全 文 ：2009年 7月July2009 色 谱ChineseJournalofChromatography
Vol.27 No.4
509 ～ 512
通讯联系人:于治国, 教授.Tel:(024)23986295, E-mail:zhiguo-yu@163.com.
收稿日期:2008-11-20
中药滴水珠中 NeoechinulinA的分离及测定
王　琦 , 　赵云丽 , 　高晓霞 , 　王欣杨 , 　于治国＊
(沈阳药科大学药学院 , 辽宁 沈阳 110016)
摘要:采用柱色谱法对中药滴水珠中的有效成分 NeoechinulinA进行分离纯化 ,运用现代波谱技术进行结构鉴定 ,
采用反相高效液相色谱法测定其含量。色谱条件:DiamonsilC18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 流动相为甲醇-
0.1%磷酸溶液(体积比为 63∶37), 流速为 1.0 mL/min,柱温为 30℃, 检测波长为 225 nm, 进样量为 10 μL。结果
表明 , NeoechinulinA的质量浓度在 2.0 ～ 40.0 mg/L范围内与其峰面积有良好的线性关系(r=0.999 5);方法的
加样回收率为 98.3%～ 101.1%。该方法简便 、快速 、准确 ,可作为中药滴水珠质量控制的一个有效方法。
关键词:反相高效液相色谱法;吲哚类生物碱;NeoechinulinA;滴水珠;中药
中图分类号:O658　　文献标识码:A　　文章编号:1000-8713(2009)04-0509-04　　栏目类别:技术与应用
IsolationanddeterminationofNeoechinulinA
inCordatePinelliaTuber
WANGQi, ZHAOYunli, GAOXiaoxia, WANGXinyang, YUZhiguo＊
(SchoolofPharmacy, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016 , China)
Abstract:TheNeoechinulinAinCordatePineliaTuberwasisolatedbycolumnchromatogra-
phyandidentifiedbymassspectrometryandnuclearmagneticresonance(NMR).Amethodof
reversed-phasehighperformanceliquidchromatography(RP-HPLC)forthedeterminationof
theNeoechinulinAinCordatePineliaTuberwasdeveloped.Thechromatographywasper-
formedonaDiamonsilC18 column(250 mm×4.6mm, 5 μm)withamixtureofmethanoland
0.1% phosphoricacidsolution(63∶37 , v/v)asmobilephaseataflowrateof1.0 mL/min.
Thedetectionwavelengthwassetat225nmandthecolumnoventemperaturewassetat30℃.
Thevolumeofinjectionwas10μL.Therewasagoodlinearrelationship(r=0.999 5)between
themassconcentrationandthepeakareaofNeoechinulinAintherangeof2.0-40.0 mg/L.
Therecoverywas98.3%-101.1%.Themethodisrapidandsimplewithgoodaccuracy, repro-
ducibilityandsuitableforthequalitycontrolofCordatePineliaTuberfromdiferentsources.
Keywords:reversed-phasehighperformanceliquidchromatography(RP-HPLC);indole
alkaloids;NeoechinulinA;CordatePineliaTuber;Chineseherbaldrug
图 1　NeoechinulinA的结构式
Fig.1　StructureofNeoechinulinA
　　滴水珠(CordatePineliaTuber)为天南星科半
夏属草本植物心叶半夏(PineliacordataN.E.
