 [15]。此次单因素试验设
置了 7个模板 DNA浓度梯度，见图 2，从图可以
看出：赤皮青冈 ISSR-PCR体系中，对 DNA模板
浓度的许可范围较大。在 20 μL的反应总体系中所
加的 DNA模板体积（浓度 50 ng/ μL）大于 1.4 μL
时扩增条带较弱，不清晰。当加入的体积在 0.4～
1.2 μL之间时扩增条带稳定、清晰。
2.2.2 引物浓度对 ISSR-PCR反应的影响
引物与模板 DNA的互补程度决定了 PCR产
物的特异性，是 PCR反应的关键，浓度过高可能
引起模板与引物的错配，PCR反应特异性下降，
还会增大形成引物二聚体的几率；浓度过低则不
能进行有效扩增。从图 3可以看出：随着引物浓
度的增高，扩增条带数由多到少，反应的稳定性
63第 34卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
也逐渐降低。当引物（浓度 10 μmoL/L）加入量为
0.4 μL时扩增条带清晰，数量较多，特异性强。
加入量为 0.6、0.8、1.0 μL时条带清晰度下降，特
异性差。因此选用引物体积 0.4 μL作为 ISSR-PCR
反应体系中最适加入量。
2.2.3 Mg2+浓度对 ISSR-PCR反应的影响
Mg2+ 浓度影响了引物与模板双链的解链。退
火温度、Taq DNA聚合酶的活性和产物的特异性
也都受Mg2+浓度的影响 [16-17]。在一定浓度范围内，
随着Mg2+浓度升高，PCR扩增的特异性降低，然
而浓度过低则影响 PCR扩增产量，甚至不能扩增
出条带。从图 4可以看出 20 μL的反应总体系中
Mg2+（浓度 50 mmol/L）加入量为 0.6 μL时无扩增
条带。加入量为 1.8 μL时条带背景模糊，主次带
不分明。在加入 0.8～ 1.4 μL时扩增条带较多，其
中加入 1.0 μL时最清晰稳定，故确定 1.0 μL作为
ISSR-PCR反应体系中Mg2+最适加入量。
2.2.4 dNTPs浓度对 ISSR-PCR反应的影响
dNTPs是 PCR反应中DNA序列扩增的原料，
浓度过低会降低 PCR产物的产量，过高即能产生
错误掺入，又会与体系中游离的Mg2+结合，从而
减少了Mg2+含量。如图 5所示，当 20 μL 的反应
总体系中 dNTPs（浓度 10 mmol/L）加入量达到
1.0 μL时已无扩增产物出现。加入 0.8 μL时扩增
条带较少，加入 0.2，0.6 μL时条带清晰可见，而
加入 0.4 μL时主次带分明，清晰度最高。因此，
本实验确定 0.4 μL作为 ISSR-PCR反应体系中
dNTPs最适加入量。
M: Marker DL2000 ;1～ 7 DNA加入量分别为 0.4、0.6、0.8、1.2、1.4、2.0、2.4 μL.
图 2　不同水平模板 DNA对 ISSR扩增的影响
Fig.2 Effect of different DNA template levels on ISSR
amplifi cation
M: Marker DL2000;1～ 6引物加入量分 为 0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 μL
图 3 不同水平引物对 ISSR扩增的影响
Fig.3 Effect of different primer levels on ISSR
amplifi cation
M: Marker DL2000;1～ 6 Mg2+加入量分别为 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.8 μL.
图 4 不同水平Mg2+对 ISSR扩增的影响
Fig.4 Effect of different Mg2+ levels on ISSR amplifi cation
M: Marker DL2000;1～ 6 dNTPs加入量分别为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4 μL.
