全 文 ：收稿日期:2008-09-29
基金项目:农作物基因资源安全保存评价关键技术研究(2006BAD13B
10-08);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项基金
(06-1-06);内蒙古科技厅草业专项(20071923)。
作者简介:蔡丽艳(1980-),女 ,内蒙古扎兰屯市人;在读博士研究生 ,
主要从事牧草育种与种业科学研究。
缘毛雀麦 ISSR-PCR反应体系的建立和优化
蔡丽艳 1 , 　石凤翎 1 , 　李志勇 2 , 　师文贵 2 , 　李鸿雁2 , 　游国卿 1 , 　马廷兰 3 , 　戴　军 4
(1.内蒙古农业大学生态环境学院 , 　内蒙古 呼和浩特 010019;
2.中国农业科学院草原研究所 , 　内蒙古 呼和浩特 010010;
3.乌兰察布市集宁区水务局 , 　内蒙古 集宁 012000;
4.乌兰察布市察右中旗扶贫办公室 , 　内蒙古 察右中旗 013550)
摘要:以缘毛雀麦基因组 DNA为模板 ,对 ISSR反应体系中的一些重要参数进行探索和优化试验 ,初步建立了一套雀麦
属牧草 ISSR分析的优化反应体系及反应程序。在 20μl反应体系中 , 含有 2.0mmol/LMg2+、2.0UTaq酶 、0.3mmol/L
dNTP、0.5μmol/L引物和 30ng模板 DNA。反应程序:第 1个循环 , 基因组 DNA经 94℃预变性 5min;45个循环为 94℃
变性 45s, 54℃退火 60s, 72℃延伸 90s;最后 1个循环完成后 ,在 72℃下延伸 7min。
关键词:　缘毛雀麦;基因组 DNA;ISSR;反应体系
中图分类号:　S813.3;　S543+.8　　　文献标志码:　A　　　文章编号:　1001-4705(2009)01-0003-04
StudiesonOptimizationofISSR-PCRReactionSystemforBromusciliatusL.
CAILi-yan1 , SHIFeng-ling1 , LIZhi-yong2 , SHIWei-gui2 , LIHong-yan2 ,
YOUGuo-qing1 , MATing-lan3 , DAIJun
(1.ColegeofEcologyEnvironmentalScience, InnerMongolia
AgriculturalUniversity, Hohhot010019, InnerMongolia, China;
2.TheGrasslandResearchInstituteoftheChineseAcademy
ofAgriculturalSciences, Hohhot010010, InnerMongolia, China;
3.WaterBureauinJiningDistrictofWulanbuchaCity, Jining012000 , InnerMongolia, China;
4.Povertyreliefofice, ChayouzhongBanner, WulanchabuCity, Chayouzhong013550, InnerMongolia, China)
Abstract:Inthispaper, themainindicesofISSRwerestudiedtakingthegenomicDNAextractedfromBromus
ciliatusL.astemplate.TheoptimumreactionsystemandreactionprocessofISSRwerefound.Theresults
showedthatthereactionsystemwas20μl.Itincluded2.0 mmol/LMg2+, 2.0 UTapenzyme, 0.3mmol/L
dNTP, 0.5μmol/Lprimer, 30ngDNAtemplate.Thereactionprogramwasdevisedfor5 minutesat94℃ in
thefirstcircle, 45secondsat94℃ for45cycles, 54℃ for60seconds, 72℃ for90seconds, and72℃ for7
minutesinthefinalcycle.
