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收稿日期: 2013-08-14; 修订日期: 2013-09-18
基金项目:吉林省科技厅青年科研基金项目( No． 20130522010JH)
作者简介:刘 超( 1972-) ，男( 满族) ，吉林吉林人，现任延边大学副主任
医师，博士学位，主要从事分子肿瘤学研究工作．
* 通讯作者简介:刘双萍( 1978-) ，女( 汉族) ，吉林敦化人，现任延边大学
副教授，博士学位，主要从事肿瘤学研究工作．
虎眼万年青皂苷
对肝癌细胞 HepG2 增殖与凋亡的影响
刘 超，刘双萍*
( 延边大学临床学院，吉林 延吉 133000)
摘要:目的 探讨虎眼万年青提取物虎眼万年青皂苷( OSW － 1) 抑制肝癌细胞增殖及诱导凋亡作用的机制。方法 利用
MTT细胞毒性实验检测 OSW －1 对人肝癌细胞 HepG2 和正常人永生化肝细胞 Chang － liver 增殖的影响，并采用透射电
镜实验进行验证;通过Western Blotting实验在蛋白水平检测 OSW －1 作用下，人肝癌细胞 HepG2 中常见的凋亡指标 Bax、
c － Myc、Bcl － 2 变化情况。结果 MTT与透射电镜实验证实 OSW －1 可以明显抑制人肝癌细胞 HepG2 的增殖诱导凋亡，
但对正常肝细胞 Chang － liver毒性较小，c － Myc、Bcl － 2 可随 OSW －1 作用剂量增加而表达下降，Bax随 OSW － 1 作用剂
量增加而表达升高。结论 OSW －1 可能通过上调 Bax蛋白表达，抑制 c － Myc、Bcl － 2 蛋白的表达而抑制肝癌细胞增殖，
对正常细胞毒性较小，可能开发为新型毒副作用较小的肝癌药物。
关键词: OSW －1; 肝癌细胞; 增殖; 凋亡
DOI标识: doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 11． 025
中图分类号: Ｒ285． 5 文献标识码: A 文章编号: 1008-0805( 2013) 11-2634-03
肝细胞肝癌 ( Hepatocellμlar carcinoma，HCC) 作为最常见的
消化系统肿瘤之一，在世界范围内，其发病率排癌症发病率的第
5位，其死亡率排癌症死亡率的第 3 位［1］，近年来对于肝癌的药
物治疗研究一直是肿瘤研究的热点。肝癌的发生是多个原癌基
因和抑癌基因参与的多基因、多步骤过程，其不断增殖及远处转
移是其致死的主要原因，药物治疗虽然有效，但未能有效减少肝
细胞癌的死亡率。因此，研发安全有效的新型抗癌药物对于提高
肿瘤的治疗水平具有重要意义。
虎眼万年青( Ornithogalum caudatum Ait) 为百合科虎眼万年
青属常绿多年生草本植物，又名胡连万年青、海葱等，原产于非洲
南部，我国各地也广泛栽培，吉林省长白山地区是其主要产区之
一。由于长白山海拔较高，土壤富含硒元素，长白山地区的虎眼
万年青具有更为显著的清热解毒、消坚散结等功能，民间全草入
药，常用于抗炎、抗肿瘤等。虎眼万年青含多种化学成分，如皂苷
类、生物碱类、黄酮类、三萜类等。近年来发现虎眼万年青皂苷
( OSW －1) 具有明显的抗肿瘤作用［2，3］，但由于 OSW － 1 提取合
成工艺复杂昂贵，其在肿瘤中的研究较少，尤其是与肝癌的关系
研究更为罕见。本实验旨在研究长白山虎眼万年青皂苷 OSW －
1 对人肝癌细胞系 HepG2 增殖与凋亡的影响，进一步探讨 OSW
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－ 1 对肝细胞癌的作用及机制。
