全 文 ：五节芒 ISSR-PCR反应体系的优化
金琳 ,葛刚 ,陈少风＊ ,杨赛钢 ,章 泉　(南昌大学生命科学与食品工程学院 ,江西南昌 330031)
摘要　 [目的]保护五节芒的种质资源并为其开发利用奠定基础。 [方法 ]以五节芒DNA为材料 ,分析DNA浓度 、Mg2+浓度、dNTP浓
度、TaqDNA聚合酶的含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响。并通过单因子试验对ISSR-PCR反应体系进行优化。 [结果]建
立了五节芒ISSR-PCR的最佳体系:25μl反应体系中 10×PCRBufer2.5 μl、0.2 mmol/L4×dNTP、1.5mmol/LMg2+、0.75UTaqDNA
聚合酶。PCR反应程序为 94℃预变性 5min;94℃变性 30s;51～ 53℃退火 30s, 72℃延伸 50s, 40个循环;72℃再延伸 7min。利用优
化反应体系从 100个ISSR通用引物中筛选出了 11个稳定性高、重复性好的引物。 [结论]这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技
术研究五节芒遗传多样性奠定了基础。
关键词　五节芒;基因组 DNA;ISSR-PCR;优化
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)29-14041-03
OptimizationofISSR-PCRReactionSystemforMiscanthusfloridulus
JINLinetal　(SchoolofLifeSciencesandFoodEngineering, NanchangUniversity, Nanchang, Jiangxi330031)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtoprotectthegermplasmresourcesofMiscanthusfloridulusandlaythefoundationforitsdevelop-
mentandutilization.[ Method] WithDNAofM.floridulusasmaterials, theefectsofDNAconcentration, Mg2+concentration, dNTPcon-
centrationandTaqDNApolymerasecontent, andannealingtemperatureontheresultsofamplificationISSR-PCRresultswereanalyzed.Byu-
singsinglefactortest, ISSR-PCRreactionsystemwasoptimized.[ Result] TheoptimumsystemofISSR-PCRforM.floriduluswasasfolows:
25μlsystemcontaining0.2mmol/L4×dNTP, 1.5 mmol/LMg2+ , 0.75 UTaqDNApolymerase.PCRreactionprocedurewasasfolows:
pre-denaturizingat94 ℃for5min, denaturizingat94℃for30s, annealingat51-53℃for30s, extensionat72℃for50s, 40cycles;
re-extensionat72℃for7min.11primerswithhighstabilityandgoodrepeatabilitywerescreenedfrom100ISSRcommonprimersbyusing
theoptimizedreactionsystem.[ Conclusion] ThisoptimalsystemlaidthefoundationfortheresearchonthegeneticdiversityofM.floridulus
byusingISSRtechnology.
Keywords　Miscanthusfloridulus;GenomicDNA;ISSR-PCR;Optimization
基金项目　国家“ 973”项目子项目。
作者简介　金琳(1982-),女 ,湖南湘潭人 , 硕士研究生 ,研究方向:植
物生态学。 ＊通讯作者 , E-mail:sfchen@ncu.edu.cn。
收稿日期　2009-06-18
　　五节芒 [ Miscanthusflavidus(Labil.)Warb.exSchum.