Br.)的干燥块茎 , 具有解毒止痛 、行瘀消肿之功
效 [ 1] ,用于治疗毒蛇咬伤 、胃痛 、头痛 、腰痛 、痈疮肿
毒与跌打损伤等 ,内服外用皆可 ,临床常用于肿瘤病
人的消肿止痛 ,效果甚佳 [ 2] 。目前国内外关于滴水
珠化学成分及质量控制方面的研究报道甚少 ,仅有
初步确定该药材中含有淀粉 、生物碱类化合物 、油
酸 、多种氨基酸 、 β-谷甾醇及其 D-葡萄糖苷的报
道 [ 3] ;滴水珠的具体有效成分尚不明确。本文从研
究滴水珠化学成分入手 ,分离得到吲哚类生物碱
NeoechinulinA(结构式见图 1)。 NeoechinulinA
具有抑制霍乱弧菌 、抗肿瘤 、抗氧化和清除自由基等
药理活性 [ 4, 5] ,故以此为指标成分 ,采用反相高效液
相色谱法 (RP-HPLC)对其含量进行测定 。结果表
明该方法准确 、快速 、专属性强 ,可用于滴水珠的深
入研究及质量控制 。
色 谱 第 27卷
1　实验部分
1.1　仪器与试药
　　高效液相色谱仪(日本岛津公司),包括 LC-
10ATvp输液泵 , SPD-10Avp可变波长紫外检测器;
N2010色谱数据处理系统;Avance-600超导核磁共
振仪(瑞士 Bruker公司);2010A-LC/MS(日本 Shi-
madzu公司)。 SephadexLH-20(大连开米隆科技
有限公司);柱色谱用硅胶 G和薄层色谱用硅胶 G、
GF254(青岛海洋化工厂)。
　　甲醇 、乙腈(均为色谱纯),二次蒸馏水(自制),
磷酸 、石油醚 、乙酸乙酯 、正丁醇 (均为分析纯),
95%乙醇(医用)。滴水珠药材购自安徽 、浙江药材
公司(经沈阳药科大学袁久志副教授鉴定为正品)。
表 1　NeoechinulinA的 NMR数据(DMSO-d6)
Table1　NMRdataofNeoechinulinA(DMSO-d6)
No. 13C-NMR(150MHz)
1H-NMR
(600MHz)
HMBC(heteronuclearmultiple-bondcorrelation)
(C-H)
1 11.05(1H, brs, 1-NH) 126.0(3a), 103.5(3), 135.2(7a), 144.0(2)
2 144.0
3 103.5
3a 126.0
4 118.9 7.18(1H, d, J=8.4Hz, 4-H) 120.8(6), 126.0(3a), 135.2(7a), 103.5(3)
5 119.4 6.99-7.03(1H, m, 5-H) 110.2(8), 111.6(7), 118.9(4), 120.8(6), 126.0(3a)
6 120.8 7.07-7.09(1H, m, 6-H) 118.9(4), 135.2(7a)
7 111.6 7.42(1H, d, J=8.4Hz, 7-H) 119.4(5), 126.0(3a)
7a 135.2
8 110.2 6.89(1H, s, 8-H) 126.0(3a), 144.0(2), 160.0(10), 166.5(13)
9 125.0
10 160.0
11 8.33(1H, brs, 11-NH) 125.0(9), 166.5(13), 50.6(12)
12 50.6 4.15(1H, q, J=7.0Hz, 12-H) 160.0(10), 166.5(13), 19.7(20)
13 166.5
14 8.66(1H, brs, 14-NH) 110.2(8), 125.0(9), 160.0(10), 166.5(13), 50.6(12)
15 39.1
16 145.2 6.08(1H, dd, J=17.4Hz, 10.2Hz, 16-H) 27.3(18), 27.5(19)
17 111.7 5.05(1H, dd, J=10.8Hz, 1.2Hz, 17-H) 145.2(16)
5.02(1H, dd, J=17.4Hz, 1.2Hz, 17-H)
18 27.3 1.48(6H, s, 18-CH3 , 19-CH3) 111.7(17), 144.0(2), 145.2(16)
19 27.5 111.7(17), 144.0(2), 145.2(16)
20 19.7 1.37(3H, d, J=7.2Hz, 20-CH3) 166.5(13), 50.6(12)
1.2　分离与鉴定
1.2.1　提取与分离
　　取滴水珠药材 6 kg,以 10倍量 95%乙醇回流
提取 2次 ,每次 2 h,过滤 ,合并滤液 ,减压浓缩得浸
膏 112g。浸膏用 5倍量水分散后 ,依次用石油醚 、
乙酸乙酯 、正丁醇等体积萃取各 3次 ,其中乙酸乙酯
萃取液经浓缩后得粗提物约 8.0 g,作为样品备用。
　　取柱色谱用硅胶 G(200 ～ 300目)280 g,加入
二氯甲烷搅拌均匀 ,湿法装柱 ,柱直径与柱床高度比
为 1∶15,保留体积为 600 mL。取样品 8.0 g,用少
量二氯甲烷溶解 ,与柱色谱用硅胶 G(100 ～ 200目)
12.0 g混合磨匀 ,上样 ,用二氯甲烷 (A)-甲醇(B)
梯度洗脱 , A与 B的体积比分别为 100∶0(4 000