1 材料
人正常永生化肝细胞 Chang － liver 以及肝癌细胞系 HepG2
细胞购自北京协和大学细胞中心。主要试剂: 虎眼万年青皂苷
( OSW －1) 由延边大学药学院惠赠; ＲPMI1640 培养基和新生牛
血清 FBS购自美国 Gibco公司．细胞培养瓶，96 孔板等耗材购等
自美国 Corning公司;荧光二抗及 DAPI购于美国 Invitrogen公司，
MTT细胞增殖与毒性试剂盒、4%戊二醛试剂与阿霉素( ADＲ) 等
均购于北京世纪康维公司。野生型 Bax、c － Myc、Bcl － 2，β － ac-
tin抗体以及二抗均选用中国中山金桥公司产品。
主要仪器为奥林帕斯倒置显微镜( BX53 ) ，酶标仪为 Thermo
全波段扫描仪，凝胶成像系统( Champ Chemi professional，北京赛
智) ，以及透射电子显微镜电镜( 日本 HITACHI) 。
2 方法
2． 1 细胞培养 人正常永生化肝细胞 Chang － liver 以及肝癌细
胞系 HepG2 细胞用含 10%胎牛血清的 ＲPMI1640 ( 含 20 mmol /L
Hepes，100 Μ /ml 青霉素 /链霉素) 。方法采用贴壁细胞传代的常
规方法，倒置显微镜观察，2 ～ 3 d传代 1 次。
2． 2 MTT细胞毒性试验 取对数生长期的正常永生化肝细胞
Chang － liver 以及 HepG2 细胞制为细胞悬液，以每孔 1 000 ～
10 000个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 100 μl。分为阴性对照
组、5 μmol /L阿霉素 ( Adriamycin，ADＲ) 处理阳性对照组，OSW
－1 药物处理组，药物终浓度为 200 μg /ml。每组设 5 个平行孔。
药物作用细胞 24，48，72 h后，每孔加 20μl MTT溶液［5 mg /ml用
PBS( pH = 7． 4) 配］;继续孵育 4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养
上清液，每孔加 150 μl DMSO，振荡 10 min，选择 490 nm波长，在
全波段酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，
吸光值为纵坐标绘制细胞生长柱状图。
2． 3 透射电镜观察细胞凋亡 取处于对数生长期的 HepG2 细
胞，以每孔 4 × 105 ～ 1 × 107 细胞接种于 6 孔板中，在培养箱中培
养至合适阶段; 设对照组和 OSW － 1 处理组，阴性对照组加入
DMSO，OSW －1 处理组加入终浓度为 200 μg /ml 的药物，作用
48h后，0． 1%胰酶消化，在离心管内离心为细胞团块 ( 速度为 1
500 ～ 2 000 r /min，时间为 10 ～ 15 min) ，保证获取火柴头大小细
胞团块( 细胞数量至少 4 × 107 以上) ，吸去上清液，再进行 4%戊
二醛固定，以指腹轻拍细胞团块使之悬浮，固定后按常规方法包
埋，制备切片。应用日本 HITACHI透射电镜进行观察，由两名有
经验的病理医师分别选片，综合结果后采集图像。
2． 4 Western blot 检测蛋白变化 铺于 6 孔板内的 HepG2 细胞生
长至 60%左右时进行药物预处理。分为阴性对照组; 100 μg /ml
及 200 μg /ml OSW －1 药物处理组。药物作用细胞 48 h后，用加
入 1 /100 蛋白酶抑制剂的 ＲIPA裂解液( 北京世纪康维) 裂解，抽