etLaut.]为禾本科(Gramineae)芒属(MiscanthusAnders)多
年生草本植物 ,原产于东亚地区 [ 1] 。五节芒不仅可作药用 、
观赏 ,而且可作为纺织 、造纸材料和新型生物能源等。学者
们从五节芒的形态学 、生态学 、资源利用 、生理生化等方面展
开了基础性研究 [ 2-12] ,但尚未见有关 ISSR分子在五节芒上
的研究报道。
ISSR(InterSimpleSequenceRepeat)又称为简单序列重
复区间扩增 ,是 Zietkiewicz等于 1994年在 SSR基础上创
建 [ 13] 。其操作简单 ,遗传多态性高 ,重复性好 ,而且为显性
标记。ISSR技术己在品种鉴定 、遗传作图和居群遗传学等研
究中有应用 ,在遗传多样性和亲缘关系研究中的应用极为广
泛。利用 ISSR分析五节芒的遗传多样性可为保护种质资源
和能源开发奠定基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料　供试材料五节芒采自婺源大鄣山。采样时
选择健康嫩叶 ,放入硅胶 ,于 4 ℃冰箱保存备用。
TaqDNA聚合酶 、dNTP、Mg2+均为上海申能博彩生物有
限公司产品;试验所用 ISSR引物为上海生工生产的 100个
通用引物;PCR反应在 2720 ThermalCycler上进行。
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA的提取 、纯化与检测。采用改良的 CTAB
法 [ 14]提取五节芒叶片的基因组 DNA,然后进行 DNA纯化 ,
放于 -20℃冰箱保存;模板 DNA经过纯化后 ,用 UV-1700分
光光度计测定 OD260和 OD280的值 ,检测 DNA纯度。
1.2.2　 PCR扩增条件及电泳。以五节芒基因组 DNA为模
板 ,根据预试验的结果 ,对影响 ISSR-PCR扩增的主要参数设
置了不同的梯度 (表 1)。 ISSR-PCR反应总体系为 25 μl。
PCR反应程序为 94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s;51 ～ 53
℃退火 30s;72℃延伸 50 s;40个循环;72 ℃再延伸 7 min;4
℃恒温保存 。
表 1　影响ISSR-PCR扩增的主要参数
Table1　TheprimaryparametersinfluencingtheamplificationofIS-
SR-PCR
参数 Parameters 梯度 Gradients
DNA模板浓度∥ng 25、50、100、200、400
循环数∥次 30、35、40、45
dNTP浓度∥mmol/L 0.1、0.2、0.3
Mg2+浓度∥mmol/L 1.0、1.5、2.0、2.5
TaqDNA聚合酶∥U 0.75、1.00、1.25、1.50
　　PCR产物每管加入 2 μl上样缓冲液(30.00%蔗糖 ,
0.25%溴酚蓝 , 0.25%二甲苯氰),采用 1.50%琼脂糖凝胶检
测 , EB染色 ,电压为 110V,电流 80mA,稳压电泳 60min。在
凝胶成像分析系统上观察并拍照记录。
1.2.3　 ISSR-PCR反应体系和退火温度的优化设计。 PCR
反应的优化包括反应体系各成分的含量和退火温度的优化 ,
主要参数设置见表 1。退火温度设置在 51 ～ 53 ℃。
2　结果与分析
2.1　 DNA模板浓度对反应体系的影响 　 DNA模板浓度
是影响 ISSR-PCR的一个因子。模板浓度过低 ,扩增不稳定
或无法扩增;模板浓度过高 ,又会相应增加非特异性扩增的
出现 [ 15] 。该试验设置了 5个梯度(图 1)。结果显示 , DNA
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(29):14041-14043, 14077 责任编辑　金琼琼　责任校对　况玲玲
浓度为 25 ～ 400 ng时均能成功扩增出条带 ,但 DNA浓度为
50 ng时扩增效果最好 ,符合试验的要求。
2.2　循环次数对反应体系的影响 　循环次数对扩增的影
响很大 ,循环次数少 ,扩增产物少;随着循环次数的增多 ,扩
增产物也越多 ,但循环次数并不是越多越好 ,随着原料的消
耗和出现非特异性扩增机会的增加 ,循环超过最佳次数时扩
增受影响 ,最终影响扩增效果。该试验设置了 4个不同循环
次数(图 2)。结果显示 ,循环 30次看不到扩增的条带 , 35次
条带很弱 , 45次条带模糊不清 ,循环 40次为最佳 ,扩增的条
带最清楚 ,主次分明。因此 ,试验确定循环 40次为最佳循环
次数。
注:1～ 5泳道的模板DNA浓度分别为 400、200、100、50、25ng。
Note:TheconcentrationoftemplateDNAinlane1-5areDNAtem-
plate400, 200, 100, 50, 25ngresp.
