全 文 ：收稿日期：２０１５－１１－２８
基金项目：广西林业科技项目（编号：桂林科字［２０１２］第２６号）；广西科技攻关项目（编号：桂科能１５９８０２５－４９）；桂林市科技攻关项目（编号：
２０１３０４１４）。
作者简介：谢伟玲（１９９０—），女，广西陆川人；在读硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学；Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｗｌｉｎｇ＿２０２５＠１６３．ｃｏｍ。
通讯作者：柴胜丰（１９８０—），男，湖南益阳人；博士，副研究员，主要从事植物保护生物学和药用植物栽培等方面的研究工作；Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｆｃｈａｉ＠１６３．ｃｏｍ。
黄枝油杉ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
谢伟玲１，２，　柴胜丰１，　蒋运生１，　唐健民１，　邹　蓉１，　韦　霄１
（１．广西喀斯特植物保育与恢复生态学重点实验室，广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，　桂林５４１００６；
２．广西师范大学生命科学院，　桂林５４１００４）
摘　要：先运用正交设计进行初步筛选，再用单因素设计逐一优化对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果有影响的 Ｍｇ２＋、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚
合酶、ｄＮＴＰ、引物、模板ＤＮＡ、循环次数及退火温度。建立了黄枝油杉的最佳反应体系和程序，即２５μＬ体系中含２．０
ｍｍｏｌ／Ｌ的 Ｍｇ２＋、１．５ＵＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶、０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ、１．０μｍｏｌ／Ｌ的引物、３０ｎｇ的模板ＤＮＡ以及２．５μＬ
１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ，其余的用灭菌的ｄｄＨ２Ｏ补够２５μＬ。扩增程序：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，４８～５６℃（不同的
引物，其退火温度不同，根据具体引物而定）退火４５ｓ，７２℃延伸９０ｓ，以上３个步骤循环５０次；最后７２℃延伸７ｍｉｎ；扩
增产物放在４℃冰箱中保存。该体系和程序稳定性良好，结果可靠，可用于黄枝油杉遗传多样性分析。
关键词：　黄枝油杉；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ；正交设计；单因素试验
ＤＯＩ编码：　１０．１６５９０／ｊ．ｃｎｋｉ．１００１－４７０５．２０１６．０６．０１７
中图分类号：　Ｓ　７９１．１５　　　文献标志码：　Ａ　　　文章编号：　１００１－４７０５（２０１６）０６－００１７－０５
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ
ｆｏｒ　Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ　ｃａｌｃａｒｅａ　Ｃｈｅｎｇ　ｅｔ　Ｌ．Ｋ．Ｆｕ
ＸＩＥ　Ｗｅｉｌｉｎｇ１，２，ＣＨＡＩ　Ｓｈｅｎｇｆｅｎｇ１，ＪＩＡＮＧ　Ｙｕｎｓｈｅｎｇ１，ＴＡＮＧ　Ｊｉａｎｍｉｎ１，ＺＯＵ　Ｒｏｎｇ１，ＷＥＩ　Ｘｉａｏ１
（１．Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ｉｎ　Ｋａｒｓｔ　Ｔｅｒｒａｉｎ，
Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｏｔａｎｙ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｚｈｕａｎｇ　Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　Ｒｅｇｉｏｎ　ａｎｄ
ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｌｉｎ　５４１００６，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｌｉｎ　５４１００４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ　ｓｅｖｅｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｍｇ２＋，Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｄＮＴＰ，ｐｒｉｍｅｒｓ，ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ，
ｃｙｃｌｅ　ｔｉｍｅｓ　ａｎｄ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ　ｃａｌｃａｒｅａ　Ｃｈｅｎｇ　ｅｔ