mL), 100∶1(4 000 mL), 50∶1(3 600 mL), 30∶1
(3 600 mL), 20∶1(4 800mL), 15∶1(4 200 mL), 10
∶1(3 400 mL), 1∶1(6 000 mL),得 200个流分(Fr1
1 ～ 200,每个流分的体积约 200 mL)。将 Fr1 79 ～
86(二氯甲烷-甲醇的体积比为 50∶1时洗脱下来的
流分)浓缩 ,点样于 20 cm×20cm的制备薄层板上
(采用薄层色谱用硅胶 G铺板 ,厚度 0.5 ～ 1 mm),
以氯仿-甲醇(体积比为 8∶1)为展开剂 ,展开 ,取出 ,
晾干 ,置于紫外灯(365 nm)下检视 ,标记色带并将
其刮下 ,装入玻璃小柱 ,用甲醇洗脱。将洗脱液浓缩
后 ,过装填 SephadexLH-20的色谱柱(1 cm×100
cm),用甲醇洗脱 ,流速 0.5 mL/min;每 5 mL收集
一个流分 ,共收集 25个流分(Fr2 1 ～ 25),对各流分
均进行薄层色谱分析 ,将比移值相同部分合并。 Fr2
18 ～ 20以甲醇重结晶后 ,得淡黄色无定形粉末。
1.2.2　结构鉴定
　　该粉末易溶于甲醇 、氯仿。电喷雾质谱(ESI-
MS)解析结果为 m/z346[ M+Na] +、m/z322[ M
-H] -,提示其相对分子质量为 323。结合核磁共
振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据推测其分
子式为 C19H21 O2N3。其1H-NMR、13C-NMR及异核
多键相关谱(HMBC)归属见表 1。参照文献 [ 6] ,其
结构鉴定为 NeoechinulinA, HPLC纯度为 99.5%。
·510·
　第 4期 王　琦 ,等:中药滴水珠中 NeoechinulinA的分离及测定
1.3　含量测定
1.3.1　色谱条件
　　色谱柱:DiamonsilC18柱(250 mm×4.6 mm,
5 μm);流动相:甲醇-0.1%磷酸溶液(体积比为 63
∶37),流速 1.0 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:225
nm;进样量:10μL。
1.3.2　对照溶液的制备
　　取 NeoechinulinA适量 ,精密称定 ,置于 25mL
容量瓶中 ,加乙腈溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,得 0.2
g/L对照储备液 。精密量取对照储备液 1.0 mL,置
于 10 mL量瓶中 ,加入乙腈稀释至刻度 ,摇匀 ,得
0.02g/L对照溶液。
1.3.3　供试溶液的制备
　　取经 40 ℃干燥的滴水珠粉末(过 60目筛)约
2.0g,精密称定 ,用浓氨水 3 mL润湿后再加氯仿
40 mL于室温下浸泡 12h,超声提取 45 min后过
滤 ,回收溶剂 。残渣用乙腈溶解 ,并转移至 2 mL量
瓶 ,稀释至刻度 ,摇匀 ,经 0.45 μm微孔滤膜过滤 。
取续滤液作为供试液 ,在 1.3.1节条件下测定 ,以外
标法计算其含量 。
2　结果与讨论
2.1　色谱条件的选择
　　参照文献 [ 7, 8]分别对甲醇 -水 、甲醇 -水 -磷酸 、
乙腈-水 、乙腈-水-磷酸在不同配比下组成的流动相
进行考察 ,发现以 1.3.1节中甲醇-水-磷酸系统为
流动相时色谱峰峰形好 ,保留时间短 ,柱效高 ,分离
度理想;检测波长选择其最大吸收波长 225 nm。
2.2　HPLC系统适用性试验
　　取供试溶液 10 μL进样 ,目标组分的保留时间
约 10.3min,与相邻峰的分离度均大于 1.5 ,理论板
数不低于 12 000/m。
　　供试溶液及对照溶液的色谱图见图 2。
2.3　提取条件的选择
2.3.1　提取方法
　　因 NeoechinulinA为脂溶性生物碱且易溶于
氯仿 ,故参照文献 [ 9]选择以氯仿为提取溶剂的亲
脂性有机溶剂提取法 。取经 40 ℃干燥的滴水珠药
材(产地:安徽 , 批号:0805)粉末 (过 60目筛)约
2.0g,精密称定 ,加浓氨水 3 mL润湿后 ,考察了用
不同体积的氯仿 、不同浸泡时间及采用回流提取和
超声提取的提取效果 。结果表明 ,采用 20倍量氯仿
浸提 12 h后进行超声处理 ,提取物中杂质少 ,待测
物的提取效率高 ,且两种方法含量相差不大 (见表
2)。因超声方法操作简便 ,故最终选用碱化后亲脂
性有机溶剂超声提取法。
图 2　NeoechinulinA(a)对照溶液和(b)供试溶液的色谱图
Fig.2　Chromatogramsof(a)controland
(b)asampleofNeoechinulinA
表 2　样品中 NeoechinulinA提取方法的比较(n=3)
Table2　Comparisonofextractionmethodsfor
NeoechinulinAinsamples(n=3)
Method V(Chloroform)/mL
Soaking
time/h
Sample
amount/g
Content/