图 1　模板 DNA浓度对ISSR扩增的影响
Fig.1　EffectoftemplateDNAconcentrationonISSRamplification
注:1～ 4泳道分别为循环 30、35、40、45次。
Note:Thecyclenumberforlane1-4are30, 35, 40, 45resp.
图 2　循环数对ISSR扩增的影响
Fig.2　EffectofcyclenumberonISSRamplification
2.3　引物对反应体系的影响 　不同的引物和退火温度对
扩增有直接的影响 。从 100个 ISSR通用引物中筛选出 11个
适合五节芒基因组 DNA的引物(表 2):ISSR809、819、820、
822、824、860、885、889、884、887、888。退火温度在 ISSR反应
体系中起着至关作用 。退火温度过低能保证引物与模板结
合的稳定性 ,但也会引起引物与模板产生错配 ,产生非特异
性条带;退火温度过高则会抑制引物与模板的结合 [ 16] 。最
终确定退火温度一般低于引物 Tm值的 1 ～ 2 ℃为宜(图 3)。
表 2　引物序列与退火温度的关系
Table2　Therelationshipbetweenprimersequenceandannealingtem-
perature
序列号SequenceNo.
序列(5′-3′)Sequence(5′-3′)
退火温度∥℃Annealingtemperature
ISSR-809 AGAGAGAGAGAGAGAGG 53
ISSR-819 GTGTGTGTGTGTGTGTA 51
ISSR-820 GTGTGTGTGTGTGTGTC 53
ISSR-822 TCTCTCTCTCTCTCTCA 51
ISSR-824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 53
ISSR-860 TGTGTGTGTGTGTGTGRA 52
ISSR-884 HBHAGAGAGAGAGAGAG 51
ISSR-885 BHBGAGAGAGAGAGAGA 52
ISSR-887 DVDTCTCTCTCTCTCTC 51
ISSR-888 BDBCACACACACACACA 52
ISSR-889 DBDACACACACACACAC 51
注:1～ 11泳道的 ISSR引物依次为 809、820、824、 819、822、860、
885、889 、884、887、888。
Note:Lane1-11 areISSR-809, 820, 824, 819, 822, 860, 885,
889, 884, 887, 888resp.
图 3　引物在最佳退火温度下扩增
Fig.3　Primeramplificationunderoptimalannealingtempera-
ture
2.4　dNTP浓度对反应体系的影响　 dNTP是 PCR反应的
原料。dNTP浓度过低 ,分子碰撞的几率降低 ,导致扩增带产
率低 ,因而条带模糊;而 dNTP浓度过高导致 TaqDNA聚合
酶在非靶位置启动与核苷酸的错配 ,产生错误渗入 ,从而降
低了准确率 [ 17] 。该试验设置了 3个梯度的 dNTP浓度(图
4)。结果显示 , dNTP浓度为 0.1 ～ 0.3 mmol/L,均能成功扩
增 ,而当 dNTP浓度 0.2 mmol/L时 ,扩增效率最高 ,条带最
亮 。因此 ,该试验采用 0.2mmol/L为最佳 dNTP浓度。
2.5　TaqDNA聚合酶浓度对反应体系的影响 　TaqDNA
聚合酶是 PCR反应中的重要因子。该试验设置了 4个梯度
(图 5)。结果显示 , TaqDNA聚合酶浓度为 0.75 ～ 1.50 U
时 ,均能成功扩增出条带;考虑到经济的原因 ,选择 0.75 U
为最佳 TaqDNA聚合酶浓度。
2.6　Mg2+浓度对反应体系的影响 　 Mg2+是 TaqDNA聚
合酶的激活剂 , Mg2+不足 ,则 TaqDNA聚合酶的作用效率
低 。同样 ,引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度二价
阳离子的影响 ,特别是其中的 Mg2+浓度能影响反应的特异
性和扩展片断的产率 [ 18] 。该试验设置了 4个 Mg2+浓度梯度
14042 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
注:1～ 3泳道的 dNTP浓度分别为 0.1、0.2、0.3mmol/L。
Note:dNTPconcentrationinLane1-3are0.1, 0.2, 0.3 mmol/L
resp.