Ｌ．Ｋ．Ｆｕ　ａｓ　ｆｏｌｏｗｓ：２５μＬ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ　ｏｆ　２．０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ
２＋，１．５ＵＴａｑ　ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ，１．０μｍｏｌ／Ｌ　ｐｒｉｍｅｒ，３０ｎｇ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＤＮＡ　ａｎｄ　２．５μＬ　１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ，ｔｈｅ　ｒｅｓｔ　ｗａｓ　ｆｉｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ　ｄｄＨ２Ｏ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｗａｓ　ｐｒｅ－ｄｅｎａｔ－
ｕｒａｔｉｏｎ　ａｔ　９４℃ｆｏｒ　５ｍｉｎ；ｎｅｘｔ　ｔｏ　５０ｃｙｃｌｅ：ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　ａｔ　９４℃ｆｏｒ　３０ｓ，ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ａｔ　４８－５６℃
（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｉｍｅｒ　ｈａｖｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）ｆｏｒ　４５ｓ，ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ａｔ　７２℃ｆｏｒ　９０ｓ；ａｎｄ
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ａｔ　７２℃ｆｏｒ　７ｍｉｎ；ｆｉｎａｌｙ　ｓｔｏｒｅｄ　ａｔ　４℃．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｎｄ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｉｓ　ｓｔａｂｌｅ　ａｎｄ　ｃｒｅｄｉｂｌｅ，ａｎｄ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ　Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ　ｃａｌｃａｒｅａ　Ｃｈｅｎｇ　ｅｔ　Ｌ．Ｋ．Ｆｕ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ　ｃａｌｃａｒｅａ　Ｃｈｅｎｇ　ｅｔ　Ｌ．Ｋ．Ｆｕ；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ；ｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒ　ｔｅｓｔ
　　黄枝油杉（Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ　ｃａｌｃａｒｅａ　Ｃｈｅｎｇ　ｅｔ　Ｌ．Ｋ．Ｆｕ）
系松科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）油杉属（Ｋｅｔｅｌｅｅｒｉａ）常绿乔木［１］，是
我国特有的珍稀濒危树种、国家三级保护植物［２］，主要
分布于我国贵州南部、广西北部和湖南江永县等地。
因其树形美观、耐干旱，可用于庭院和石山绿化；树干
通直、木材坚硬，可用于造船、建筑和家具等［３］，具有较
·７１·
研究报告　　谢伟玲 等：黄枝油杉ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
高的研究价值和实用性。
　　ＩＳＳＲ是基于ＰＣＲ技术、以简单重复序列为引物
的一种分子标记技术，１９９４年由Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等［４］提
出，具有多态性水平高、产物特异性强、ＤＮＡ用量少以
及稳定性好等优点。已广泛应用于构建遗传图谱、植
物品种鉴定、遗传多样性和亲缘关系以及基因定位等
方面的研究［５－７］。
虽然ＩＳＳＲ分子标记技术原理简单，但不同的物
种适合的反应条件不同。因此，在对黄枝油杉进行
ＩＳＳＲ分析之前，首先要优化ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应条件和程
序。本试验先运用正交设计进行初步筛选，再用单因
素设计逐一优化对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ 扩增效果有影响的
Ｍｇ２＋、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、引物、模板ＤＮＡ、循
环次数及退火温度。建立了黄枝油杉的最佳反应体系