图 5 不同水平 dNTPs对 ISSR扩增的影响
Fig. 5 Effect of different dNTPs levels on ISSR amplifi cation
2.2.5 Taq DNA聚合酶用量对 ISSR-PCR反应的
影响
在 ISSR-PCR反应中，Taq DNA聚合酶的活
性与浓度对扩增反应有着重要的影响，浓度过低
会导致扩增产物不足或者不能扩增，浓度过高会产
生弥散现象，非特异性扩增产物增多。值得注意的
是不同厂家生产的酶，或同一厂家不同批次的酶对
反应效果也存在差异 [18]。如图 6所示在 20 μL 的反
应总体系中 Taq DNA聚合酶（浓度 5 U/ μL）加入
量为 0.1 μL时，扩增条带弱，不能辨析，加入 0.2
μL时条带较强，背景清晰。当加入量逐渐增加时
拖尾现象开始严重，达到 0.5 μL时无扩增产物出
现。因此选用 0.2 μL作为 ISSR-PCR反应体系中
Taq酶最适加入量。
朱品红，等：赤皮青冈 ISSR-PCR反应体系的建立与优化64 第 6期
2.2.6 最优 ISSR-PCR退火温度的筛选
由于作为 ISSR-PCR标记的引物长度、碱基
组成、GC碱基含量及浓度等各不相同，各个引
物的 Tm值也有所不同。一般的温度范围是 45～
65℃ [19]。退火温度偏高则引物与模板难结合，条
带较少，背景弱；退火温度偏低则弱带较多，特
异性差。若扩增结果相似则选择较高退火温度，
以提高引物与模板结合的特异性。本试验在 PCR
梯度扩增仪上设置退火温度从 48℃到 62℃，自动
生成 8个温度梯度，见图 7。由图可以看出退火温
度为48～56.8℃时，由于温度偏低，导致背景模糊，
杂带较多，特异性差；退火温度高于 61.0℃时扩
增受到抑制，电泳条带少。当温度为 59.3℃时扩
增产物最多，条带清晰。因此，本实验确定引物
808的最佳退火温度为 59.3℃。
（表 2）。各因素水平分别为 DNA模板：0.4、
0.6、0.8、1.2 μL；引物：0.4、0.6、0.8、1.0 μL；
Mg2+：0.8、1.0、1.2、1.4 μL；dNTPs：0.2、0.4、
0.6、0.8 μL；Taq酶：0.15、0.2、0.3、0.4 μL。
表 2 赤皮青冈ISSR反应正交试验设计表L16(45)
Table 2 ISSR reaction orthogonal design L16(45) of C.gilva
处理号
影响因素（体积 μL）
DNA模板
(50 ng/ μL)
Mg2+
(50 mmol/L)
dNTPs
(10 mmol/L)
Taq酶
(5 U/ μL)
引物
(10 μmoL/L)
1 0.4 0.8 0.2 0.15 0.4
2 0.4 1.0 0.4 0.2 0.6
3 0.4 1.2 0.6 0.3 0.8
4 0.4 1.4 0.8 0.4 1.0
5 0.6 0.8 0.4 0.3 1.0
6 0.6 1.0 0.2 0.4 0.8
7 0.6 1.2 0.8 0.15 0.6
8 0.6 1.4 0.6 0.2 0.4
9 0.8 0.8 0.6 0.4 0.6
10 0.8 1.0 0.8 0.3 0.4
11 0.8 1.2 0.2 0.2 1.0
12 0.8 1.4 0.4 0.15 0.8
13 1.2 0.8 0.8 0.2 0.8
14 1.2 1.0 0.6 0.15 1.0
15 1.2 1.2 0.4 0.4 0.4
16 1.2 1.4 0.2 0.3 0.6
参考何正文等 [20]的方法，根据 L16(45)正交
试验 PCR扩增产物电泳结果 (图 8)，分析谱带的
强弱、数量、背景清晰度及杂带多少，对其进行
直观分析，打分。最优的记为 16分，最差的记为
1分。则本次试验 16个处理的分数依次为：8、
16、15、11、13、6、1、14、4、12、2、3、9、5、
7、10。根据分数进行直观分析（表 3）得出各因
素对赤皮青冈 ISSR-PCR反应体系的影响程度即极
差值 R，R值越大说明该因素对反应的影响越显著。
而 Ki值反映了各个因素同一水平下的试验值之和，
ki值则反映了各个因素水平对反应的影响效果，
ki值越大说明该水平对扩增反应的影响越明显。由
极差值 R反映出各因素对赤皮青冈 ISSR-PCR扩增
体系的影响程度由高到低依次是：Taq DNA聚合
酶、模板 DNA、Mg2+、dNTPs、引物。由 ki值得
出理论最佳反应体系是：模板 DNA（50 ng/ μL）
0.4 μL、Mg2+（50 mmol/L）1.0 μL、dNTPs（10
mmol/L）0.4 μL、Taq酶（5 U/μL）0.3 μL、引物（10
μmoL/L）0.4 μL。各因素的最佳水平组合并没在
16个处理中出现，但是与分值最高的 2号处理接
近。所以，在利用正交试验设计优化反应体系时，
可以不经过直观分析，直接根据电泳结果也能获
M:Marker DL2000;1～ 6Taq DNA聚合酶加入量分别为 0.1、0.15、0.2、
0.3、0.4、0.5 μL.