(μg/g)
Ultrasonic 40 6 2.026 7.633
40 12 2.009 8.806
40 24 2.009 8.832
20 12 2.010 5.193
60 12 2.011 8.811
Reflux 40 6 2.005 8.662
40 12 2.008 8.783
40 24 2.004 8.807
2.3.2　超声提取时间
　　按 1.3.3节 “浸泡 12 h”前所述步骤制备供试
溶液 ,对其进行超声处理 ,考察不同超声提取时间对
待测物含量的影响 ,发现超声提取 45min即可提取
完全(见表 3),最终选择超声提取时间为 45 min。
表 3　样品中 NeoechinulinA超声提取时间的比较(n=3)
Table3　Comparisonofultrasonicextractiontimefor
NeoechinulinAinsamples(n=3)
Extractiontime/min Sampleamount/g Content/(μg/g)
30 2.014 7.455
45 2.009 8.806
60 2.006 8.814
2.4　制备待测溶液的溶剂的选择
　　取两份等量的 NeoechinylinA粉末 ,分别用等
体积的甲醇和乙腈溶解 ,室温下放置 7 d后进行色
谱分析。发现在以甲醇为溶剂的待测溶液的色谱图
中 ,除了目标物峰外 ,还出现了多个杂质峰 ,且主峰
峰面积减小;以乙腈为溶剂时 ,目标组分很稳定(见
图 3)。故选择乙腈为制备待测溶液的溶剂 。
·511·
色 谱 第 27卷
图 3　以(a)甲醇和(b)乙腈为溶剂配制的 NeoechinulinA
对照溶液的稳定性
Fig.3　StabilityofNeoechinulinAcontrolsolutionusing
(a)methanoland(b)acetonitrileassolvents
Thesolutionswerestoredatroomtemperaturefor7days.
2.5　方法学确证
2.5.1　线性范围
　　分别精密量取对照储备液 0.1, 0.2, 0.5, 1.0,
1.5和 2.0 mL,置于 10 mL容量瓶中 ,加乙腈稀释
至刻度 ,摇匀 ,得系列标准溶液。分别进样 10 μL,
以标准溶液的质量浓度(mg/L)为横坐标 X、色谱峰
面积为纵坐标 Y绘制标准曲线 ,得到的回归方程为
Y=8.91 ×103X-70.11(r=0.999 5),表明 Neo-
echinulinA在 2.0 ～ 40.0 mg/L范围内呈良好的线
性关系 。
2.5.2　定量限
　　将对照储备液稀释 ,以信噪比(S/N)为 10时的
相应质量浓度为定量限 ,其定量限为 60μg/L。
2.5.3　精密度
　　精密吸取同一供试溶液 10 μL,重复进样 6次 ,
记录色谱图 ,测量峰面积 ,其相对标准偏差(RSD)
为 1.7%,表明仪器的精密度良好 。
　　取同一滴水珠样品(产地:安徽 ,批号:0805),
按 1.3.3节所述平行制备 6份供试溶液进行测定 ,
NeoechinulinA的平均含量 (按生药计 )为 8.78
μg/g,其 RSD为 1.9%,表明方法的精密度良好 。
2.5.4　溶液的稳定性
　　取新制备的同一份供试溶液 ,分别在室温下放
置 0 , 1, 2, 4, 8, 12 h后进样 ,记录色谱图 ,测量峰面
积 ,用当日新配制的对照溶液按外标法计算 , RSD
为 1.5%(n=6),表明供试溶液在 12 h内稳定 。
2.5.5　回收率
　　称取已知含量的滴水珠样品 (产地:安徽 ,批
号:0805)9份 ,每份 1.0g,精密称定 ,分别精密加入
对照溶液 0.22, 0.44和 0.66mL,每个样品按 1.3.3
节所述平行制备 3份 ,在 1.3.1节色谱条件下进样
分析 ,计算得出的回收率结果见表 4。
表 4　NeoechinulinA的回收率(n=3)
Table4　RecoveryofNeoechinulinA(n=3)
No. Original/μg Added/μgFound/μgRecovery/% RSD/%
1 8.86 4.40 13.21 98.9 1.4
2 8.79 8.80 17.69 101.1 1.9
3 8.85 13.20 21.82 98.3 1.0
2.6　样品测定
　　取不同产地 、不同批次的滴水珠药材 ,按 1.3.3
节所述制备供试溶液进行 NeoechinulinA含量的
测定 。结果表明 , NeoechinulinA的含量分别为:安
徽药材 (批号:0803)6.91 μg/g、安徽药材(批号:
0805)8.80 μg/g、安徽药材 (批号:0806)14.15
μg/g、安徽药材(批号:0811)7.97 μg/g、浙江药材
4.86 μg/g。
3　结语
　　本文所建立的测定 NeoechinulinA含量的方
法简便 、快速 、准确 、线性范围广 ,可以作为滴水珠药
材质量控制的一个有效方法 。
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