和程序，为进一步研究黄枝油杉种群的遗传多样性奠
定了基础。
１　材料与方法
１．１　材　料
２０１４年９月至１２月，分别在桂林临桂县沉桥村
（Ｌ）、桂林恭城县三江乡（Ｇ）、贺州富川县栎尾村（Ｆ）、
柳州融水县都木（Ｒ）、河池南丹县里湖乡（Ｎ）、贵州平
塘县者密镇（Ｐ）、贵州独山县尧棒乡（Ｄ）共７个黄枝油
杉分布地采集生长良好的、健康的黄枝油杉叶片，硅胶
干燥保存。样品经广西植物研究所蒋运生研究员
鉴定。
１．２　试剂与仪器
　　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ 引物（引物８５５序列为：ＡＣＡ　ＣＡＣ
ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＹＴ，Ｙ＝Ｃ，Ｔ）、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶、１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ、ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓ（生工
生物工程（上海）股份有限公司）；ＰＣＲ仪（美国ＢＩＯ－
ＲＡＤ伯乐公司，Ｍｏｄｅｌ：ＰＴＣ－２００）；ＮａｎｏＤｒｏｐ　２０００ｃ
超微量分光光度计（赛默飞世尔科技）；ＣＤＹＹ－６Ｃ型
电泳仪（北京市六一仪器厂）；ＵＶＰ凝胶成像系统；离
心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；ＤＹＣＰ－３４型电泳
槽（北京市六一仪器厂）。
１．３　方　法
１．３．１　黄枝油杉总ＤＮＡ的提取
采用ＣＴＡＢ法提取黄枝油杉的总ＤＮＡ，但在水
浴前用－２０℃预冷的丙酮洗２次［８］。用浓度为０．８％
的琼脂糖凝胶电泳检验ＤＮＡ的质量和完整性，ＤＮＡ
的纯度和浓度用ＮａｎｏＤｒｏｐ　２０００ｃ超微量分光光度计
检测，存储在－２０℃冰箱备用。
１．３．２　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系正交试验
用正交试验设计（Ｌ１６（４５））来初步确定各因素之
间扩增效果较好的水平组合，研究的５个因素分别为
Ｍｇ２＋、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、引物、模板ＤＮＡ，每
个因素设定４个梯度的浓度，具体见表１、表２。除表
中的５个因素及其不同的浓度外，每个体系还含有２．５
μＬ　１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ，其余的用灭菌的ｄｄＨ２Ｏ补够２５
μＬ，每个处理设置３次重复，选用引物８５５（序列为
ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＣＹＴ，Ｙ＝Ｃ，Ｔ）。
预扩增程序为９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，
５０℃退火４５ｓ，７２℃延伸９０ｓ，以上３个步骤循环４０
次；最后７２℃延伸７ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物用浓度为
１．５％的琼脂糖凝胶电泳１～１．５ｈ，溴化乙锭（０．５μｇ／
ｍＬ）染色２０ｍｉｎ，用ＵＶＰ凝胶成像系统拍照保存。
表１　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系正交试验的各因素与水平
水平
因　　素
ｄＮＴＰ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
引物
（μｍｏｌ／Ｌ）
Ｍｇ２＋
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｔａｑ　ＤＮＡ
聚合酶
（Ｕ／２５μＬ）
ＤＮＡ
（ｎｇ）
１　 ０．２５　 １．２　 ２．５　 ２．０　 ７０
２　 ０．２０　 １．０　 ２．０　 １．５　 ５０
３　 ０．１５　 ０．８　 １．５　 １．０　 ３０
４　 ０．１０　 ０．６　 １．０　 ０．５　 １０
表２　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验Ｌ１６（４５）
编号
因　　素
ｄＮＴＰ
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
引物
（μｍｏｌ／Ｌ）
Ｍｇ２＋
（ｍｍｏｌ／Ｌ）
Ｔａｑ　ＤＮＡ
聚合酶
（Ｕ／２５μＬ）
ＤＮＡ
（ｎｇ）
１６　 ０．２５　 １．２　 １．０　 １．５　 ３０
１５　 ０．２５　 １．０　 １．５　 ２．０　 １０
１４　 ０．２５　 ０．８　 ２．０　 ０．５　 ７０
１３　 ０．２５　 ０．６　 ２．５　 １．０　 ５０
１２　 ０．２０　 １．２　 １．５　 ０．５　 ５０
１１　 ０．２０　 １．０　 １．０　 １．０　 ７０
１０　 ０．２０　 ０．８　 ２．５　 １．５　 １０
９　 ０．２０　 ０．６　 ２．０　 ２．０　 ３０
８　 ０．１５　 １．２　 ２．０　 １．０　 １０