提总蛋白，定量后用于 Western blotting实验。一抗 Bax，c － Myc，
Bcl － 2，β － actin抗体以及二抗均选用中国中山金桥公司产品，
采用 SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳法，ECL显色试剂盒曝光显色。
2． 5 统计学分析 统计学分析应用 SPSS 13． 0 统计软件进行分
析，统计学意义采用标准偏差 珋x ± s表示，分析方法采用 student －
t检验。P ＜ 0． 05 为有差异性，P ＜ 0． 01 为有显著差异性。
3 结果
3． 1 OSW －1 抑制肝癌细胞增殖能力，对正常肝细胞毒性作用
较小 我们利用 MTT细胞毒性试验检测了 OSW － 1 对肝癌细胞
系 HepG2 和正常肝细胞 Chang － liver 细胞生长的影响。结果显
示，在给药 72 h 后，应用 OSW － 1 处理后可显著抑制肝癌细胞
HepG2 的生长( 与阴性对照组比较，P ＜ 0． 05 ) ; 在正常人永生化
肝细胞 Chang － liver 细胞组中，药物处理 72 h 后，OSW － 1 对正
常肝细胞没有明显毒性作用( 与阴性对照组相比，未发现统计学
意义) ，而与阿霉素处理的阳性对照组相比，OSW － 1 对正常肝细
胞的细胞毒性明显小于 ADＲ组( P ＜ 0． 05) 。结果见图 1。
图 1 MTT实验检测 OSW －1 对 HpeG2
及 Chang － liver细胞系增殖的影响
3． 2 OSW －1 可明显诱导肝癌细胞 HepG2 凋亡且与凋亡相关蛋
白相关 为了进一步研究 OSW －1 是否可能通过诱导肝癌细胞凋
亡，从而抑制肝细胞生长，我们选用对照组和 200 μg /ml OSW － 1
处理组的 HepG － 2 细胞系进行观察，在处理 48 h后，透射电镜结
果显示，DMSO处理组的肝癌细胞 HepG － 2 平铺伸展，细胞核及
细胞器完备，可见细胞核内染色质丰富，细胞膜完整( 图 2A) ;而
OSW － 1 处理组的肝癌细胞体积缩小，细胞质密度增加，线粒体
膜肿胀，通透性改变，核质浓缩，核膜核仁破碎几乎不可见，胞浆
内形成多个损伤小泡，胞膜有小泡状形成，形成几个凋亡小体，无
内容物外溢( 图 2B) 。
A．为未处理的肝癌细胞 HepG2;
B．为 OSW －1 处理后的肝癌细胞 HepG2，
可见药物处理 48 h后，肝癌细胞发生凋亡，
出现细胞核溶解现象，并出现吸收空泡
图 2 扫描电镜观察 OSW －1 对 HpeG2 细胞系凋亡的影响
为进一步研究 OSW －1 诱导凋亡的分子作用机制，采用
免疫印迹分析方法检测阴性对照组 HepG2 细胞、OSW － 1 100
μg /ml剂量组和 200 μg /ml 剂量组的凋亡相关蛋白 Bax，Bcl － 2
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及 c － Myc表达水平。免疫印迹分析结果示: 凋亡相关蛋白 Bcl
－ 2 及 c － Myc的蛋白表达随着 OSW － 1 剂量的增高而降低，而
Bax蛋白的表达则随 OSW －1 剂量增加而增加，说明 OSW － 1 可
以通过上调 Bax同时下调 Bcl － 2 及 c － Myc蛋白诱导凋亡，有效
抑制肝细胞癌生长。结果见图 3。
图 3 Western blotting实验检测 OSW －1 作用后
主要增殖指标的蛋白水平变化
4 讨论
肝癌的发生是一种细胞的异常增生，肝癌细胞无休止和无序
地分裂，表现为肝癌细胞生长的高增殖性，并可因此由原发部位
向它处扩散，侵犯要害器官最后导致患者死亡。肝细胞癌的高增