Keywords:　BromusciliatusL.;genomicDNA;ISSR;reactionsystem
　　缘毛雀麦 (BromusciliatusL.)草质柔嫩 ,营养丰
富 ,适口性好 ,产量高 、叶量丰富 、适应性强 ,是一种放
牧和打草兼用的优良禾本科牧草。以缘毛雀麦基因组
DNA为模板 ,进行 ISSR-PCR反应体系优化研究 ,旨在
找到适合雀麦属植物的 ISSR-PCR反应体系 ,为雀麦
属植物分子水平的遗传多样性研究等奠定基础 。
ISSR(Inter-simplesequencerepeat), 即简单重复
序列区间 ,是由 Zietkiewicz等 [ 1]在 1994年创建的 ,它
是利用在基因组中常出现的简单重复序列作为引物 ,
由 1 ～ 4个碱基组成的串联重复和 1 ～ 2个非重复的锚
定碱基组成 ,锚定碱基避免了引物在与 DNA模板结合
时在基因组上的滑动 ,这样就提高了 PCR的专一性。
ISSR是由 SSR发展而来的一种新的分子标记 ,结合了
SSR和 RAPD的优点 ,操作简便 、成本较低 、重复性高 、
多态性好 、其引物设计比较简单 ,不需要知道简单重复
序列两端的碱基序列 [ 2 ～ 4] 。 ISSR分子标记已在多种
动植物的种质鉴定 、遗传作图 、基因定位 、遗传多样性
等研究方面得到应用 [ 5 ～ 9] 。虽然 ISSR有诸多优点 ,但
·3·
研究报告　　蔡丽艳 等:缘毛雀麦 ISSR-PCR反应体系的建立和优化
ISSR分子标记技术基于 PCR反应 ,受到多种反应条件
的影响 ,不同物种对反应的要求也存在差异 ,因此在应
用 ISSR分标记技术时应首先对其反应条件进行优
化 [ 10 ～ 13] 。本试验采用正交试验 , 设置 Mg2+、dNTP、
Taq酶 、引物及 DNA模板 5因素 4水平 ,对缘毛雀麦
ISSR-PCR反应体系进行优化。
1　材料与方法
1.1　试验材料
材料为 2006年采于内蒙古农业大学牧草试验基
地的缘毛雀麦种子。将其置于 25℃黑暗条件下发芽 ,
培育 7d后得到黄化苗 ,然后将 15株(约 0.5g)黄化
苗分成一组放于 -70℃超低温冰柜中保存备用。
1.2　主要试剂和仪器
Taq酶 、dNTP、10 ×PCRbufer、Mg2+、DNAMarker
(共 10条带 ,分别是:200、400、600、800、1 000、1 200、
1 400、1 600、1 800、2 000、2 200和 4 000bp),均购自天
根公司 。ISSR引物由上海生物工程有限公司合成 ,引
物序列参照加拿大大不列颠哥伦比亚大学(UBC)公
布的 ISSR-PCR引物序列。其余药品均为国产分析
纯 。PCR仪为 Biometra公司生产的 TGRADIET型
PCR仪 ,凝胶成像系统为 BIORADGleDo-XR型 。
1.3　基因组 DNA提取与检测
采用改进的 CTAB法 [ 14] ,参考姜静的方法提取植
物基因组 DNA,并针对缘毛雀麦进行适当调整。所提
取 DNA经 0.8%的琼脂糖凝胶电泳(0.5 ×TBE)检
测;用紫外分光光度仪检测其浓度 ,将原 DNA溶液浓
度用 1×TE稀释至 20ng/μl,置于 -20℃冰箱中备用。
1.4　退火温度的设定
扩增反应条件初设为 20μlPCR反应体系中含有
1×bufer;dNTP:250μmol/L;Taq酶:1.0U;引物:0.25
μmol/L;Mg2+:2.5mmol/L;DNA模板:2.0ng/L;不足
体积用无菌双蒸水补足 。扩增程序为:94 ℃预变性
5min后 ,进行 45个循环的 94 ℃变性 45s, 52℃复性
60s, 72℃延伸 1.5min;72℃延伸 7 min, 15 ℃保存。
扩增反应结束后 ,每管各加入 6×溴酚蓝 4μl,离心混
匀后 ,取 16μl扩增产物在 1.5%琼脂糖凝胶上电泳 ,
凝胶中含 0.05%的溴化乙锭(EB),电极缓冲液为 0.5
×TBE,电压为 3V/cm,电泳时间为 90min,结束后在
凝胶成像系统仪上观察并照相记录。
在初设的扩增体系和扩增程序下 ,进行不同退火
温度的处理 。T1 ～ T6的温度分别为 47.9、49.0、51.8、
54.4、57.5℃和 59.7℃共 6个梯度 ,分析缘毛雀麦在