７　 ０．１５　 １．０　 ２．５　 ０．５　 ３０
６　 ０．１５　 ０．８　 １．０　 ２．０　 ５０
５　 ０．１５　 ０．６　 １．５　 １．５　 ７０
４　 ０．１０　 １．２　 ２．５　 ２．０　 ７０
３　 ０．１０　 １．０　 ２．０　 １．５　 ５０
２　 ０．１０　 ０．８　 １．５　 １．０　 ３０
１　 ０．１０　 ０．６　 １．０　 ０．５　 １０
１．３．３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系单因素试验
根据正交试验的结果初步选出扩增条带最清晰的
组合进行单因素试验，以该组合为基础，改变其中一个
因素的浓度（改变的浓度采用相应因素设定的６个梯
·８１·
第３５卷　第６期　２０１６年６月　　　　　　　　 　　　　种　子　（Ｓｅｅｄ）　　　　　　 　　　　　Ｖｏｌ．３５　Ｎｏ．６　Ｊｕｎ．　２０１６
度浓度），而其他因素及其浓度不变，每一个因素确定
最佳浓度后，以该最佳浓度进行下一步研究，直到所有
因素的最佳浓度被确定。每个因素设定６个梯度浓
度，Ｍｇ２＋浓度为３．０，２．５，２．０，１．５，１．０，０．５ｍｍｏｌ／Ｌ；
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶浓度为２．５，２．０，１．５，１．０，０．５，０．２５Ｕ／
２５μＬ；ｄＮＴＰ 为０．３０，０．２５，０．２０，０．１５，０．１０，０．０５
ｍｍｏｌ／Ｌ；引物为１．４，１．２，１．０，０．８，０．６，０．４μｍｏｌ／Ｌ；模
板ＤＮＡ为９０，７０，５０，３０，１０，５ｎｇ。每个处理至少重
复２次。
１．３．４　优化ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应程序
通过正交试验和单因素试验确定反应体系后，优
化退火温度及循环次数。退火温度的设定范围为引物
的理论退火温度的正负５℃，如（５１±５）℃，ＰＣＲ仪便
会自动形成１２个温度：５６．０，５５．７，５５．０，５４．０，５２．８，
５１．６，５０．４，４９．２，４８．０，４７．０，４６．３，４６．０℃；循环次数设
为５０、４５、４０、３５、３０、２５次。以上每个处理至少重复
２次。
１．３．５　验证反应体系和程序
从黄枝油杉的每个居群中随机选取２个个体的
ＤＮＡ样品，用已确定的反应体系及程序进行扩增，检
验扩增效果的好坏及其稳定性。
２　结果与分析
２．１　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验结果
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验结果见图１。如图１所示，组
合１、２、５、６、１３、１６扩增条带少，且强度弱；组合３、４、７
扩增出来的条带强度弱，而且背景模糊；虽然组合８、
９、１０、１２、１４、１５的条带较多，但强度弱，而且背景模
糊，弥散难辨；组合１１扩增出来的条带多且效果好，背
景清晰，条带清晰可辨。故选用组合１１进行下一步研
究。即２５μＬ的反应体系中含有 Ｍｇ
２＋ １．０ｍｍｏｌ／Ｌ、
Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶１．０Ｕ／２５μＬ、ｄＮＴＰ　０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、引
物１．０μｍｏｌ／Ｌ、模板ＤＮＡ　７０ｎｇ。
注：１～１６对应表２中的处理编号。
图１　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交试验结果
２．２　Ｍｇ２＋浓度与ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的关系
　　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶在ＰＣＲ反应中的作用可直接受
Ｍｇ２＋浓度的影响，而且非常敏感［９］。如图２所示，组
合１～３（Ｍｇ２＋０．５～１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）几乎没有扩增产物；
随着 Ｍｇ２＋浓度升高，条带数量和清晰度先是增加，后
下降；当 Ｍｇ２＋的浓度为２．０ｍｍｏｌ／Ｌ时扩增出来的条
带最多，也最清晰，扩增效果最好，故选择２．０ｍｍｏｌ／Ｌ
的 Ｍｇ２＋浓度进行下一步研究。
　注：Ｍ为ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓ；１～６代表的 Ｍｇ２＋浓度分别为
０．５，１．０，１．５，２．０，２．５，３．０ｍｍｏｌ／Ｌ。
图２　不同 Ｍｇ２＋浓度的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
２．３　ｄＮＴＰ浓度与ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的关系
底物ｄＮＴＰ浓度过高，会导致聚合酶错误掺入，
浓度过低，产物合成率低［１０］。如图３所示，每个处理
都可以扩增出条带，但ｄＮＴＰ浓度过高或过低的扩增
条带数量少而且强度弱，随着ｄＮＴＰ浓度的逐渐升
高，条带的清晰程度与数量呈现先升后降的趋势。浓