图 4　dNTP浓度对ISSR扩增的影响
Fig.4　 EfectofdNTPconcentrationonISSRamplification
注:1～ 4泳道的 TaqDNA聚合酶浓度依次为 0.75、1.00、1.25、
1.50U。
Note:TaqDNApolymeraseconcentrationsinlane1-4are0.75,
1.00, 1.25, 1.50Uresp.
图 5　TaqDNA聚合酶浓度对 ISSR扩增的影响
Fig.5　EfectofTaqDNApolymeraseconcentrationonISSR
amplification
(图 6)。结果显示 , Mg2+浓度为 1.0 ～ 2.5mmol/L,均能成功
扩增出条带 ,而当 Mg2+浓度 1.5mmol/L时扩增效率最高 ,条
带最清楚 ,亮度最亮。故试验确定 1.5 mmol/L为最适 Mg2+
浓度。
2.7　ISSR-PCR反应体系的建立　根据以上试验结果 ,笔
者认为 ISSR扩增的反应体系为 25μl,体系中 10×PCRBuf-
er2.5 μl、TaqDNA聚合酶 0.75 U、Mg2+ 1.5 mmol/L、4 ×
dNTP0.2 mmol/L。PCR反应程序为:94 ℃预变性 5 min;94
℃变性 30 s;51 ～53℃退火 30s, 72 ℃延伸 50s, 40个循环;
72 ℃再延伸 7min;4 ℃恒温保存。
3　讨论
ISSR反应体系受诸多因素的影响 ,为了获得重复性高
的 ISSR条带 ,提高分析的准确性 ,有必要对各种影响因子进
行优化。影响 ISSR扩增效果的主要因素 Mg2+适宜范围为
1.0 ～ 2.5 mmol/L, dNTP适宜范围为 0.1 ～ 0.3 mmol/L, Taq
DNA聚合酶适宜用量为 0.75 ～ 1.50 U。在这些范围内均没
有目的片段的消失 ,仅仅是条带明亮度的问题。五节芒 ISSR
注:1～ 4泳道的 Mg2+浓度依次为 1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L。
Note:Mg2+ concentrationsinlane1-4are1.0, 1.5, 2.0, 2.5mmol/ L.
图 6　Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响
Fig.6　EffectofMg2+ concentrationonISSRamplification
分子标记体系的建立还需要在各自适宜范围内微调 ,最终建
立优化体系 。
退火温度和循环次数对该试验影响很大。一般退火温
度低于引物 Tm值的 1 ～ 2℃,这与引物的 Tm值有直接的关
系 。循环次数主要与 DNA浓度有关。在 30 ～ 40次 ,随着次
数的增加条带变得更清晰 ,目的片段更完整 ,但是达到 45次
时 ,出现较多非特异性产物。退火模板 DNA浓度主要影响
扩增条带的明暗度 ,这与王桂娟等试验的结果相同 [ 19] 。选
择 DNA模板浓度 50 ng最佳的模板浓度 ,使条带更清晰
明亮。
其次 , TaqDNA聚合酶等药品的不同生产厂家 、不同生产
批次和仪器的不同型号对试验结果都会有影响 ,因此 ,尽量在
相同条件下进行试验。同时 ,试验熟练程度和操作规范也直接
影响试验的结果 ,一时的疏忽会导致试验的不可重复性。
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(下转第 14077页)
1404337卷 29期　　　　　　　　　　　　　　　　金琳等　五节芒 ISSR-PCR反应体系的优化
W1、W2处理减产 46%和 17%、W3和 W4增产 8%和 0.3%;
和当地历年产量水平相比 , W3、W4和 CK产量可达到当地高
产田水平 , W2可达中产量水平 , W1只能达到中偏下水平。
从相关系数 R看出 ,灌水量对各因素的贡献大小依次为产量
