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虎眼万年青皂苷对肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响



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收稿日期: 2013-08-14; 修订日期: 2013-09-18
基金项目:吉林省科技厅青年科研基金项目( No. 20130522010JH)
作者简介:刘 超( 1972-) ,男( 满族) ,吉林吉林人,现任延边大学副主任
医师,博士学位,主要从事分子肿瘤学研究工作.
* 通讯作者简介:刘双萍( 1978-) ,女( 汉族) ,吉林敦化人,现任延边大学
副教授,博士学位,主要从事肿瘤学研究工作.
虎眼万年青皂苷
对肝癌细胞 HepG2 增殖与凋亡的影响
刘 超,刘双萍*
( 延边大学临床学院,吉林 延吉 133000)
摘要:目的 探讨虎眼万年青提取物虎眼万年青皂苷( OSW - 1) 抑制肝癌细胞增殖及诱导凋亡作用的机制。方法 利用
MTT细胞毒性实验检测 OSW -1 对人肝癌细胞 HepG2 和正常人永生化肝细胞 Chang - liver 增殖的影响,并采用透射电
镜实验进行验证;通过Western Blotting实验在蛋白水平检测 OSW -1 作用下,人肝癌细胞 HepG2 中常见的凋亡指标 Bax、
c - Myc、Bcl - 2 变化情况。结果 MTT与透射电镜实验证实 OSW -1 可以明显抑制人肝癌细胞 HepG2 的增殖诱导凋亡,
但对正常肝细胞 Chang - liver毒性较小,c - Myc、Bcl - 2 可随 OSW -1 作用剂量增加而表达下降,Bax随 OSW - 1 作用剂
量增加而表达升高。结论 OSW -1 可能通过上调 Bax蛋白表达,抑制 c - Myc、Bcl - 2 蛋白的表达而抑制肝癌细胞增殖,
对正常细胞毒性较小,可能开发为新型毒副作用较小的肝癌药物。
关键词: OSW -1; 肝癌细胞; 增殖; 凋亡
DOI标识: doi: 10. 3969 / j. issn. 1008-0805. 2013. 11. 025
中图分类号: R285. 5 文献标识码: A 文章编号: 1008-0805( 2013) 11-2634-03
肝细胞肝癌 ( Hepatocellμlar carcinoma,HCC) 作为最常见的
消化系统肿瘤之一,在世界范围内,其发病率排癌症发病率的第
5位,其死亡率排癌症死亡率的第 3 位[1],近年来对于肝癌的药
物治疗研究一直是肿瘤研究的热点。肝癌的发生是多个原癌基
因和抑癌基因参与的多基因、多步骤过程,其不断增殖及远处转
移是其致死的主要原因,药物治疗虽然有效,但未能有效减少肝
细胞癌的死亡率。因此,研发安全有效的新型抗癌药物对于提高
肿瘤的治疗水平具有重要意义。
虎眼万年青( Ornithogalum caudatum Ait) 为百合科虎眼万年
青属常绿多年生草本植物,又名胡连万年青、海葱等,原产于非洲
南部,我国各地也广泛栽培,吉林省长白山地区是其主要产区之
一。由于长白山海拔较高,土壤富含硒元素,长白山地区的虎眼
万年青具有更为显著的清热解毒、消坚散结等功能,民间全草入
药,常用于抗炎、抗肿瘤等。虎眼万年青含多种化学成分,如皂苷
类、生物碱类、黄酮类、三萜类等。近年来发现虎眼万年青皂苷
( OSW -1) 具有明显的抗肿瘤作用[2,3],但由于 OSW - 1 提取合
成工艺复杂昂贵,其在肿瘤中的研究较少,尤其是与肝癌的关系
研究更为罕见。本实验旨在研究长白山虎眼万年青皂苷 OSW -
1 对人肝癌细胞系 HepG2 增殖与凋亡的影响,进一步探讨 OSW