度为０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ时效果最好，故选择０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ
为ｄＮＴＰ的最佳浓度。
注：Ｍ为ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓ；１～６代表的ｄＮＴＰ浓度分别为
０．０５，０．１０，０．１５，０．２０，０．２５，０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ。
图３　不同ｄＮＴＰ浓度的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
２．４　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量与ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的
关系
　　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量过多，容易扩增出非特异
性产物，而且成本高；但用量过少又会导致产物合成效
率降低［１０］。如图４所示，２５μＬ体系中，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚
合酶用量为０．２５～１．０Ｕ时，几乎没有扩增产物；Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶用量大于２．０Ｕ时，扩增条带少，背景模
糊；故选择１．５ＵＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶为最佳用量。
２．５　引物浓度与ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的关系
　　引物浓度过低，扩增产物少；而浓度过高时，不仅
成本较高，而且容易形成引物二聚体［１１］。如图５所
·９１·
研究报告　　谢伟玲 等：黄枝油杉ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
注：Ｍ为ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓ；１～６代表的循环次数分别为２５、３０、３５、４０、４５、５０次。
图７　不同循环次数的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
示，每个处理均有扩增产物，引物浓度逐渐增加，扩增
条带的数目先逐渐增加后减少。引物浓度为０．４，０．６，
０．８，１．４μｍｏｌ／Ｌ时，扩增条带少；当引物的浓度为１．０，
１．２μｍｏｌ／Ｌ时，虽然扩增出来的条带数目相同，但前
者的条带和背景都较后者的清晰。故而选择１．０
μｍｏｌ／Ｌ的引物浓度继续下一步研究。
注：Ｍ为ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓ；１～６代表的Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶浓度分别为
０．２５，０．５，１．０，１．５，２．０，２．５Ｕ／２５μＬ。
图４　不同Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶用量的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
注：Ｍ为ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓ；１～６代表的引物浓度分别为
０．４，０．６，０．８，１．０，１．２，１．４μｍｏｌ／Ｌ。
图５　不同引物浓度的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
注：Ｍ为ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓ；１～６代表的模板ＤＮＡ浓度分别为
５，１０，３０，５０，７０，９０ｎｇ／２５μＬ。
图６　不同模板ＤＮＡ浓度的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
２．６　模板ＤＮＡ浓度与ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的关系
　　过低含量的模板ＤＮＡ，没有扩增产物或扩增产物
不稳定；模板含量过高，非特异性产物合成率增加［１２］。
如图６所示，除１０ｎｇ／２５μＬ没有扩增产物外，其余处
理均有扩增产物。处理１、处理５、处理６（５，７０，９０ｎｇ／
２５μＬ）扩增条带较少，强度较弱；处理３、处理４（３０，５０
ｎｇ／２５μＬ）扩增效果相当，选择３０ｎｇ／２５μＬ为模板
ＤＮＡ最佳浓度。
２．７　循环次数与ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的关系
　　如图７所示，ＰＣＲ扩增反应循环２５次时，没有扩增