引物 UBC812参与下 PCR扩增的适宜退火温度。
1.5　ISSR-PCR反应体系的正交试验设计
采用 L16(45)正交试验表 ,分别设置 Mg2 +、dNTP、
Taq酶 、引物及 DNA模板浓度 5因素 4水平(表 1),对
16个组合(表 2)的反应体系进行筛选 。制备总体积
为 20μl的 PCR反应体系 ,除表中的几个因素外 ,每管
中还含有 1×PCRbufer,不足体积用无菌双蒸水补
足 。引物选用 UBC812, 其引物序列 (5′-3′)为
(GA)8 A。
表 1　ISSR-PCR反应体系的因素-水平
水平 Mg2+(mmol/L) Taq(U/20μl) dNTP(mmol/l) 引物(μmol/L) DNA(ng/20μl)
1 1.5 0.5 0.1 0.25 30
2 2.0 1.0 0.2 0.50 40
3 2.5 1.5 0.3 0.75 50
4 3.0 2.0 0.4 1.00 60
表 2　ISSR-PCR正交试验设表 [ L16(45)]
组合 Mg2+(mmol/L)
Taq
(U/20μl)
dNTP
(mmol/L)
引物
(μmol/L)
DNA
(ng/20μl)
1 1.5 0.5 0.1 0.25 30
2 1.5 1.0 0.2 0.50 40
3 1.5 1.5 0.3 0.75 50
4 1.5 2.0 0.4 1.00 60
5 2.0 0.5 0.2 0.75 60
6 2.0 1.0 0.1 1.0 50
7 2.0 1.5 0.4 0.25 40
8 2.0 2.0 0.3 0.50 30
9 2.5 0.5 0.3 1.0 40
10 2.5 1.0 0.4 0.75 30
11 2.5 1.5 0.1 0.50 60
12 2.5 2.0 0.2 0.25 50
13 3.0 0.5 0.4 0.50 50
14 3.0 1.0 0.3 0.25 60
15 3.0 1.5 0.2 1.0 30
16 3.0 2.0 0.1 0.75 40
1.6　优化反应体系的验证
以雀麦属其它植物为材料 ,采用优化后的 ISSR-
PCR扩增反应体系 ,进行 PCR扩增反应 ,以验证该反
应体系的稳定性 。
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA的提取与检验
采用改进 CTAB法获得的总基因组 DNA,经检测
OD260 /OD280在 1.800 ～ 1.906之间 ,平均为 1.853。表
明应用该方法提取的 DNA纯度较高。且经多次试验
表明 , DNA纯度比较稳定 , 能满足 ISSR-PCR扩增的
要求。
2.2　退火温度的确定
从图 1可以看出 ,退火温度较低时(47.9 ～ 51.8
℃),背景较深 ,杂带较多;当退火温度达到 54.4℃时 ,
·4·
第 28卷　第 1期　2009年 1月　　　　　　　 　　　　种　子　(Seed)　　　　　　　　　　　　Vol.28　No.1　Jan.　2009
图 2　不同反应体系下 ISSR-PCR扩增结果图 1　不同退火温度下的扩增结果
图 3　优化后反应体系下雀麦属不同植物 ISSR-PCR的扩增结果
扩增的特异性升高 ,扩增的杂带减少 ,背景弥散减弱;
在 54.4℃以上没有出现扩增产物 。由此推断缘毛雀
麦 ISSR-PCR在 UBC812引物下扩增适宜的退火温度
为 54℃。此结果比理论退火温度(52℃)稍高 ,这与
席嘉宾等的研究结果相似 [ 11] ,因退火温度与引物本身
的序列 、模板 DNA序列以及试验所用 PCR仪不同
有关。
2.3　Mg2 +浓度对 ISSR扩增结果的影响
试验结果(图 2)表明 , PCR扩增结果受 Mg2 +浓度
影响较大。当 Mg2+浓度为 1.5 mmol/L时 ,虽然有谱
带出现 ,但扩增出的谱带较少 ,且扩增产物不稳定;当
浓度增加为 2.0mmol/L时 ,谱带亮度增加 ,背景清晰 ,
能得到相对清晰稳定的谱带;当浓度为 2.5mmol/L和
3.0mmol/L时 ,谱带的稳定性减弱 ,杂代的数量明显
增多且背景干扰严重 。 Mg2+浓度过大还会引起非特
异性产物的扩增。由此推断该反应体系适宜的 Mg2+
浓度为 2.0mmol/L。