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 11 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2013 VOL. 24 NO. 11
- 1 对肝细胞癌的作用及机制。
1 材料
人正常永生化肝细胞 Chang - liver 以及肝癌细胞系 HepG2
细胞购自北京协和大学细胞中心。主要试剂: 虎眼万年青皂苷
( OSW -1) 由延边大学药学院惠赠; RPMI1640 培养基和新生牛
血清 FBS购自美国 Gibco公司.细胞培养瓶,96 孔板等耗材购等
自美国 Corning公司;荧光二抗及 DAPI购于美国 Invitrogen公司,
MTT细胞增殖与毒性试剂盒、4%戊二醛试剂与阿霉素( ADR) 等
均购于北京世纪康维公司。野生型 Bax、c - Myc、Bcl - 2,β - ac-
tin抗体以及二抗均选用中国中山金桥公司产品。
主要仪器为奥林帕斯倒置显微镜( BX53 ) ,酶标仪为 Thermo
全波段扫描仪,凝胶成像系统( Champ Chemi professional,北京赛
智) ,以及透射电子显微镜电镜( 日本 HITACHI) 。
2 方法
2. 1 细胞培养 人正常永生化肝细胞 Chang - liver 以及肝癌细
胞系 HepG2 细胞用含 10%胎牛血清的 RPMI1640 ( 含 20 mmol /L
Hepes,100 Μ /ml 青霉素 /链霉素) 。方法采用贴壁细胞传代的常
规方法,倒置显微镜观察,2 ~ 3 d传代 1 次。
2. 2 MTT细胞毒性试验 取对数生长期的正常永生化肝细胞
Chang - liver 以及 HepG2 细胞制为细胞悬液,以每孔 1 000 ~
10 000个细胞接种到 96 孔板,每孔体积 100 μl。分为阴性对照
组、5 μmol /L阿霉素 ( Adriamycin,ADR) 处理阳性对照组,OSW
-1 药物处理组,药物终浓度为 200 μg /ml。每组设 5 个平行孔。
药物作用细胞 24,48,72 h后,每孔加 20μl MTT溶液[5 mg /ml用
PBS( pH = 7. 4) 配];继续孵育 4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养
上清液,每孔加 150 μl DMSO,振荡 10 min,选择 490 nm波长,在
全波段酶标仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,
吸光值为纵坐标绘制细胞生长柱状图。
2. 3 透射电镜观察细胞凋亡 取处于对数生长期的 HepG2 细
胞,以每孔 4 × 105 ~ 1 × 107 细胞接种于 6 孔板中,在培养箱中培
养至合适阶段; 设对照组和 OSW - 1 处理组,阴性对照组加入
DMSO,OSW -1 处理组加入终浓度为 200 μg /ml 的药物,作用
48h后,0. 1%胰酶消化,在离心管内离心为细胞团块 ( 速度为 1
500 ~ 2 000 r /min,时间为 10 ~ 15 min) ,保证获取火柴头大小细
胞团块( 细胞数量至少 4 × 107 以上) ,吸去上清液,再进行 4%戊
二醛固定,以指腹轻拍细胞团块使之悬浮,固定后按常规方法包
埋,制备切片。应用日本 HITACHI透射电镜进行观察,由两名有
经验的病理医师分别选片,综合结果后采集图像。
2. 4 Western blot 检测蛋白变化 铺于 6 孔板内的 HepG2 细胞生
长至 60%左右时进行药物预处理。分为阴性对照组; 100 μg /ml