>千粒重 >子粒重 >不孕小穗数 >穗粒数 >小穗数 >子粒
与茎秆比。
表 2　不同灌水量对产量结构及产量的影响
Table2　Theeffectsofdifferentirrigationamountontheyieldstructureandyield
项目Item
小穗数∥个Spikeletnumber
穗粒数∥粒Grainnumberperspike
不孕小穗数∥个Sterilespikeletnumber
千粒重∥g
1 000-grainweight
子粒总重∥gTotalweightofgrains
子粒与茎秆比Ratioofgraintostem
产量　kg/hm2　Yield　
灌水量∥m3/hm2Irrigationamount
W1 12.1 16.7 32 　38.6 　　65.5 　0.95 4 492.5 2 631.4
W2 13.2 24.4 31 42.8 96.6 1.04 5 210.5 3 199.4
W3 14.9 32.0 17 48.0 139.6 1.00 9 051.0 4 006.5
W4 13.2 25.4 25 45.8 116.9 1.15 8 408.5 5 372.9
CK 14.2 26.6 23 46.7 103.1 0.93 8 384.0 4 803.4
R 0.481 0.555 　-0.581 0.771 0.619 0.474 0.842 -
　注:R为产量因素与灌水量的相关系数。
　Note:Rwasthecorrelationcoeficientbetweenyieldfactorsandirigationamount.
3.2.2　灌水量与产量的关系。对表 2进行相关分析后 ,得出
灌溉量与春小麦产量的回归方程:
Y=7×10-4X3 +0.004 4X2 -11.049X+113 56 　 (R2 =
0.894 2) (1)
其中 , Y为春小麦产量 , X为灌水量。从图 3可以看出 ,
随着灌溉量的增加 ,春小麦产量增产幅度非常明显 ,当水量
继续增大时 ,产量呈下降趋势。该试验中灌水量达到 W3处
理时 ,产量达到高峰 ,当灌水量大于此量时 ,产量反而呈下降
趋势 ,因此要提高产量需考虑其他因素 [ 4] 。
图 3　沙漠边缘春小麦灌水量与产量关系
Fig.3　Therelationshipbetweenirrigationamountandyieldof
wheatontheedgeofdesert
4　灌溉制度设计
(1)春小麦最小耗水阶段在从播种期到出苗期 ,这时利用
春季解冻后的底墒 ,即可发芽出苗;从出苗期到拔节期属蹲苗
期 ,这时对土壤水分要求较低。就该实验区情况 ,土壤水分下
限控制到田间持水量的 40% ～45%,头水在拔节前 10 ～15d灌
溉 ,灌溉量在 900～ 1 000 m3 /hm2 ,占总灌水量的 25%。
　　(2)从拔节期到抽穗期 ,既是营养生长与生殖生长的并
进期 ,又是小穗小花的分化期 ,对水分的需求最大。土壤水
分直接关系到有效小穗数和穗粒数的多少 ,应达到田间持水
量的 70%以上 ,所以二水应在孕穗期灌溉 ,灌溉量在 1 100 ～
1 200 m3 /hm2 ,占总灌水量的 30%。
(3)从开花期到灌浆期 ,适宜的水分供应可提高千粒重 ,
最终形成较高的产量 ,这就要求土壤水分占田间持水量的
70%以上。因此三水在开花期灌溉 ,灌溉量为 1 100 ～ 1 200
m3 /hm2 ,占总灌水量的 30%。
(4)从乳熟期到成熟期 ,需水量少 ,叶片生理机能逐渐衰
老 ,适量灌水可防止叶片早衰 、防御高温 、干热风 ,对产量形
成 “补偿作用 ”。四水在乳熟前 3 ～ 4d灌溉 ,灌溉量在 500 ～
600m3 /hm2 ,占灌水量的 15%。
试验证明 ,这一灌溉方案 ,较一般灌水量节水 500
m3 /hm2 ,增产 133 kg/hm2 [ 9] 。
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