PCR扩增结果受 Mg2+浓度影响较大。原因在于
Taq酶是 Mg2+依赖性酶 ,对 Mg2+浓度非常敏感[ 12, 13] 。
引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳
离子的影响 。特别是其中的 Mg2+浓度能直接影响
PCR反应的特异性和扩增片断的产率 [ 14] 。
2.4　不同反应体系下 ISSR-PCR扩增结果
从正交试验设计 16个组合的 ISSR-PCR扩增反应
体系的结果(图 2)可以看出 ,不同组合反应体系的扩
增结果存在着较大差异。
在 Mg2+浓度相同的情况下 ,随着其它组分浓度的
逐渐增加 ,谱带亮度依次减弱(第 1、2、 3、4组合)。
Taq酶浓度相同时 , dNTP含量逐渐增加谱带亮度依次
增加(1、5、9、13组合), dNTP是 PCR的原料 ,浓度相
对较低时会导致扩增带产率低 ,适当增加其浓度时可
使产率提高 。而当浓度过高(第 13组合)时则会产生
错误渗入 ,导致背景不清晰 。第 4和第 14组合未扩增
出相对清晰的谱带。可能是由于 DNA模板量过高 ,所
含杂质较其它 DNA模板含量少的组合多 ,导致反应体
系受污染。
根据琼脂糖电泳谱带的强弱和背景干扰程度及杂
带的多少进行 PCR扩增结果分析 ,在 16组反应体系
中 ,第 8组合的反应体系显示出条带清晰 、亮度较高 、
杂带较少 ,因此说明由 2.0mmol/LMg2+、2.0 UTaq
酶 、0.3mmol/LdNTP、0.5μmol/L引物和 30 ng模板
DNA的组合为适宜的反应体系 。
·5·
研究报告　　蔡丽艳 等:缘毛雀麦 ISSR-PCR反应体系的建立和优化
2.5　优化体系验证
利用该反应体系对雀麦属其它植物进行 ISSR-
PCR扩增(图 3),结果表明 ,该优化体系所产生的ISSR
标记位点清晰 ,反应系统稳定 ,具有较好的重复性 ,可
用于雀麦属植物的遗传多样性分析等 。
3　小　结
利用正交试验设计对影响 ISSR-PCR反应条件的
主要因素进行筛选 ,获得了稳定适宜的反应体系 ,较快
地找到了最优的组合 。适合缘毛雀麦的 ISSR扩增条
件为在 20μl反应体系中 ,含有 2.0mmol/LMg2 +、2.0
UTaq酶 、0.3mmol/LdNTP、0.5μmol/L引物和 30ng
模板 DNA。反应程序为第 1个循环基因组 DNA经 94
℃预变性 5min;45个循环为 94℃变性 45s, 54℃退火
60s, 72℃延伸 90s;最后 1个循环完成后 ,在 72℃下
延伸 7min。正交试验方法避免了单一因素试验结果
的不足 ,且节省了试验时间 ,同时还可避免试剂等的
浪费。
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(上接第 2页)
　　卫星搭载后飞行苗的发芽势分别比地面对照高
6.2%(品系 1)、0%(品系 2)和 1.1%(品系 4), 3个品
系差异均未达到显著水平(p>0.05)(见表 2)。卫星
搭载后飞行苗的发芽指数分别比地面对照低 2.9%
(品系 1)和 1.7%(品系 4),品系 2比对照高 1.3%, 3
个品系差异均未达到显著水平(p>0.05)(见表 2)。
3　讨论与结论
3.1　常规的物理诱变如 γ射线 、粒子注入等 ,处理后
种子的发芽率都会显著降低。但是空间飞行种子的发
芽率基本在 90%以上 ,其发芽率与地面对照无显著差
异 ,不同品系间的结果基本一致。结合其它的相关报
道 [ 4, 5] ,说明空间诱变对搭载种子损伤轻 ,不易产生致
死突变 ,搭载后绝大多数种子都能正常发芽。
3.2　空间搭载对种苗生长有显著诱变效应 ,具体表现
为正效应和负效应。正效应如苗重的增加(品系 1与
品系 4)或芽长的增加;负效应如平均苗重的减少(品
系 2)、根长的降低等方面 ,其中以正效应为主。这说
明空间搭载对飞行种苗有较好的正诱变效应 ,促进种
苗的生长。
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第 28卷　第 1期　2009年 1月　　　　　　　 　　　　种　子　(Seed)　　　　　　　　　　　　Vol.28　No.1　Jan.　2009