及 200 μg /ml OSW -1 药物处理组。药物作用细胞 48 h后,用加
入 1 /100 蛋白酶抑制剂的 RIPA裂解液( 北京世纪康维) 裂解,抽
提总蛋白,定量后用于 Western blotting实验。一抗 Bax,c - Myc,
Bcl - 2,β - actin抗体以及二抗均选用中国中山金桥公司产品,
采用 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳法,ECL显色试剂盒曝光显色。
2. 5 统计学分析 统计学分析应用 SPSS 13. 0 统计软件进行分
析,统计学意义采用标准偏差 珋x ± s表示,分析方法采用 student -
t检验。P < 0. 05 为有差异性,P < 0. 01 为有显著差异性。
3 结果
3. 1 OSW -1 抑制肝癌细胞增殖能力,对正常肝细胞毒性作用
较小 我们利用 MTT细胞毒性试验检测了 OSW - 1 对肝癌细胞
系 HepG2 和正常肝细胞 Chang - liver 细胞生长的影响。结果显
示,在给药 72 h 后,应用 OSW - 1 处理后可显著抑制肝癌细胞
HepG2 的生长( 与阴性对照组比较,P < 0. 05 ) ; 在正常人永生化
肝细胞 Chang - liver 细胞组中,药物处理 72 h 后,OSW - 1 对正
常肝细胞没有明显毒性作用( 与阴性对照组相比,未发现统计学
意义) ,而与阿霉素处理的阳性对照组相比,OSW - 1 对正常肝细
胞的细胞毒性明显小于 ADR组( P < 0. 05) 。结果见图 1。
图 1 MTT实验检测 OSW -1 对 HpeG2
及 Chang - liver细胞系增殖的影响
3. 2 OSW -1 可明显诱导肝癌细胞 HepG2 凋亡且与凋亡相关蛋
白相关 为了进一步研究 OSW -1 是否可能通过诱导肝癌细胞凋
亡,从而抑制肝细胞生长,我们选用对照组和 200 μg /ml OSW - 1
处理组的 HepG - 2 细胞系进行观察,在处理 48 h后,透射电镜结
果显示,DMSO处理组的肝癌细胞 HepG - 2 平铺伸展,细胞核及
细胞器完备,可见细胞核内染色质丰富,细胞膜完整( 图 2A) ;而
OSW - 1 处理组的肝癌细胞体积缩小,细胞质密度增加,线粒体
膜肿胀,通透性改变,核质浓缩,核膜核仁破碎几乎不可见,胞浆
内形成多个损伤小泡,胞膜有小泡状形成,形成几个凋亡小体,无
内容物外溢( 图 2B) 。
A.为未处理的肝癌细胞 HepG2;
B.为 OSW -1 处理后的肝癌细胞 HepG2,
可见药物处理 48 h后,肝癌细胞发生凋亡,
出现细胞核溶解现象,并出现吸收空泡
图 2 扫描电镜观察 OSW -1 对 HpeG2 细胞系凋亡的影响
为进一步研究 OSW -1 诱导凋亡的分子作用机制,采用
免疫印迹分析方法检测阴性对照组 HepG2 细胞、OSW - 1 100
μg /ml剂量组和 200 μg /ml 剂量组的凋亡相关蛋白 Bax,Bcl - 2
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及 c - Myc表达水平。免疫印迹分析结果示: 凋亡相关蛋白 Bcl
- 2 及 c - Myc的蛋白表达随着 OSW - 1 剂量的增高而降低,而
Bax蛋白的表达则随 OSW -1 剂量增加而增加,说明 OSW - 1 可
以通过上调 Bax同时下调 Bcl - 2 及 c - Myc蛋白诱导凋亡,有效
抑制肝细胞癌生长。结果见图 3。
图 3 Western blotting实验检测 OSW -1 作用后
主要增殖指标的蛋白水平变化
4 讨论
肝癌的发生是一种细胞的异常增生,肝癌细胞无休止和无序
地分裂,表现为肝癌细胞生长的高增殖性,并可因此由原发部位