殖能力与其它恶性肿瘤一样是多基因、多因子及多步骤共同作用
的结果［4］。
目前肝癌的治疗手段仍以手术为主，术后的化疗可以有效抑
制肝癌细胞的继续增殖与扩散，而化疗药物对于人体的损害和对
正常肝细胞的杀伤作用较强，具有一定的毒副作用。近年来有关
中药提取物抗肿瘤的研究日益增多，越来越多的研究证实中草药
提取物的单体成分具有低毒高效抗肿瘤的作用，而相应的基础和
临床实验都亟待开展来进一步进行验证［5］。部分研究已经证明
虎眼万年青具有良好的抗肿瘤疗效，近年来在其结构和活性方面
的研究比较多［6］。本实验用具有侵袭和增殖能力较强的肝癌细
胞株 HepG2 与正常人永生化肝细胞 Chang － liver对比研究．观察
虎眼万年青提取物虎眼万年青皂苷 OSW － 1 的体外抗癌作用。
结果表明，浓度 200 μg /ml的 OSW －1 能显著抑制 HepG2 细胞的
增殖，并且随着作用时间的延长，抑制增殖的作用逐渐增强，而对
正常人永生化细胞 Chang － liver毒性较小，证明 OSW － 1 对肝癌
细胞具有较强的杀伤作用，而对正常人肝细胞损伤较小。
本实验通过透射电镜检测 OSW － 1 作用后 HepG2 细胞凋亡
情况时显示，与正常对照组比较，OSW － 1 作用 48 h，可以明显诱
导细胞凋亡，HepG2 细胞的形态学发生明显改变，在细胞浆内出
现损伤小泡并形成凋亡小体。细胞凋亡是由基因编码调控的细
胞主动自杀过程，又称程序性细胞死亡。同时也被认为是一个在
形态、生化和分子水平上起变化的特殊细胞死亡模式。形态学上
的变化包括染色质凝集、细胞核碎片、DNA 片段和凋亡小体，它
们是判断凋亡发生最可靠的标准［7］。这种形态学改变可以直观
地说明 OSW －1 作用后可以明显诱导肝癌细胞株的凋亡，从而抑
制其增殖，为 OSW －1 临床抗肿瘤作用提供了实验依据。为了进
一步研究 OSW － 1 抑制肝癌细胞增殖，诱导凋亡的作用机制，我
们利用免疫印记法检测了细胞凋亡的相关蛋白: Bax，c － Myc 以
及 Bcl － 2 蛋白。Bcl － 2 蛋白作为 Bcl － 2 家族中的主要抗凋亡成
员之一，在肿瘤的生长与增生方面起着重要的促进作用。大量研
究显示许多肿瘤细胞的 Bcl － 2 表达水平均显著升高，如肺癌、乳
腺癌、肝癌、宫颈癌等［8］。Bcl － 2 可以使得癌细胞对凋亡机制不
敏感，许多研究证实 Bcl － 2 的抗凋亡作用是与 c － Myc基因协同
完成的。Bax是 Bcl － 2 亚家族第一个分离到的蛋白，Bax 蛋白的
构象变化是调节细胞凋亡过程最为关键的一步。Bax 和 Bcl － 2
基因具有 40%的同源性。二者在细胞凋亡过程中起着重要作
用，现在普遍认为细胞对凋亡刺激因素的敏感性，关键取决于细
胞内 Bcl － 2 /Bax的比例。当 Bax /Bcl － 2 比例较高时，细胞趋向
凋亡，反之则细胞凋亡下降，Bcl － 2 可阻止凋亡形成因子如细胞
色素 C等从线粒体释放出来，具有促进肿瘤细胞增殖，抗凋亡作
用［9］。本实验中发现，随着 OSW － 1 作用剂量增加，肝癌细胞
HepG2 中，Bax蛋白表达明显升高，而 Bcl － 2 及 c － Myc蛋白表达
则受到抑制，提示 OSW －1 抑制肿瘤细胞增殖的作用可能通过增
加 Bax /Bcl － 2 比例，并同时降低 c － Myc与 Bcl － 2 的协同作用完
成。本实验进一步揭示虎眼万年青提取物 OSW － 1 在治疗肝细
胞癌等消化系统肿瘤方面具有广阔的应用前景，其机制还需要进
一步深入研究。
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