图 6 不同水平 Taq DNA聚合酶对 ISSR扩增的影响
Fig. 6 Effect of different Taq DNA polymerase levels on
ISSR amplifi cation
M:Marker DL2000;1～ 8退火温度分别为 48、49.3、51.2、53.5、56.8、
59.3、61.0、62.0℃ .
图 7 不同水平退火温度对 ISSR扩增的影响
Fig. 7 Effect of different annealing temperature levels on
ISSR amplifi cation
2.3 正交试验结果分析
根据单因素试验结果，对模板 DNA、引物、
Mg2+、dNTPs及 Taq DNA聚合酶 5个因素在 4个
水平上进行正交试验设计，建立 L16(45)正交表
65第 34卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
得较优的反应体系 [21]。
表 3 正交试验数据分析
Table 3 Data analysis of orthogonal tests
结果
影响因素
模板 DNA Mg2+ dNTPs Taq酶 引物
K1 50 34 26 17 41
K2 34 39 39 41 31
K3 21 25 38 50 33
K4 31 38 33 28 31
k1 12.50 8.50 6.50 4.25 10.25
k2 8.50 9.75 9.75 10.25 7.75
k3 5.25 6.25 9.50 12.50 8.25
k4 7.75 9.50 8.25 7.00 7.75
R 7.25 3.50 3.25 8.25 2.50
通过正交试验确定模板 DNA最佳含量为 0.4
μL。Mg2+、引物和 dNTPs在单因素试验和正交试
验结果中最佳含量相同，分别是 1.0 μL、0.4 μL和
0.4 μL。正交试验中 Taq酶的最佳含量为 0.3 μL比
单因素试验的最佳值高出0.1 μL，考虑到经济原因，
选择 0.2 μL作为 PCR反应的最佳含量。综合单因
素试验与正交设计试验结果，可以得到赤皮青冈
ISSR-PCR的最佳反应体系，见表 4。
表 4 赤皮青冈ISSR-PCR最佳反应体系
Table 4 The most suitable ISSR-PCR system for C.gilva
成分 母液浓度 20 μL反应体系中各成分加入的量 ( μL)
每个反应中
各成分的含量
模板 DNA 50 ng/ μL 0.4 20 ng
Mg2+ 50 mmol/L 1.0 2.5 mmoL/L
dNTPs 10 mmol/L 0.4 0.2 mmoL/L
Taq酶 5 U/ μL 0.2 1.0 U
引物 10 μmoL/L 0.4 0.2 μmoL/L
Buffer 10× 2.0 1×
ddH2O 15.6
2.4 ISSR-PCR反应体系的稳定性检测
图 9是在本研究得出的最佳反应体系条件下以
808号作引物，退火温度 59.3℃，扩增 18个样品的
PCR电泳结果。从图可以看出，优化后的体系均能
扩增出清晰度高、多态性好的条带，说明本研究确
立的赤皮青冈 ISSR-PCR反应体系是稳定可靠的。
3 小结与讨论
因为退火温度会随着物种和引物种类的不同
而发生改变，因此在进行某一物种的 ISSR-PCR体
系优化时，对不同的引物退火温度应重新进行筛
选。本研究确定在进行赤皮青冈 ISSR-PCR扩增时
808号作引物的最佳退火温度为 59.3℃。在实验的
整个过程中还应注意尽可能使用同一厂家的药品
和试剂，以便保证分析结果的稳定性。
前人在进行 ISSR-PCR反应体系优化时有的只
考虑各因素不同水平对试验结果的影响，忽略了
因素之间的交互作用，有的只采用正交设计试验
方法，使结果的评价带有一定的主观性，降低了
最佳反应水平的的可靠程度。本研究则综合运用
两种试验方法，在一定程度上避免了各自的局限
性。通过此次研究确立的赤皮青冈 ISSR-PCR最佳
反应体系，将为赤皮青冈及其近缘种的种质资源
鉴定及遗传多样性的分析研究工作奠定基础。
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图 8 正交试验 PCR产物电泳结果
Fig. 8 Electrophoresis of orthogonal design PCR products
图 9　808号引物在优化后的体系下扩增 18个样品的 PCR
结果
Fig.9 The PCR results of 18 specimens with peimer 808
and optimized reaction system
（下转第 80页）
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[本文编校：文凤鸣 ]
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[本文编校：吴 彬 ]
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