产物或扩增产物的量很少，导致检测不出来；当循环次
数为３０、３５、４０、４５时，扩增产物的量较少，而且扩增条
带少，强度弱；当循环次数为５０次时，扩增产物的量足
够，扩增条带数目较多，故选择５０次为最佳循环次数。
２．８　引物的退火温度与ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的关系
　　如图８所示，过低或过高的引物退火温度扩增出
来的条带数量都较少，而且条带强度弱，背景模糊；退
火温度为５０．４℃时，扩增条带最多，主带明显，副带清
晰。故选择５０．４℃为该引物的最适退火温度。同样
地，通过温度梯度筛选的方法确定其他引物的最佳退
火温度。
注：Ｍ为ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓ；１～１２代表的退火温度分别为４６．０，４６．３，
４７．０，４８．０，４９．２，５０．４，５１．６，５２．８，５４．０，５５．０，５５．７，５６．０℃。
图８　引物的不同退火温度的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果
２．９　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的验证
从黄枝油杉７个居群分别随机选取２个个体的
ＤＮＡ样品对优化获得的最佳反应体系及扩增程序进
行检验，结果见图９。由图９可见：除贵州平塘县者密
镇居群（Ｐ）没有扩增出条带，其余各居群均有扩增产
·０２·
第３５卷　第６期　２０１６年６月　　　　　　　　 　　　　种　子　（Ｓｅｅｄ）　　　　　　 　　　　　Ｖｏｌ．３５　Ｎｏ．６　Ｊｕｎ．　２０１６
物。没有扩增产物的部分样品，可能的原因是加入反
应体系的ＤＮＡ很少或者没有，导致扩增产物很少，检
测不出来，或者没有扩增产物。有扩增产物的样品，扩
增效果较好，条带数目、清晰度均较佳，可见建立的反
应体系和扩增程序不仅稳定，还具有较高的检测能力。
注：Ｍ为ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｓ；Ｄ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、Ｆ、Ｐ、Ｇ
分别代表黄枝油杉的不同居群。
图９　不同居群的黄枝油杉样品扩增效果
３　讨　论
虽然ＩＳＳＲ分子标记具有多态性水平高、产物特
异性强、稳定性好、ＤＮＡ用量少等优点，但是ＩＳＳＲ扩
增易受Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、Ｍｇ２＋、引物、退火温度等因
素的影响，不同的物种，各组分所需的浓度也不同。因
此，在对一个物种进行遗传多样性分析前有必要对反
应体系和程序进行优化，以保证扩增出来的条带清晰、
重复性好。前人大多数是采用单一的单因素设计法或
正交设计法来优化ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系。精细地研究
各因素的影响是单因素设计的优点，但不能分析各因
素之间的相互作用；快速地分析各因素之间的相互作
用是正交设计法的一大优点，但其处理水平有限，而且
结果不够精细［１３－１５］，而且工作量大。本研究将这２种
方法结合起来使用，恰能互补，既可以精细地研究各因
素的影响，还考虑到了各因素之间的相互作用，使结果
更精确、更可靠，从而快速准确地建立了黄枝油杉
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，即２５μＬ体系中含２．０ｍｍｏｌ／Ｌ
的 Ｍｇ２＋、１．５ＵＴａｑ　ＤＮＡ聚合酶、０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ 的
ｄＮＴＰ、１．０μｍｏｌ／Ｌ的引物、３０ｎｇ的模板 ＤＮＡ以及
２．５μＬ　１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ，其余的用灭菌的ｄｄＨ２Ｏ补够
２５μＬ。
　　此外，ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果还受扩增程序中的循
环次数和引物的退火温度的影响。在一定范围内，循
环次数增加，产物合成率也随之增加［１０］。但循环次数
过多，非特异性产物合成率也会随之增加［１６］。退火温
度过低或过高，扩增条带少、强度弱、背景模糊，退火温
度过高还会扩增出非特异性条带。为了提高扩增的特
异性，在扩增效果结果差不多的几个退火温度中，应选
择较高的退火温度作为最佳退火温度［１７］。故本研究
选择５０次为最佳循环次数，最终确定的扩增程序为：
９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，４８～５６℃（不同的
引物，其退火温度不同，根据具体引物而定）退火４５ｓ，
７２℃延伸９０ｓ，以上３个步骤循环５０次；最后７２℃延
伸７ｍｉｎ；４℃保存扩增产物。
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研究报告　　谢伟玲 等：黄枝油杉ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化