向它处扩散,侵犯要害器官最后导致患者死亡。肝细胞癌的高增
殖能力与其它恶性肿瘤一样是多基因、多因子及多步骤共同作用
的结果[4]。
目前肝癌的治疗手段仍以手术为主,术后的化疗可以有效抑
制肝癌细胞的继续增殖与扩散,而化疗药物对于人体的损害和对
正常肝细胞的杀伤作用较强,具有一定的毒副作用。近年来有关
中药提取物抗肿瘤的研究日益增多,越来越多的研究证实中草药
提取物的单体成分具有低毒高效抗肿瘤的作用,而相应的基础和
临床实验都亟待开展来进一步进行验证[5]。部分研究已经证明
虎眼万年青具有良好的抗肿瘤疗效,近年来在其结构和活性方面
的研究比较多[6]。本实验用具有侵袭和增殖能力较强的肝癌细
胞株 HepG2 与正常人永生化肝细胞 Chang - liver对比研究.观察
虎眼万年青提取物虎眼万年青皂苷 OSW - 1 的体外抗癌作用。
结果表明,浓度 200 μg /ml的 OSW -1 能显著抑制 HepG2 细胞的
增殖,并且随着作用时间的延长,抑制增殖的作用逐渐增强,而对
正常人永生化细胞 Chang - liver毒性较小,证明 OSW - 1 对肝癌
细胞具有较强的杀伤作用,而对正常人肝细胞损伤较小。
本实验通过透射电镜检测 OSW - 1 作用后 HepG2 细胞凋亡
情况时显示,与正常对照组比较,OSW - 1 作用 48 h,可以明显诱
导细胞凋亡,HepG2 细胞的形态学发生明显改变,在细胞浆内出
现损伤小泡并形成凋亡小体。细胞凋亡是由基因编码调控的细
胞主动自杀过程,又称程序性细胞死亡。同时也被认为是一个在
形态、生化和分子水平上起变化的特殊细胞死亡模式。形态学上
的变化包括染色质凝集、细胞核碎片、DNA 片段和凋亡小体,它
们是判断凋亡发生最可靠的标准[7]。这种形态学改变可以直观
地说明 OSW -1 作用后可以明显诱导肝癌细胞株的凋亡,从而抑
制其增殖,为 OSW -1 临床抗肿瘤作用提供了实验依据。为了进
一步研究 OSW - 1 抑制肝癌细胞增殖,诱导凋亡的作用机制,我
们利用免疫印记法检测了细胞凋亡的相关蛋白: Bax,c - Myc 以
及 Bcl - 2 蛋白。Bcl - 2 蛋白作为 Bcl - 2 家族中的主要抗凋亡成
员之一,在肿瘤的生长与增生方面起着重要的促进作用。大量研
究显示许多肿瘤细胞的 Bcl - 2 表达水平均显著升高,如肺癌、乳
腺癌、肝癌、宫颈癌等[8]。Bcl - 2 可以使得癌细胞对凋亡机制不
敏感,许多研究证实 Bcl - 2 的抗凋亡作用是与 c - Myc基因协同
完成的。Bax是 Bcl - 2 亚家族第一个分离到的蛋白,Bax 蛋白的
构象变化是调节细胞凋亡过程最为关键的一步。Bax 和 Bcl - 2
基因具有 40%的同源性。二者在细胞凋亡过程中起着重要作
用,现在普遍认为细胞对凋亡刺激因素的敏感性,关键取决于细
胞内 Bcl - 2 /Bax的比例。当 Bax /Bcl - 2 比例较高时,细胞趋向
凋亡,反之则细胞凋亡下降,Bcl - 2 可阻止凋亡形成因子如细胞
色素 C等从线粒体释放出来,具有促进肿瘤细胞增殖,抗凋亡作
用[9]。本实验中发现,随着 OSW - 1 作用剂量增加,肝癌细胞
HepG2 中,Bax蛋白表达明显升高,而 Bcl - 2 及 c - Myc蛋白表达
则受到抑制,提示 OSW -1 抑制肿瘤细胞增殖的作用可能通过增
加 Bax /Bcl - 2 比例,并同时降低 c - Myc与 Bcl - 2 的协同作用完
成。本实验进一步揭示虎眼万年青提取物 OSW - 1 在治疗肝细
胞癌等消化系统肿瘤方面具有广阔的应用前景,其机制还需要进
一步深入研究。
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